劉 鑫 胡皆樂 李 佑 劉 坤 蔣奕玫 羅秀芳 趙 任

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FOXO3在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義

劉 鑫 胡皆樂 李 佑 劉 坤 蔣奕玫 羅秀芳 趙 任

目的 探討叉頭框蛋白O3(forkhead box class O3，F(xiàn)OXO3)在結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)組織中的表達及其臨床意義。方法 選擇手術(shù)切除的結(jié)直腸癌標本100份，采用實時定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測結(jié)直腸癌組織及相應正常癌旁組織中FOXO3基因mRNA水平表達，采用蛋白免疫印跡法(Western blot，WB)檢測上述患者FOXO3蛋白的表達，采用免疫組織化學方法(immunohistochemistry，IHC)檢測腸癌組織樣本與正常腸粘膜組織FOXO3蛋白的表達。結(jié)果 腸癌腫瘤組織中FOXO3 mRNA、蛋白表達水平顯著低于遠端癌旁組織(P<0.05)；FOXO3陰性組生存率較FOXO3陽性組和FOXO3強陽性組生存率顯著降低(P<0.05)；FOXO3強陽性組與FOXO3陽性組生存率比較無明顯差異(P>0.05)；FOXO3表達與腫瘤分化(χ2=32.7468，P=1.05e-08)、浸潤深度(χ2=4.0921，P=0.04308)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=5.7301，P=0.01668)、TNM分期(χ2=9.2374，P=0.01451)及組織學分類(χ2=8.5963，P=0.01359)密切相關(guān)。結(jié)論 FOXO3表達可能與結(jié)直腸癌的腫瘤分化、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和組織學分類有關(guān)。FOXO3表達可能成為判定結(jié)直腸癌嚴重程度及預后效果的預測因子。

結(jié)直腸癌；免疫組織化學；FOXO3；RT-qPCR；Western Blot

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1773～1777)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是消化道常見的惡性腫瘤之一[1-4]，隨著我國人民生活質(zhì)量的不斷提高以及飲食習慣的改變，結(jié)直腸癌已成為近年來發(fā)病率增長最快的腫瘤之一，現(xiàn)已成為我國發(fā)病率第三、病死率第五的惡性腫瘤[5]。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是1個長期多因素、多階段參與的復雜過程[2-3]，其詳細病因及發(fā)病機制尚不明確。Forkhead轉(zhuǎn)錄因子是2000年才正式統(tǒng)一命名的新轉(zhuǎn)錄因子家族[6]，其中研究最深入的是O亞家族(FOXO)。叉頭框蛋白O3(forkhead box class O3，F(xiàn)OXO3)是FOXO亞家族的重要成員，研究表明FOXO3在肝癌、肺癌、胃癌、原發(fā)性乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達降低，與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，已成為近年來研究的熱點[7-9]。Bullock等[10]于2013年對FOXO3在結(jié)直腸癌中的表達和臨床意義進行了探究。Bullock等的研究病例樣本為歐羅巴人種，由于人種的差異，可能其中的某些結(jié)果不能很好的反映中國人的情況。

綜上，為深入研究FOXO3在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，本研究選擇手術(shù)切除的結(jié)直腸癌標本100份，采用RT-qPCR、Western Blot、免疫組織化學等方法檢測了結(jié)腸癌腫瘤組織和相應癌旁正常組織中FOXO3在mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平，同時通過對腸癌患者進行為期3年的隨訪，結(jié)合病人癌組織中FOXO3的表達進行分組并統(tǒng)計其生存率，并采用計數(shù)資料列聯(lián)表的相關(guān)分析法分析FOXO3表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標本及醫(yī)療數(shù)據(jù)收集

收集上海交通大學附屬瑞金醫(yī)院2008至2011年經(jīng)手術(shù)切除的結(jié)直腸癌凍存組織100例及相應正常腸黏膜凍存組織(距腫瘤組織5 cm以上)100例，收集整理該100例患者3年的隨訪記錄，用于生存率分析。所有病例臨床及病理資料完整，其中男性65例，女性35例；≤60歲患者38例，>60歲患者62例；腫瘤直徑≤5 cm的病例43例，>5 cm的病例57例；腫瘤高分化31例(男性15例、女性16例)，腫瘤中分化程度37例(男性18例、女性19例)，低分化32例(男性27例，女性5例)；腫瘤浸潤程度低(T1～2)52例，浸潤程度高(T3～4)48例；淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移56例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例；TNM Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分期患者分別為23例、33例、30例、14例；組織學分類:腺癌、粘液癌、未分化癌患者分別為68例、22例和10例。所有患者術(shù)前均未進行放療、化療以及其他針對腫瘤的特殊治療，術(shù)后病理檢查均經(jīng)兩位病理醫(yī)師診斷。

按照患者腫瘤分化程度及性別，從31例腫瘤高分化患者中隨機選取2例(男女各1例)，37例中分化患者中隨機選取2例(男女各1例)，32例低分化患者中隨機選取1例(男性)，分別記為C1、N1、C2、N2、C3、N3、C4、N4、C5、N5(其中C代表癌癥組織，N代表癌旁正常組織)。

1.2 主要試劑

兔抗人FOXO3多克隆抗體和EnVisionⅢ加強型試劑盒購于Thermo Fisher Scientific公司。RT-qPCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

1.3 RT-qPCR法測定CRC組織和相應癌旁正常組織中FOXO3 mRNA的表達水平

采用RT-qPCR法測定五個樣本中CRC組織及癌旁正常組織中FOXO3 mRNA的表達水平，每個樣品設置5個平行重復。

①根據(jù)文獻，應用primer premier 6.0軟件設計引物FOXO3：上游引物，5'-AAGCCAGCTACCTTCTCTTCCA-3'；下游引物，5'-GTGGCTAAGTGAGTCCGAAGTGA-3'。②采用異硫氰胍一步法快速提取總RNA。③根據(jù)寶生物公司RT-qPCR試劑盒說明書操作，瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像分析系統(tǒng)及灰度分析軟件測平均灰度值，以β-actin為內(nèi)參照。

1.4 Western Blot法檢測CRC組織和相應癌旁正常組織中FOXO3蛋白表達水平

采用Western Blot檢測CRC組織和相應癌旁正常組織中FOXO3蛋白表達水平。裂解各樣本細胞提取總蛋白，按每個泳道20 μg進行十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳，采用Bio-Red標準濕式轉(zhuǎn)膜裝置轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜電流300 mA，轉(zhuǎn)膜時間為90 min；加入5%脫脂奶粉封閉液，室溫搖床封閉1 h后加入FOXO3及β-actin鼠抗單克隆一抗，4 ℃孵化過夜；洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的單克隆鼠抗，1∶4000稀釋，室溫孵化1 h；洗膜后使用增強化學發(fā)光試劑及凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描，采用Image J圖像分析軟件對FOXO3蛋白表達進行分析，以目的條帶吸光度與β-actin條帶吸光度比值作為各目的條帶的相對表達水平。

1.5 免疫組織化學測定FOXO3在CRC組織和相應癌旁正常組織中表達情況

采用EnVisionTM二步法，分別測定100份CRC組織及相應正常癌旁組織中FOXO3蛋白表達。各樣本石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，以依地酸為抗原修復液進行微波抗原修復，3%過氧化氫溶液常溫孵育15 min，滴加一抗(兔抗人FOXO3單克隆抗體，濃度1∶50)，4 ℃過夜后滴加二抗(EnVisionⅢ加強型試劑盒)，室溫孵育2 h，DAB顯色，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。

本實驗中所有免疫組織化學染色結(jié)果均采用雙盲法閱片，由兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師分別作出判斷。FOXO3蛋白免疫組化以細胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，每張切片于400倍光鏡下隨機取5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，根據(jù)每個視野中陽性細胞數(shù)百分比和染色強弱進行評分。鏡下觀察腫瘤實質(zhì)細胞著色強度：0分，細胞無著色；1分，陽性細胞數(shù)染色呈淡棕色；2分，陽性細胞染色呈棕色；3分陽性細胞染色呈棕褐色。著色廣度：0分，陽性細胞數(shù)比率<1 %；1分，陽性細胞數(shù)比率2%～25%；2分，陽性細胞數(shù)比率26%～50%；3分，陽性細胞數(shù)比率51%～75%；4分，陽性細胞數(shù)比率>75%。然后判定各標本的染色得分。著色總分(0-12)：廣度強度；總分分級：0～4分視為0級，為陰性表達(FOXO3+/-)；5～8分視為I級，為陽性表達(FOXO3+/+)；9～12分視為Ⅱ級，為強陽性表達(FOXO3+++-++++)。

1.6 結(jié)直腸癌患者生存率分析

對100例接受手術(shù)的結(jié)直腸癌患者進行為期3年的隨訪，按照免疫組織化學結(jié)果，將100例患者分為三組(FOXO3陰性組、FOXO3陽性組和FOXO3強陽性組)，每組分別根據(jù)不同時間下患者的存活數(shù)目繪制結(jié)直腸癌患者的生存率圖。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 CRC組織和相應癌旁正常組織中FOXO3 mRNA表達水平(圖1)

CRC組織和相應癌旁正常組織中FOXO3mRNA相對表達水平見圖1，隨機選取的5例CRC腫瘤組織中FOXO3表達水平顯著低于相應癌旁正常組織的(P<0.05)。

圖1 CRC組織和相應癌旁正常組織中FOXO3 mRNA的表達水平

2.2 CRC組織和相應癌旁正常組織中FOXO3蛋白表達水平

在CRC組織和相應癌旁正常組織中FOXO3蛋白相對表達水平見圖2，由灰度圖和相對表達量柱狀圖可知，與癌旁正常組織相比，隨機選取的5例CRC患者腫瘤組織中FOXO3蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)。

圖2 CRC組織和相應癌旁正常組織中FOXO3蛋白表達水平

2.3 免疫組織化學結(jié)果

對100例CRC組織及相應癌旁正常組織進行免疫組化染色。FOXO3蛋白陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，定位于細胞核。經(jīng)雙盲法閱片，根據(jù)每個視野中陽性細胞數(shù)百分比和染色強弱進行評分并比較其陽性率，統(tǒng)計結(jié)果表明，CRC組織中FOXO3蛋白表達陽性率顯著低于正常粘膜組織(P<0.01)。

2.4 3年生存率

FOXO3不同表達水平組3年生存率見圖3，F(xiàn)OXO3陰性組患者的3年生存率顯著低于FOXO3陽性組和FOXO3強陽性組(P<0.01)，而FOXO3陽性組和FOXO3強陽性組3年生存率比較無顯著性差異(P>0.05)。

圖3 FOXO3不同表達水平組3年生存率比較

2.5 FOX03蛋白表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

FOXO3蛋白表達(FOXO3強陽性組和FOXO3陰性組)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系見表1，結(jié)果顯示，F(xiàn)OXO3蛋白表達與患者性別、年齡及腫瘤直徑無顯著相關(guān)性，與腫瘤分化、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及組織學分類密切相關(guān)。

表1 FOXO3蛋白表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系/例

3 討論

近年來，隨著人民生活水平的不斷提高，飲食習慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變以及人口老齡化，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均保持上升趨勢，深入研究其關(guān)鍵分子機制為新藥開發(fā)和臨床治療具有極大的社會價值和現(xiàn)實意義。FOXO轉(zhuǎn)錄因子是Forkhead蛋白大家族的一個亞群，從蠕蟲到人均有表達。FOXO家族的轉(zhuǎn)錄因子穿梭于細胞核內(nèi)外，在代謝、細胞增殖、氧化應激、凋亡、分化和老化中發(fā)揮重要作用，多個研究表明其可作為腫瘤治療靶點之一[11]。FOXO3是FOXO亞家族中的重要成員，其磷酸化失活及亞細胞定位與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。研究表明，F(xiàn)OXO3表達缺失在甲狀腺癌[12]、卵巢癌[13]、乳腺癌[14]、尿路上皮癌[15]等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)，且與患者預后密切相關(guān)。深入研究FOXO3在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的分子機制，對研制分子靶向治療藥物、制定臨床治療策略具有重要意思。鑒于結(jié)直腸癌嚴峻的上升趨勢以及FOXO3在其他癌癥中的重要作用，本研究收集整理了100例結(jié)直腸癌患者的腫瘤及癌旁正常組織標本、臨床病理數(shù)據(jù)和隨訪記錄，探究FOXO3在結(jié)直腸癌中的表達情況以及FOXO3的表達與臨床病理特征的關(guān)系，即FOXO3在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮的作用。設計了一系列實驗，包括：FOXO3在CRC組織和癌旁正常粘膜組織中mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達，F(xiàn)OXO3表達高低對結(jié)直腸癌病人生存率的影響，F(xiàn)OXO3表達與臨床病理特征相關(guān)性的分析等。

RT-qPCR實驗結(jié)果、Western Blot實驗結(jié)果均表明，F(xiàn)OXO3 mRNA、蛋白在CRC腫瘤組織中表達顯著低于正常組織，同時也表明FOXO3蛋白在CRC組織低表達極有可能是在發(fā)生在轉(zhuǎn)錄過程中，F(xiàn)OXO3發(fā)生低表達的原因可能與基因組的表達調(diào)控有關(guān)。FOXO3低表達是否在翻譯水平受到影響還需要進一步的實驗進行驗證，相關(guān)研究仍在進行。對腫瘤組織和正常癌旁組織的免疫組織化學分析也可以得出FOXO3在腫瘤組織中發(fā)生了低表達，也與RT-qPCR實驗結(jié)果、Western Blot實驗結(jié)果相類似，同時也進一步印證了FOXO3在結(jié)直腸組織中的抑癌作用。

對腫瘤組織免疫組織化學切片觀察及評分，將腫瘤患者分為3組(FOXO3陰性表達組、FOXO3陽性表達組和FOXO3強陽性表達組)，結(jié)合3年間患者隨訪數(shù)據(jù)，本研究分析了3個分組患者的生存率，結(jié)果表明FOXO3陰性表達組患者的生存率顯著低于其它兩組患者，但FOXO3強陽性表達組患者生存率與FOXO3陽性表達組患者的生存率無顯著差異。該結(jié)果暗示FOXO3蛋白陽性表達可提高結(jié)腸癌患者的生存率，但當FOXO3的表達量提高至一定水平后，繼續(xù)升高FOXO3的表達量對結(jié)腸癌患者生存率無顯著性影響。該結(jié)果可為靶向FOXO3治療手段相關(guān)研究提供參考，即在用藥時需注意FOXO3蛋白濃度調(diào)控。

本研究中，我們也對FOXO3蛋白與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性進行了探究，結(jié)果表明FOXO3蛋白的表達與病人性別、年齡及腫瘤直徑無顯著相關(guān)性，但與腫瘤分化、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及組織學分類密切相關(guān)，暗示FOXO3在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中產(chǎn)生了重要影響，相關(guān)結(jié)論可能為靶向FOXO3治療結(jié)直腸癌提供一定理論指導。

總之，F(xiàn)OXO3在結(jié)直腸癌中的表達顯著下調(diào)，其表達與結(jié)直腸癌的腫瘤分化、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和組織學分類有關(guān)，F(xiàn)OXO3的表達下調(diào)可能在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，F(xiàn)OXO3可能為臨床結(jié)直腸癌基因治療提供新的基因靶點。FOXO3可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，此結(jié)論鮮見報道，尚需擴大研究范圍進一步研究證實。

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(編輯：吳小紅)

Expression and Clinical Significance of FOXO3 in Colorectal Carcinoma

LIUXin，HUJiele，LIYou，etal.

RuijinHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine，Shanghai,200025

Objective To investigate the expression and clinical significance of FOXO3(forkhead box class O3) in colorectal carcinoma.Methods 100 cases of colorectal cancer treated with surgical resection were selected,FOXO3 mRNA expression of colorectal cancer and normal tissues were detected using real-time quantitative PCR (Real-time quantitative PCR,RT-qPCR),FOXO3 protein expression was detected by western blot,Immunohistochemical method (Immunohistochemistry,IHC) was used to detect FOXO3 protein expression in human colorectal carcinoma and normal tissues.Results As compared with normal colorectal mucosa tissues,FOXO3 expression in colorectal cancer tissues obviously decreased(P<0.05) both at mRNA and protein levels.The survival rate of FOXO3 negative group significantly decreased (P<0.05) compared with the other 2 groups,and that of FOXO3 positive group and FOXO3 strongly positive group have no significant difference(P>0.05).The expression of FOXO3 in colorectal cancer was significantly correlated with tumor differentiation(χ2=32.7468，P=1.05e-08)、depth of tumor invasion(χ2=4.0921，P=0.04308)、metastasis of lymph node(χ2=5.7301，P=0.01668)、TNM stage(χ2=9.2374，P=0.01451，P=0.01451)and tumor histological differentiation(χ2=8.5963，P=0.01359).Conclusion The expression of FOXO3 may be closely related with differentiation,depth of tumor invasion,metastasis of lymph node,TNM stage,and histological differentiation of colorectal cancer,and it may be an important indicator to evaluate the malignant degree and prognosis of the colorectal cancer.

Colorectal cancer；Immunohistochemistry；FOXO3；RT-qPCR；Western Blot

200025 上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院(劉 鑫，趙

任)；201801 上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院北院(胡皆樂，李 佑，劉 坤，蔣奕玫，羅秀芳)

趙 任

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.11.010

R735.3+7

A

1001-5930(2016)11-1773-05

2015-12-02

2016-06-01)