王 燕 于 洋 李 擎 晉 鑫 曹成松

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miRNA-29在正常乳腺、原發(fā)性乳腺癌及轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中的表達(dá)意義

王 燕 于 洋 李 擎 晉 鑫 曹成松

目的 探討微小RNA-29(miRNA-29)在正常乳腺、原發(fā)性乳腺癌以及轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中的表達(dá)，并分析miRNA-29、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)在疾病發(fā)生與進(jìn)展中的作用。方法 選取286例乳腺癌患者，其中原發(fā)性乳腺癌205例，轉(zhuǎn)移性乳腺癌81例，同期選取150例無乳腺疾病的健康婦女為對照組。采用RT-PCR檢測miRNA-29與MMP-2表達(dá)水平。結(jié)果 三組乳腺標(biāo)本中miRNA-29與MMP-2水平比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其miRNA-29與MMP-2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，而腫瘤大小、病理分期、HER-2及ki-67均與miRNA-29表達(dá)具有密切相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)論

原發(fā)性乳腺癌；轉(zhuǎn)移性乳腺癌；微小RNA-29；基質(zhì)金屬蛋白酶-2

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1763～1766)

乳腺癌是影響女性生命健康的主要惡性腫瘤疾病之一[1]，流行病學(xué)調(diào)查報道表示近10年來我國乳腺癌發(fā)病率與死亡率均逐年上升[2]。乳腺癌致死常為并發(fā)浸潤、轉(zhuǎn)移等情況所致，但其浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制仍未獲得確切定論，為深入抑制疾病風(fēng)險程度，眾多臨床研究逐漸將目光轉(zhuǎn)向于乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制分析[3]。miRNA對腫瘤組織浸潤轉(zhuǎn)移具有直接影響作用，國外報道已證實miRNA-29同乳腺癌發(fā)病與進(jìn)展具有密切關(guān)聯(lián)[4]，本研究進(jìn)一步分析miRNA-29與乳腺癌患者受體、HER-2、病理分型等相關(guān)性，旨在為疾病治療及預(yù)后評估創(chuàng)造新的思路，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取本院2010年8月至2014年7月收治的乳腺癌患者286例，其中205例為原發(fā)性乳腺癌，81例為轉(zhuǎn)移性乳腺癌，所有患者均通過術(shù)前穿刺病理檢查或術(shù)后病灶組織檢驗獲得確診，且均為女性。同期，選擇150例無乳腺疾病的健康體檢婦女為對照組，近5年內(nèi)無惡性病變史。對照組樣本年齡26～75歲，平均(48.9±14.2)歲。乳腺癌患者年齡29～77歲，平均(49.1±13.8)歲，其中，年齡≥45歲157例，<45歲129例；腫瘤大小≥2.5 cm135例，<2.5 cm者151例；病理分期為Ⅰ～Ⅱ期166例，Ⅲ～Ⅳ期120例；根據(jù)WHO病理分型標(biāo)準(zhǔn)分為浸潤性導(dǎo)管癌282例，浸潤性小葉癌2例，其他2例；雌激素受體(ER)陽性183例，陰性103例；孕激素受體(PR)陽性165例，陰性121例；激素受體(HR)陽性196例，陰性90例；人表皮生長因子受體2(HER-2)陽性55例，陰性231例；轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例，骨轉(zhuǎn)移29例，肺臟轉(zhuǎn)移27例，肝臟轉(zhuǎn)移24例，惡性胸腔積液13例，腦轉(zhuǎn)移2例，骨髓轉(zhuǎn)移1例。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 分別獲取健康女性及乳腺癌患者的正常乳腺上皮組織與乳腺癌新鮮組織，將獲取乳腺組織編號后均勻剖開，一半給予石蠟包埋，常溫下保存待檢；另一半置4 ℃ RNA later(Qiagen公司)24 h，再置于-80 ℃冰箱中保存待檢。

1.2.2 基因檢測 對石蠟包埋組織開展連續(xù)切片處理，厚度為20 μm，各切取5張，常規(guī)進(jìn)行脫蠟并應(yīng)用蛋白酶K處理6 h，再應(yīng)用Trizol 總RNA提取試劑盒(GIBCO BRL公司)完成總RNA提??；新鮮乳腺組織則通過液氮研磨為粉末，再混合Trizol總RNA提取試劑完成總RNA提取。應(yīng)用miRNA熒光定量RT-PCR試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)測定各標(biāo)本中miRNA-29表達(dá)量，以miRNA-29特異性反轉(zhuǎn)錄引物試劑盒開展逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，70 ℃ 5 min，42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min，提取標(biāo)本miRNA-29 cDNA后再應(yīng)用熒光定量PCR儀器完成測定，95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。乳腺癌組織中miRNA-29含量表達(dá)為 2-△△Ct，△△Ct表達(dá)公式為(CtmiRNA-29-Ctu6)各組織-(CtmiRNA-29-Ctu6)正常均值。通過PicTar、TargetScan 4.0等miRNA靶基因預(yù)測軟件進(jìn)行miRNA-29靶基因篩選，均預(yù)測MMP-2為可能的靶基因。

1.2.3 蛋白檢測 應(yīng)用實時定量RT-PCR技術(shù)，根據(jù)RT-PCR試劑盒說明提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄提取cDNA，再擴(kuò)增為MMP-2，正向引物序列為ATTTTCCCCTCGACAGCCTC，反向引物序列為GTCCCAGGCGTAGACCAATA。檢驗條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 45 s，42個循環(huán)，其MMP-2含量表達(dá)應(yīng)用2-△△Ct法分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)收集 分別整理各組標(biāo)本的miRNA-29與MMP-2表達(dá)水平，統(tǒng)計乳腺癌患者的年齡、病理分期與腫瘤大小等基本信息，同時測定患者的ER、PR與HER-2表達(dá)，并判定其增殖指數(shù)(ki-67)。選取切片標(biāo)本應(yīng)用高倍顯微鏡進(jìn)行觀察，以500個細(xì)胞為總計數(shù)，ER與PR測定中細(xì)胞核內(nèi)棕黃色細(xì)胞在10%以上則為陽性，≤10%則為陰性[5]；HER-2測定中癌細(xì)胞細(xì)胞膜完整著色在30%以上為陽性，10%～30%為不確定；ki-67為陽性細(xì)胞占全部腫瘤細(xì)胞的比例[6]，經(jīng)顯微鏡觀察細(xì)胞核內(nèi)棕黃色細(xì)胞數(shù)量，再相應(yīng)計算ki-67值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 三組乳腺標(biāo)本中miRNA-29與MMP-2表達(dá)水平比較

乳腺癌患者的miRNA-29相對表達(dá)水平明顯低于對照組，其MMP-2水平明顯高于對照組，并且轉(zhuǎn)移性乳腺癌樣本中miRNA-29與MMP-2表達(dá)水平與原發(fā)性乳腺癌樣本比較存在顯著差異，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 三組乳腺標(biāo)本中miRNA-29與MMP-2表達(dá)水平比較

2.2 乳腺癌患者miRNA-29、MMP-2表達(dá)與其臨床資料的相關(guān)性

乳腺癌患者的miRNA-29和MMP-2表達(dá)水平與患者年齡、ER及PR無明顯相關(guān)性，但與腫瘤大小、病理分期、HER-2及ki-67具有密切相關(guān)性，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。乳腺癌患者miRNA-29與MMP-2的Spearman等級相關(guān)性分析，γ=-0.470，P=0.018，表明乳腺癌患者中miRNA-29表達(dá)與MMP-2表達(dá)存在負(fù)相關(guān)性，見表2。

3 討論

乳腺癌是危害女性生命健康的常見惡性疾病之一[7]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為其臨床危害與病灶組織浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8]，而惡性組織浸潤與轉(zhuǎn)移等機(jī)制較為復(fù)雜，進(jìn)而深入了解增殖凋亡相關(guān)基因蛋白對抑制病情進(jìn)展以及揭示疾病發(fā)生機(jī)制均具有重要作用[9]。miRNA是臨床最新發(fā)現(xiàn)的廣泛分布于真核生物中的內(nèi)源性非蛋白編碼單鏈小分子RNA[10-11]，其通常均包含20～25個核苷酸[12]，且多數(shù)基因類型均可影響惡性腫瘤組織的浸潤與轉(zhuǎn)移[13]。miRNA-29為21世紀(jì)初國外學(xué)者Lagos-Quintana等[14]首次發(fā)現(xiàn)，家族共包含miRNA-29a、miRNA-29b與miRNA-29c，其基因在多種惡性腫瘤疾病中均具有顯著影響作用。細(xì)胞內(nèi)分布調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控均可影響miRNA-29表達(dá)，在腫瘤組織不同程度與時機(jī)下其表達(dá)存在明顯差異。眾多國外研究均表示miRNA-29對乳腺癌發(fā)生與進(jìn)展具有顯著作用，Wang等[15]報道指出乳腺癌患者發(fā)生病灶轉(zhuǎn)移后其miRNA-29水平會明顯變化，Limame等[16]則提出乳腺癌患者miRNA-29水平與其HER-2表達(dá)密切相關(guān)，但國內(nèi)學(xué)者對于乳腺癌患者miRNA-29表達(dá)的研究相對匱乏，仍無報道明確表示miRNA-29在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的重要成員，它能通過降解基底膜中的主要成分Ⅳ型膠原和細(xì)胞外基質(zhì)，在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。Katunia等[17]通過臨床試驗證實侵潤性或轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的MMP-2水平明顯高于非浸潤性與無病灶轉(zhuǎn)移患者，國內(nèi)學(xué)者劉輝等[18]也證實MMP-2表達(dá)與乳腺癌發(fā)生、腫瘤范圍擴(kuò)大以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等具有密切關(guān)聯(lián)。

表2 乳腺癌患者miRNA-29、MMP-2與其臨床參數(shù)的相關(guān)性

本研究中分別選取無乳腺疾病婦女、原發(fā)性乳腺癌患者以及轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，分別提取乳腺組織并開展miRNA-29與MMP-2等臨床檢驗，旨在觀察不同乳腺組織測定結(jié)果，并通過總結(jié)乳腺癌患者miRNA-29表達(dá)與臨床病理資料的相關(guān)性，以進(jìn)一步為乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物與治療新靶點提供理論基礎(chǔ)。通過臨床檢測結(jié)果比較可見，乳腺癌患者的miRNA-29水平明顯低于對照組，其MMP-2水平顯著高于對照組，而原發(fā)性乳腺癌組織與轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織的上述測定結(jié)果比較亦具有顯著差異，提示miRNA-29與MMP-2均為乳腺癌的標(biāo)志物，并且對腫瘤組織轉(zhuǎn)移情況也具有良好表現(xiàn)作用。另外，乳腺癌患者的miRNA-29與MMP-2水平同其腫瘤大小、病理分期、HER-2及ki-67均具有密切相關(guān)性，經(jīng)Spearman等級相關(guān)性分析證實miRNA-29與MMP-2具有負(fù)相關(guān)性，提示miRNA-29對乳腺癌發(fā)生與發(fā)展均具有良好的評估作用。

綜上所述，miRNA-29與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移等過程均具相關(guān)性，明確其表達(dá)水平有助于病情評估及臨床治療。

[1] 汪 敏.早期乳腺癌保乳手術(shù)及改良根治術(shù)的臨床療效及生活質(zhì)量的比較〔J〕.實用癌癥雜志,2014,11(3):87-89.

[2] 陳萬青,鄭榮壽.中國女性乳腺癌發(fā)病死亡和生存狀況〔J〕.中國腫瘤臨床,2015,42(13):668-674.

[3] 黃雅菁,吳正升,王 弦,等.乳腺癌中miR-134的表達(dá)及其與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系〔J〕.臨床與實驗病理學(xué)雜志,2015,31(6):648-651.

[4] Al-Ahmadi W,Al-Ghamdi M,Al-Souhibani N,et al.miR-29a inhibition normalizes HuR over-expression and aberrant AU-rich mRNA stability in invasive cancer〔J〕.J Pathol,2013,230(1):28-38.

[5] 趙波濤,羅慶豐,高 玟,等.新輔助化療對乳腺癌激素受體ER、PR表達(dá)的影響〔J〕.實用癌癥雜志,2014,87(1):376-378.

[6] 倪 萍,葛 藤,林 新,等.乳腺癌腫瘤微環(huán)境中HMGB1、miRNAs的檢測及相關(guān)性分析〔J〕.免疫學(xué)雜志,2015,11(6):501-504.

[7] 胡朝洲,史永照.微小RNA調(diào)控雌激素受體α在乳腺癌中表達(dá)的研究進(jìn)展〔J〕.上海醫(yī)藥,2015,36(8):23-27.

[8] 邵 彬,李惠平,朱 軍.復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者血漿miRNA表達(dá)水平與臨床病理特征、化療療效及預(yù)后關(guān)系的研究〔J〕.癌癥進(jìn)展,2015,11(2):106-113.

[9] 張 萍,馬 飛,徐兵河.微小RNA基因多態(tài)與乳腺癌易感性的關(guān)系〔J〕.中華腫瘤雜志,2015,37(7):501-507.

[10] 武 燕,王?；?宮頸癌與血漿微小RNA表達(dá)譜相關(guān)性的初步研究〔J〕.中國藥物與臨床,2015,15(6):762-764.

[11] 李 強(qiáng),卓其斌,黃玉仙,等.從微小RNAs看肝細(xì)胞癌診治新視點〔J〕.臨床肝膽病雜志,2015,31(6):977-981.

[12] 熊焱強(qiáng),劉朝奇,李志英.miRNA在宮頸癌早期診斷及預(yù)后中的研究進(jìn)展〔J〕.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2015,35(6):842-845.

[13] 楊浚沨,王龍強(qiáng),李 海,等.乳腺癌循環(huán)miRNA生物標(biāo)志物的篩選及驗證〔J〕.中國普通外科雜志,2015,24(5):696-700.

[14] Lagos-Quintana M,Rauhut R,Lendeckel W,et al.Identification of novel genes coding foe small expressed RNAs〔J〕.Science,2001,294(5543):853-858.

[15] Wang C,Bian Z,Wei D,et al.miR-29b regulates migration of human breast cancer cells〔J〕.Mol Cell Biochem,2011,352(1-2):197-207.

[16] Limame R,Van der Auwera I,van Dam P,et al.Integrated miRNA and mRNA expression profiling of the inflammatory breast cancer subtype〔J〕.Br J Cancer,2010,103(4):532-541.

[17] Katunia AI,Gershtein ES,Ermilova VD,et al.Matrix metalloproteinases2,7 and 9 in tumors and sera of patients with breast cancer〔J〕.Bull Exp Biol Med,2011,151(3):359-362.

[18] 劉 輝,呂麗瓊,莫小勤,等.MMP-2、MMP-7、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2在乳腺癌組織中的表達(dá)及意義〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,15(16):3046-3048.

(編輯：吳小紅)

Expression of miRNA-29 in Normal Breast Tissues,Primary Breast Cancer Tissues and Metastatic Breast Cancer Tissues

WANGYan,YUYang,LIQing,etal.

XuzhouCentralHospital,Xuzhou,221009

Objective To discuss the expression of miRNA-29 in the normal breast tissues,primary breast cancer tissues and metastatic breast cancer tissues,and the role of miRNA-29 and MMP-2 in disease occurrence and progression.Methods 286 patients with breast cancer were selected,including 205 cases of primary breast cancer and 81 cases of metastatic breast cancer.At the same time,150 cases of healthy women without breast disease were the control group.Respectively acquired the breast specimens and detected the expression of miRNA-29 and MMP-2 by RT-PCR.Results The miRNA-29 levels and MMP-2 levels had statistically significant differences among the 3 groups(P<0.05).miRNA-29 were negatively correlated with the MMP-2,but miRNA-29 were closely related with tumor size,pathological stage,HER-2,and ki-67(P<0.05).Conclusion miRNA-29 plays an important role in the occurrence,development and metastasis of breast cancer.The expression of miRNA-29 contributes to disease assessment and clinical treatment.

Primary breast cancer;Metastatic breast cancer;MiRNA-29;MMP-2

221009 徐州市中心醫(yī)院

劉 勇

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.11.007

R737.9

A

1001-5930(2016)11-1763-04

2015-12-12

2016-07-07)

miRNA-29與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移等過程均具相關(guān)性，明確其表達(dá)水平有助于病情評估及臨床治療。