胡 莉 江昌照 張 靜 潘紅春 劉 紅

(1. 西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715；2. 重慶藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

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鄰菲羅啉法測定低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物鐵含量及條件優(yōu)化

胡 莉1,2江昌照1,2張 靜1,2潘紅春1,2劉 紅1,2

(1. 西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715；2. 重慶藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

建立鄰菲羅啉法測定低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物鐵含量，并對該方法的試驗(yàn)過程逐一進(jìn)行條件優(yōu)化，以確定最佳檢測條件。消解因素試驗(yàn)顯示酸的種類對消解沒有選擇性，但隨著酸體積分?jǐn)?shù)的增加，加熱溫度和時(shí)間的增大，消解越趨于完全。2 mL以上的鄰菲羅啉顯色劑才能完全絡(luò)合亞鐵離子，且絡(luò)合物可在pH 3～8條件下放置240 min。鐵濃度在1～5 mg/L 時(shí)線性相關(guān)性良好，R2=0.999 9；低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物鐵含量分別為42.04%，40.43%，39.45%；平均回收率以及精密度試驗(yàn)結(jié)果均顯示了該試驗(yàn)方法的精確性。

低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物；分光光度法；鄰菲羅啉；鐵含量

低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物是以低聚異麥芽糖為糖基，三價(jià)鐵(Fe3+)為配糖基，通過絡(luò)合作用而生成的一種穩(wěn)定多糖鐵復(fù)合物[1]。低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物集中了兩單體功能，具有其獨(dú)特的優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于各行業(yè)，特別是作為食品添加劑，可以顯著增加食品的營養(yǎng)價(jià)值。穩(wěn)定絡(luò)合的三價(jià)鐵，不以游離狀態(tài)存在，減少了對胃腸道的刺激作用，當(dāng)進(jìn)入生物體后，低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物被破壞，一方面Fe3+被還原成二價(jià)鐵(Fe2+)而快速吸收，另一方面釋放的低聚異麥芽糖是胃腸道微生物生長不易利用的糖[2-3]，但可以被腸道益生菌吸收利用，從而可以調(diào)節(jié)消化道微生物區(qū)系[4-5]，提高免疫力[6]，保護(hù)肝臟[7]，降低血脂和膽固醇[8]，預(yù)防鋸齒[9]等等。

鐵元素是這種復(fù)合物的活性成分，鐵含量為其重要的表征指標(biāo)之一。目前，2015年版中國藥典采用碘量法測定右旋糖酐鐵配合物的鐵含量，但是此碘量法并不適用于低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物，鐵含量測定結(jié)果明顯偏小。而測定多糖鐵復(fù)合物鐵含量的其他方法(如鄰菲羅啉法、原子吸收光譜法、磺基水楊酸分光光度法、高效液相色譜法、等離子發(fā)射光譜法等)中，鄰菲羅啉法具有簡便、準(zhǔn)確和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。如鄰菲羅啉法被李玉賢等[10]用來測定百合多糖鐵復(fù)合物的鐵含量；被李明靜等[11]用來表征懷山藥多糖鐵Ⅲ復(fù)合物的鐵含量；被何丹鴻等[12]應(yīng)用于多糖鐵復(fù)合物微丸中鐵離子的含量測定；以及鄧芬等[13]的厚樸葉多糖鐵復(fù)合物和趙文陽等[14]的刺梨多糖鐵Ⅲ配合物的鐵含量測定。但是針對不同的物質(zhì)，特別是復(fù)合物，一方面鐵與其它成分的作用方式和空間位阻的差異導(dǎo)致鐵離子釋放難易程度不同；另一方面微環(huán)境的差異對鄰菲羅啉有色絡(luò)合物的穩(wěn)定性有一定影響。以往的研究[15]也對波長、緩沖溶液的用量、顯色時(shí)間、顯色劑的用量，以及還原劑等進(jìn)行選擇的，但是對影響因素進(jìn)行全面系統(tǒng)分析卻不是很多，并且不同的物質(zhì)介紹的操作方法也不盡相同。值得重視的是針對此方法測具體物質(zhì)鐵含量時(shí)，最佳適用條件也是有差異的，所以本試驗(yàn)建立鄰菲羅啉法測低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物這種新復(fù)合物的鐵含量，開展消解單因素試驗(yàn)，顯色單因素試驗(yàn)等，探究鄰菲羅啉法對低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物的最佳適用條件，不僅有利于準(zhǔn)確測定低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物的鐵含量，還可以為鄰菲羅啉法測定其他多糖鐵配合物方法學(xué)優(yōu)化提供一定的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料與試劑

低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物：參照文獻(xiàn)[1]制備；

試驗(yàn)用水：超純水，用LH75G-4型超純水機(jī)制備；

六水硫酸亞鐵銨、三水乙酸鈉、抗壞血酸、1，10-菲羅啉、氫氧化鈉、碳酸鈉、碘化鉀、硫代硫酸鈉、可溶性淀粉：分析純，成都市科龍?jiān)噭┗S；

硫酸、鹽酸、硝酸、高錳酸鉀：分析純，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外分光光度計(jì)：UV-1800型，上海美譜達(dá)儀器有限公司；

電子天平：EL104型，梅特勒—托利多(上海)有限公司；

pH計(jì)：FE-20K型，梅特勒—托利多(上海)有限公司；

水浴箱：XMTD-6000型，余姚市金電儀表有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取六水硫酸亞鐵胺0.070 23 g于燒杯中, 加入20 mL超純水和1 mL鹽酸攪拌至完全溶解，移入100 mL容量瓶中，蒸餾水定容搖勻，得Fe2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 g/L 的亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 最大吸收波長選擇 精密吸取2.0 mL硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 mL容量瓶中，再按照鄰菲羅啉法步驟分別加入抗壞血酸溶液5 mL，乙酸鈉溶液5 mL和鄰菲羅啉顯色液3 mL，蒸餾水定容，放置15 min，在分光光度計(jì)上，波長420～570 nm內(nèi)每隔10 nm掃描，最大吸收波長處每隔0.5 nm掃描得出吸收光譜。

1.2.3 消解因素試驗(yàn) 采用鄰菲羅啉法。精密稱取0.01 g低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物粉末，用酸消解法破壞，使鐵離子(Fe3+)游離，蒸餾水定容于100 mL容量瓶，得樣品供試液。然后吸取適量樣品供試液于50 mL容量瓶中，加入抗壞血酸(10 g/L)5 mL，F(xiàn)e3+還原成亞鐵離子(Fe2+)，再用乙酸鈉(1 mol/L)、鹽酸(1 mol/L)或者氫氧化鈉(1 mol/L)調(diào)節(jié)pH，然后加入適量鄰菲羅啉顯色液(1 g/L)與Fe2+反應(yīng)得橙紅色絡(luò)合物，蒸餾水定容搖勻，在一定的溫度下放置一定時(shí)間，最后在最大波長處以不加樣品供試液為參比溶液測定吸光度值。

首先，分別用濃鹽酸、濃硫酸和濃硝酸5.0 mL消解樣品，其他條件不變，考察酸種類對消解的影響。然后，分別用濃鹽酸、50 mL/100 mL鹽酸和10 mL/100 mL鹽酸5.0 mL消解樣品，其他條件不變，考察酸體積分?jǐn)?shù)對消解的影響，并將上述樣品于70 ℃加熱10 min，其他條件不變，考察加熱對消解的影響。其次，加5.0 mL 10 mL/100 mL鹽酸到樣品中，其他條件不變，分別于 50，55，60，65，70，75 ℃加熱10 min進(jìn)行消解溫度試驗(yàn)；分別于 70 ℃加熱2，3，4，5，6 min進(jìn)行消解時(shí)間試驗(yàn)。最后得各樣品供試液，吸取2.0 mL，按照鄰菲羅啉法步驟測定吸光度值，平行3次。

1.2.4 顯色單因素試驗(yàn)

(1) 顯色劑用量對顯色的影響：將試驗(yàn)條件固定為顯色pH 6.0，顯色溫度35 ℃，顯色時(shí)間20 min，分別調(diào)整顯色劑用量為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，測定其最大吸收波長處吸光度值。

(2) pH對顯色的影響：將試驗(yàn)條件固定為顯色劑用量3.0 mL，顯色溫度35 ℃，顯色時(shí)間20 min，分別調(diào)整顯色pH為1.0，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，11.0，測定其最大吸收波長處吸光度值。

(3) 溫度對顯色的影響：將試驗(yàn)條件固定為顯色pH 6.0，顯色劑用量3.0 mL，顯色時(shí)間20 min，分別調(diào)整顯色溫度為5，20，35，50，65 ℃，測定其最大吸收波長處吸光度值。

(4) 時(shí)間對顯色的影響：將試驗(yàn)條件固定為顯色pH 6.0，顯色溫度35 ℃，顯色劑用量3.0 mL，分別調(diào)整顯色時(shí)間為0，20，40，60，120，240 min，測定其最大吸收波長處吸光度值。1.2.5 方法驗(yàn)證

(1) 加樣回收率：分別定量吸取Fe2+標(biāo)準(zhǔn)供試液和樣品供試液(見表1)于 50 mL容量瓶中，按鄰菲羅啉法測定吸光度值，計(jì)算樣品回收率，RSD值。

(2) 精密度試驗(yàn)：甲精密吸取2.0 mL樣品供試液，鄰菲羅啉法平行試驗(yàn)6次，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)；乙用同一批樣品各平行試驗(yàn)6次，進(jìn)行中間精密度試驗(yàn)；甲乙丙分別在實(shí)驗(yàn)室A、B、C用同一批樣品分別平行試驗(yàn)3次，進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)。

(3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別精密取Fe2+標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL于50 mL容量瓶中，按照鄰菲羅啉法步驟測定吸光度值，以Fe2+的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。然后分別精密取Fe2+標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0 mL測定吸光度值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線測定鐵含量與理論鐵含量進(jìn)行對比。

1.2.6 鐵含量測定

(1) 與中國藥典法測定結(jié)果的比較：參照2015版《中國藥典》中右旋糖酐鐵配合物的鐵含量測定方法[16]和本試驗(yàn)建立的鄰菲羅啉法，以及先用后者鄰菲羅啉法配合物消解方法處理樣品，然后用前者《中國藥典》法分別測定批號為20160101、20160315的樣品鐵含量。

(2) 樣品鐵含量測定：取批號分別為20140712、20150320和20150511的低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物樣品，按照鄰菲羅啉法測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鐵的含量。

(3) 鐵含量的計(jì)算：按式(1)進(jìn)行。

(1)

式中：

W——樣品鐵含量，%；

m1——樣品中鐵的質(zhì)量，g；

m2——樣品的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長選擇

如圖1所示，在 510 nm 時(shí)有最大吸光度，因此后面試驗(yàn)采用的波長均為510 nm。

圖1 低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物的吸收光譜

Figure 1 The absorption spectrum isomaltooligosaccharide-iron (Ⅲ) complex

2.2 消解因素試驗(yàn)

酸消解是鐵含量測定的第一步，也是最重要的一步，低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物消解的難易程度和完全程度間接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。由圖2可知，HCl、H2SO4和HNO3對低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物的消解結(jié)果相同，為方便后續(xù)試驗(yàn)均選用鹽酸消解；隨著鹽酸的體積分?jǐn)?shù)增大，消解越完全，但是相同程度地輔助加熱后，吸光度都有所增加并且最大值基本一致，表明加熱促進(jìn)消解，長時(shí)間高溫加熱利于消解。

由于濃鹽酸具有腐蝕性，為了安全高效，所以試驗(yàn)均選擇用10 mL/100 mL鹽酸70 ℃輔助加熱消解5 min。

2.3 顯色單因素試驗(yàn)

2.3.1 顯色劑用量對顯色的影響 鄰菲羅啉顯色劑用量是影響鐵含量測定的另一重要因素。由圖3(a)可知，當(dāng)鐵離子處于完全游離狀態(tài)后，與大于2 mL的鄰菲羅啉顯色劑(1 g/L)完全生成橙紅色絡(luò)合物，才能準(zhǔn)確測定鐵含量。根據(jù)節(jié)約原則試驗(yàn)選擇每次加入3 mL鄰菲羅啉顯色劑。

2.3.2 pH對顯色的影響 生成的橙紅色絡(luò)合物保持其穩(wěn)定性，是準(zhǔn)確測定鐵含量的關(guān)鍵。試驗(yàn)考察了常見的3個因素對其穩(wěn)定性的影響。由圖3(a)可知，pH為3～11時(shí)，吸光度值基本一致；pH為11時(shí)吸光度值略微有下降趨勢，表明絡(luò)合物在更堿性的環(huán)境下開始不穩(wěn)定；而pH為1，2時(shí)吸光度值明顯偏小，鄰菲羅啉絡(luò)合物極不穩(wěn)定。而本試驗(yàn)選擇每次加入乙酸鈉(1 mol/L)5 mL調(diào)節(jié)的pH為5.6～5.8，可以確保鄰菲羅啉和Fe2+穩(wěn)定絡(luò)合。

圖2 各因素對低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物消解的影響

Figure 2 Effect of factors on digestion of isomaltooligosaccharide-iron (Ⅲ) complex

2.3.3 溫度對顯色的影響 由圖3(b)可知，隨著溫度的升高，吸光度值下降，表明試驗(yàn)受溫度影響很大且低溫利于顯色。但低溫的試驗(yàn)條件難控制，為了兼顧操作和試驗(yàn)準(zhǔn)確性，控制在25 ℃環(huán)境中顯色。

2.3.4 時(shí)間對顯色的影響 由圖3(b)可知，0～240 min時(shí)吸光度值沒有明顯差異，表明鄰菲羅啉絡(luò)合物放置240 min也能保持良好的穩(wěn)定性，為了試驗(yàn)方便，本試驗(yàn)選擇放置10 min 后測定吸光度值。

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 加樣回收率 由表1可知，平均加樣回收率為99.55%，RSD為0.57%，小于2%，說明方法的準(zhǔn)確度良好。

圖3 各因素對鄰菲羅啉顯色的影響

編號Fe2+標(biāo)準(zhǔn)供試液/mL樣品供試液/mLFe2+標(biāo)準(zhǔn)加入量/(mg·L-1)Fe2+實(shí)際回收量/(mg·L-1)樣品回收率/%平均回收率/%RSD/%10.51.01.00.997599.7520.51.51.01.0024100.2430.52.01.00.992699.2641.00.52.01.995299.7651.01.02.01.985299.2661.01.52.01.995099.7571.50.53.02.992599.7581.51.03.02.948498.2891.51.53.02.997699.9299.550.57

2.4.2 精密度試驗(yàn) 由表2可知，操作人員甲的RSD為0.54%，操作人員乙的RSD為0.40%，表明方法的重復(fù)性好；甲乙12組數(shù)據(jù)的RSD為0.58%，表明中間精密度高，符合分析要求。表3顯示RSD為1.36%，重現(xiàn)性好，符合分析要求。

表2 重復(fù)性和中間精密度試驗(yàn)結(jié)果

表3 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 由圖4可知，鐵含量在6 mg/L以下的低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物可以直接準(zhǔn)確測定，根據(jù)試驗(yàn)所測數(shù)據(jù)得到線性回歸方程：Y=0.203 5X-0.003 7，R2=0.999 9。表明鐵濃度在1～5 mg/L時(shí)線性相關(guān)性良好。

2.5 鐵含量測定

2.5.1 與中國藥典法測定結(jié)果的比較 由表4可知，鄰菲羅啉法所測鐵含量明顯高于2015版《中國藥典》規(guī)定的碘量法，且與兩種方法的組合法的試驗(yàn)結(jié)果相當(dāng)。說明本試驗(yàn)所建立的方法對低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物的鐵含量測定結(jié)果可靠。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品批號鐵含量/%藥典法本試驗(yàn)建立的方法鄰菲羅啉法RSD36.5640.2340.342016010136.9840.9841.220.89～1.1837.2141.0241.1235.1439.7739.652016031534.3438.5338.771.46～1.9134.1138.4438.58

2.5.2 樣品鐵含量測定 由表5可知，3批不同的樣品鐵含量分別為42.04%，40.43%，39.45%，RSD分別為 0.49%，0.61%，0.55%，說明此方法的試驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

表5 樣品鐵含量測定結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立的鄰菲羅啉法測定低聚異麥芽糖鐵Ⅲ配合物鐵含量的方法較藥典規(guī)定的碘量法操作簡單、快速、準(zhǔn)確，并且通過一系列的優(yōu)化試驗(yàn)，確立了最佳適應(yīng)條件，使其鐵含量測定結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。本試驗(yàn)的研究方法還為其他類似的多糖鐵配合物的含量測定提供了一定的參考價(jià)值；也為市場上的含鐵食品、保健品、藥品等的鐵含量測定提供了一種簡便有效的方法；也可為鄰菲羅啉法應(yīng)用于其他化合物的方法學(xué)優(yōu)化提供指導(dǎo)。試驗(yàn)的不足之處在于建立的鄰菲羅啉法并不能適用于所有多糖鐵復(fù)合物；進(jìn)一步研究可以從增加消解多糖鐵復(fù)合的強(qiáng)度和增強(qiáng)鄰菲羅啉絡(luò)合物的穩(wěn)定性兩方面著手。

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Spectrophotometric iron (Ⅲ) determination and optimizing of isomaltooligosaccharide-iron complex using phenanthroline

HULi1,2JIANGChang-zhao1,2ZHANGJing1,2PANHong-chun1,2LIUHong1,2

(1.CollegeofPharmaceuticalSciences,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China;2.ChongqingEngineeringResearchCenterforPharmaceuticalProcessandQualityControl,Chongqing400715,China)

In this study，the detection approach was established for spectrophotometric determination of iron (Ⅲ), existing in the form of isomaltooligosaccharide-iron (Ⅲ) complex. The method was optimized by operating experiments considering the factors of the process. Several factors effected on isomaltooligosaccharide-iron (Ⅲ) complex digestion, including the volume fraction of acid, the heating temperature and time, and this approach yielded to accurate results except the kinds of acid. The digestion was positively correlated with the acid volume fraction, heating temperature and time. It was found that over 2 mL phenanthroline solution was demanded and that the complexation could maintain stability within pH 3-8 at 240 min. Good linear correlation personated in 1-5 mg/L of iron concentration,R2=0.999 9. Iron contents of isomaltooligosaccharide-iron (Ⅲ) complex were 42.04%, 40.43% and 39.45% respectively. Therefore, a simple, rapid, sensitive and selective assay for iron (III) determination was proposed successfully by the results of average recovery and precision of the experiments.

isomaltooligosaccharide-iron (Ⅲ) complex; spectrophotometry; phenanthroline; content of iron (III)

重慶市制藥過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心能力提升項(xiàng)目(編號：CSTC2012gg-yyjsb10002-33)；西南大學(xué)博士基金項(xiàng)目(編號：SWU110056)；西南大學(xué)博士基金項(xiàng)目(編號：SWU110057)

胡莉，女，西南大學(xué)在讀碩士研究生。

劉紅(1965—)，男，西南大學(xué)教授。

E-mail：lhphch@126.com

2016—07—05

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.10.011