包佑根 巢海潮 朱遵偉 曾 濤

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miRNA-451在膀胱癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

包佑根 巢海潮 朱遵偉 曾 濤

目的 探討miRNA-451在膀胱癌組織及膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平及其與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系。方法 采用RT-qPCR檢測(cè)miRNA-451在30例膀胱癌、18例癌旁組織、15例正常膀胱組織及3個(gè)不同轉(zhuǎn)移潛能的膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平，分析其表達(dá)與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 miRNA-451在癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平明顯低于正常組織，且其表達(dá)水平和膀胱癌臨床分期及病理分級(jí)相關(guān)，P<0.01。miRNA-451在低度轉(zhuǎn)移潛能的癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平高于具有高轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株,P<0.01。結(jié)論 miRNA-451在癌組織及高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株中呈低表達(dá)，且其表達(dá)水平與膀胱癌臨床病理特征及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)，可能是膀胱癌潛在的調(diào)控基因。

膀胱癌;miRNA-451;RT-qPCR;差異表達(dá)

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1754～1758)

近期研究發(fā)現(xiàn)，作為轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的miRNA與惡性腫瘤密切相關(guān)，它在多種腫瘤生物過(guò)程中發(fā)揮著抑癌或類癌基因的作用，其中包括膀胱腫瘤[1]；miRNA-451被報(bào)道是1個(gè)典型的腫瘤相關(guān)miRNA，它與膠質(zhì)瘤[2]、乳腺癌[3]、肺癌[4]、食管癌[5]和肝癌[6]等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，提示miRNA-451對(duì)腫瘤的作用可能具有普遍性，但迄今尚未見miRNA-451調(diào)控膀胱癌的相關(guān)系統(tǒng)報(bào)道。本課題收集膀胱癌組織標(biāo)本并培養(yǎng)具有不同轉(zhuǎn)移潛能的膀胱癌細(xì)胞株T24、5637、J82，采用RT-qPCR檢測(cè)并分析miRNA-451在膀胱癌、癌旁組織、正常膀胱組織及細(xì)胞株中的表達(dá)水平，并分析其表達(dá)水平和膀胱癌臨床病理特征及細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的關(guān)系。旨在通過(guò)RT-qPCR方法檢測(cè)并發(fā)現(xiàn)膀胱癌的潛在調(diào)控基因，為膀胱癌的相關(guān)基礎(chǔ)研究及靶向分子治療提供新的切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

選取2012年1月至2014年12月間在我院行根治性全切術(shù)的膀胱癌患者的組織標(biāo)本，收集癌組織(癌灶無(wú)明顯壞死區(qū))30例及相對(duì)應(yīng)的癌旁組織18例(距離腫瘤組織基地邊緣2.5 cm處)和正常膀胱組織15例。組織在手術(shù)離體后立即用于4 ℃冰箱預(yù)冷的無(wú)菌生理鹽水清洗標(biāo)本血污并迅速取材，取材后由液氮罐轉(zhuǎn)運(yùn)，放置于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?，同時(shí)記錄臨床相關(guān)病理資料?；颊吣挲g46～78歲，男性24例，女性6例；臨床資料完整，術(shù)前均未行放射、化學(xué)、免疫和細(xì)胞因子等治療。標(biāo)本的收集通過(guò)江西省人民醫(yī)院生命科學(xué)倫理審查委員會(huì)審查，并經(jīng)病人知情同意。

體外培養(yǎng)人源性膀胱癌細(xì)胞株T24、5637、 J82(均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))。其中T24、5637用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng),J82用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37 ℃,5%CO2，飽和濕度。選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。RNA提取液Trizol 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miRNA-451及U6引物由南通百奧邁科公司設(shè)計(jì)與合成(序列見Table1)(表1)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒均購(gòu)至TaKaRa公司。

表1 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)中目的基因及內(nèi)參引物序列

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 組織標(biāo)本實(shí)驗(yàn)部分分組：膀胱癌組(膀胱癌組織)、癌旁組(距癌基地邊緣2.5 cm處組織)、正常對(duì)照組(正常膀胱組織)。

細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)部分分組為：T24細(xì)胞組、5637細(xì)胞組、J82細(xì)胞組。

1.2.2 總RNA提取 根據(jù)Invitrogen/TRIzol 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行總RNA提取(所有操作均在冰上進(jìn)行)。膀胱組織： 取50～100 mg 組織液氮研磨至粉末狀，置于玻璃研磨器內(nèi)，加入1 ml Trizol充分勻漿，勻漿后樣品倒入EP 管中，室溫靜置5 min。細(xì)胞株：體外培養(yǎng)細(xì)胞待細(xì)胞密度至90%左右時(shí)，倒掉培養(yǎng)液，用存儲(chǔ)于4 ℃的PBS洗滌細(xì)胞2次，然后加存儲(chǔ)于4 ℃的TRIzol 500 μl，搖勻放入-20 ℃冰箱5 min后反復(fù)吹打并轉(zhuǎn)移到Ep管中。然后各加入0.5ml 異丙醇，混勻后于冰上靜置20～30 min。低溫離心機(jī)內(nèi)，4 ℃，12 000 rpm×15 min。棄上清，留取沉淀，加入與上清液等體積的異丙醇500 μl，冰盒內(nèi)靜止10 min。低溫離心機(jī)內(nèi)，4 ℃，12 000 rpm×10 min。取出Ep管，棄上清液，加入與TRIzol等體積的75%乙醇(500 μl)洗滌。低溫離心機(jī)內(nèi)，4 ℃，7 500 rpm×5 min。棄上清液，用濾紙吸干管壁及管蓋上的液體，常溫下風(fēng)干10 min左右。吸取30 μl的無(wú)核酶水溶解RNA備用。若暫時(shí)不用，可將乙醇洗滌的RNA放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 檢測(cè)總RNA的純度和濃度 應(yīng)用紫外分光光度儀(UV-9100,北京瑞利分析儀器公司) 檢測(cè)和評(píng)估RNA的純度及濃度。先用溶解RNA的0.1%DECP水調(diào)零，然后上1 μl RNA液進(jìn)行濃度測(cè)定，連續(xù)測(cè)3次，并記錄好相關(guān)數(shù)值，最后計(jì)算均值。根據(jù)A260 nm/A280 nm判斷RNA純度，當(dāng)比值在1.8～2.0范圍內(nèi)時(shí)，說(shuō)明RNA純度符合下一步的逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)要求。根據(jù)檢測(cè)RNA樣本的A260 nm值計(jì)算其溶度，計(jì)算公式為：A260 nm×稀釋倍數(shù)×40 μg/ml。并制作1%的瓊脂糖凝膠，上2 μl RNA進(jìn)行電泳，觀察RNA樣本的完整性。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄RNA到cDNA 根據(jù)TakaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit,DR037A)說(shuō)明進(jìn)行操作(冰上進(jìn)行)。按要求比例配制10 μl體系的用于定量PCR反應(yīng)的cDNA合成反應(yīng)液。按以下反應(yīng)條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：42 ℃，15 min(反轉(zhuǎn)錄)；85 ℃，5 s(熱失活)。將所得cDNA做好標(biāo)記后置于-80 ℃冰箱存儲(chǔ)備用。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增 根據(jù)TakaRa公司PCR試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTMⅡRR820A)說(shuō)明進(jìn)行操作。按要求比例配制20 μl體系的定量PCR反應(yīng)液。按以下反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：95 ℃30 s；40個(gè)循環(huán)，95 ℃5 s；60 ℃ 34 s。

1.3 數(shù)據(jù)收集及分析

2 結(jié)果

總RNA提取后，在微量紫外分光光度計(jì)上點(diǎn)樣1 μl檢測(cè)純度和濃度，結(jié)果示：A260 nm/A280 nm值均在1.8～2.0之間，表明總RNA的純度高，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求?？俁NA提取后，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下成像觀察，結(jié)果示：5 S隱約可見，而28 S及18 S條帶明顯，且28S 條帶的亮度約為18 S條帶的兩倍，由此可知總RNA無(wú)明顯降解，其完整性較好，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

PCR過(guò)程中miRNA-451及U6擴(kuò)展曲線穩(wěn)定，溶解曲線均為單一峰，說(shuō)明引物特異性好，無(wú)二聚體等形成，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合要求。將PCR產(chǎn)物經(jīng)3%的瓊脂糖凝膠(配置方法：900 mg瓊脂糖+30 ml 1×的TAE液)進(jìn)行電泳，以β-actin作為對(duì)照，結(jié)果示產(chǎn)物單一(圖1)。

miRNA-451在膀胱癌、癌旁組織中的表達(dá)水平較正常膀胱組織低，差異顯著(P<0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A)。miRNA-451在高級(jí)別(T3、T4)膀胱癌組織中的表達(dá)水平較低級(jí)別(Ta、T1)膀胱癌組織低；在高分化癌組織中其表達(dá)水平較低分化癌組織高；差異顯著(P<0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B、C)。

miRNA-451在不同轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株T24、5637、 J82中的表達(dá)存在差異，在低度轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株中呈高表達(dá)，在高度轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株中呈低表達(dá)，與細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖2D)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)miRNA-451在三個(gè)膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平較正常膀胱組織低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。miRNA-451在膀胱癌組織中呈低表達(dá)，且其表達(dá)水平與膀胱癌臨床病理特征及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)，提示其可能是膀胱癌的一個(gè)潛在的類似抑癌基因。

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳紫外成像圖

3 討論

膀胱癌是我國(guó)最常見的泌尿系惡性腫瘤,在人口老齡化、吸煙人口增加及環(huán)境污染加重等諸多因素綜合影響下，其發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)[7]。它有著多功能損害、高復(fù)發(fā)率、治療困難的臨床特點(diǎn)，而早期診斷和有效的治療方式成為目前提高患者生存率的最佳途徑。在眾多影響生存率的因素中，明確的生物分子標(biāo)志物及基因治療靶點(diǎn)是關(guān)鍵。因此,深入研究膀胱癌發(fā)生及發(fā)展的關(guān)鍵生物分子，探索新的生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)及基因治療靶點(diǎn),提高本病的早期診斷率及臨床療效一直是泌尿系腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

微小RNA(microRNA，miRNA)是1類長(zhǎng)度為19～24 bp的內(nèi)源性、非編碼、單鏈小RNA。其作用靶點(diǎn)是mRNA，它通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)方式和靶基因3＇端非翻譯區(qū)(3＇-UTR)部分或全部結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平降低相應(yīng)靶基因的表達(dá),阻遏其蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而影響細(xì)胞分化、凋亡、增殖等諸多過(guò)程[8]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA也參與腫瘤的轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)、血管生成及EMT等多種過(guò)程，發(fā)揮著類似腫瘤抑制因子或原癌基因的作用[9]。據(jù)報(bào)道，人類基因組中約有30%mRNA受到miRNA調(diào)控[10]大約有50%的miRNA其上游基因位于染色體中及腫瘤相關(guān)的區(qū)域內(nèi)，特別是位于腫瘤形成相關(guān)性脆弱基因位點(diǎn)[11]，這在調(diào)控基因表達(dá)和影響腫瘤的發(fā)生和演變中具有重要意義。這也使得miRNA與腫瘤的相關(guān)研究成了近期學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)，包括膀胱腫瘤相關(guān)miRNA的研究。

Mahdavinezhad等通過(guò)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MiR-141,miR-200-c和miR30-b在膀胱癌組織中異常高表達(dá)，其中miR-141和腫瘤浸潤(rùn)密切相關(guān)[12]。Braicu C等也證實(shí)miRNA的異常表達(dá)水平可為評(píng)估膀胱癌的臨床分期及病理分級(jí)提供參考依據(jù)[13]。另有研究者結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-124能通過(guò)直接靶定CDK4來(lái)阻止膀胱癌細(xì)胞周期循環(huán)并抑制其生長(zhǎng)[14]，mir-200b能夠通過(guò)改變WASF-3的表達(dá)水平抑制膀胱癌細(xì)胞系T24的遷移[15]。均提示miRNA和腫瘤的密切關(guān)聯(lián)。為了進(jìn)一步探索膀胱癌相關(guān)miRNA的臨床應(yīng)用前景，F(xiàn)u等通過(guò)人工合成miRNA進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)它們可沉默UCA1-MALAT1或c-My基因表達(dá)，進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞T24和5637的遷移并促進(jìn)其凋亡[16]。而Zhuang CL等也發(fā)現(xiàn)miRNA類似物可抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡，并選擇性地延緩了膀胱癌的進(jìn)展[17]。這為miRNA應(yīng)用為臨床提供可能，也為膀胱癌的靶向基因分子治療提供了新的切入點(diǎn)。進(jìn)一步查閱腫瘤相關(guān)miRNA文獻(xiàn)時(shí)，miRNA-451在多種腫瘤中異常表達(dá)及調(diào)控作用引起了我們的關(guān)注。

注：A為膀胱癌、癌旁組織及正常膀胱組織中miRNA-451的表達(dá)；B為 miRNA-451在不同臨床分期癌組織中的表達(dá)；C為miRNA-451在不同分化程度癌組織中的表達(dá)；D為miRNA-451在不同癌細(xì)胞株中的表達(dá)。

miRNA-451定位于人類基因組17q11.2中，是一個(gè)典型抑癌基因[18]。研究表明，miRNA-451可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲并增強(qiáng)細(xì)胞凋亡能力，調(diào)控腫瘤的發(fā)生及演變過(guò)程。Yang Nan等發(fā)現(xiàn)miRNA-451在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中低表達(dá)，通過(guò)靶向抑制基因CAB39，進(jìn)而下調(diào)LKB1/AMPK信號(hào)傳導(dǎo)，影響膠質(zhì)細(xì)胞瘤增殖遷移等能力[19]；吳春蓉體外研究表明miRNA-451 過(guò)表達(dá)能夠抑制結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系SW620的侵襲能力[20]；Wang等發(fā)現(xiàn) miR-451 在肺癌組織中低表達(dá)，趨勢(shì)在非小細(xì)胞肺癌中更為顯著，并且推測(cè)其可能通過(guò)靶向作用RAB14抑制Akt信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]；Brenner等研究發(fā)現(xiàn)miR-451在胃癌中低表達(dá)，其表達(dá)水平與胃癌早期診斷及預(yù)后密切相關(guān)[21]；近期Liu D等采用RT-PCR、Western-blot、基因沉默等技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)miRNA-451在宮頸癌、結(jié)腸癌細(xì)胞株中具有抑癌作用，通過(guò)IL6R信號(hào)通路抑制腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移[22]。相關(guān)研究還表明，miRNA-451在乳腺癌[3]、食管癌[5]、肝癌[6]、白血病[23]、腎細(xì)胞癌[24]等中均存在異常表達(dá)。提示miRNA-451在多種腫瘤生物學(xué)行為調(diào)控過(guò)程中擔(dān)當(dāng)了重要角色，或是一個(gè)多功能的廣譜腫瘤調(diào)控因子。但目前尚未見miRNA-451調(diào)控膀胱癌的相關(guān)系統(tǒng)報(bào)道。

為探尋miRNA-451是否在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中也扮演了某種調(diào)控角色，本研究采用RT-qPCR檢測(cè)miRNA-451在膀胱癌組織、癌旁組織及正常膀胱組織中的表達(dá)水平，并比較表達(dá)差異程度。結(jié)果顯示它在膀胱癌及癌旁組織中較在正常膀胱組織中顯著低表達(dá)；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平和膀胱癌臨床分期及病理分級(jí)相關(guān)。提示miRNA-451和膀胱癌密切相關(guān)。為進(jìn)一步求證該相關(guān)性，本研究采用同樣的方法檢測(cè)miRNA-451在3個(gè)具有不同轉(zhuǎn)移潛能的膀胱癌細(xì)胞株(T24、5637、J82)的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miRNA-451在低度轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株中呈高表達(dá)，在高度轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株中呈低表達(dá),與細(xì)胞株轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了上述組織標(biāo)本層次的結(jié)論。而與正常膀胱組織進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)miRNA-451在3個(gè)膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平呈顯著低表達(dá)，這和組織標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果一致。綜合顯示miRNA-451在膀胱癌組織及細(xì)胞株中呈低表達(dá)狀態(tài)，且和膀胱癌臨床病理特征及癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)，提示miRNA-451可能是膀胱癌的一個(gè)潛在的類似抑癌基因，在膀胱癌的發(fā)生及演變過(guò)程中或擔(dān)當(dāng)了重要角色。

綜上所述，miR-451可能在膀胱癌組織和膀胱癌細(xì)胞株中發(fā)揮著類似抑癌基因的作用，其表達(dá)與膀胱癌臨床分期、病理分級(jí)及癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)，提示可能抑制膀胱癌的侵襲及轉(zhuǎn)移,影響膀胱癌的進(jìn)展。本研究層次尚淺，只初步揭示了miRNA-451和膀胱癌的臨床相關(guān)性，至于其調(diào)控膀胱癌的作用及分子機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究探尋。但miRNA-451 有望作為一個(gè)新的潛在靶基因，用于膀胱癌的早期診斷和基因治療，為膀胱癌的科學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)及新的思路。

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(編輯：吳小紅)

Expression and Clinical Significance of miRNA-451 in Bladder Cancer

BAOYougen,CHAOHaichao,ZHUZunwei,etal.

JiangxiProvincialPeople'sHospital,Nanchang,330006

Objective To explore the expression of miRNA-451 in bladder cancer and bladder carcinoma cell lines and its relationship with clinicopathological characteristics of bladder cancer.Methods Expression levels of miR-451 in 30 cases of bladder cancer tissues,18 cases of pericarcinous tissues,15 cases of normal tissues,and 3 bladder carcinoma cell lines with different metastasis potential were examined.The correlation of miR-451 expression with clinicopathological characteristics of bladder cancer was further evaluated.Results PCR analysis showed that miR-451 expression in carcinoma tissues and adjacent tissues were lower than that in normal tissues,and was closely related to pathological grading and clinical stage,P<0.01.And miR-451 expression in bladder carcinoma cell lines with lower metastasis potential was higher than those with higher metastasis potential,P<0.01.Conclusion MiR-451 expression is down-regulated in bladder cancer tissues and bladder carcinoma cell lines with high metastasis potential,and is closely related to clinicopathological characteristics,indicating that it may be potential anti-oncogene of bladder cancer.

Bladder cancer;MiRNA-451;RT-qPCR;Differential expression

江西省衛(wèi)生計(jì)生委科技計(jì)劃(編號(hào)：20155001)

330006 江西省人民醫(yī)院

曾 濤

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.11.005

R737.14

A

1001-5930(2016)11-1754-05

2015-12-22

2016-07-08)