梁婷婷 于云海 董延磊 黃太勝 俆 暉

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PDCD5在人子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及對細(xì)胞凋亡的影響

梁婷婷 于云海 董延磊 黃太勝 俆 暉

目的 探討PDCD5對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞克隆形成，增殖以及凋亡的作用。方法 收集行手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜癌及對應(yīng)癌旁組織共60例，采用qRT-PCR，western blot分別檢測PDCD5 mRNA水平及蛋白水平在子宮內(nèi)膜癌及對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況，通過重組PDCD5(rhPDCD5)處理HEC1A子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，檢測其對細(xì)胞增殖、克隆形成及細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 子宮內(nèi)膜癌組織中PDCD5表達(dá)水平顯著低于對應(yīng)癌旁組織(P<0.05)；腫瘤組織中PDCD5低表達(dá)與病理分期、組織學(xué)分級、肌層浸潤以及腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均具有顯著相關(guān)性(P<0.05)；低表達(dá)PDCD5的患者總生存時間均顯著縮短(P<0.05)；重組的PDCD5蛋白能夠通過促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞增殖和克隆形成能力。結(jié)論P(yáng)DCD5在子宮內(nèi)膜癌組織中低表達(dá)并與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征及不良預(yù)后顯著相關(guān)，并能夠通過促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖及克隆形成，PDCD可能參與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，并可作為早期診斷及預(yù)后評價的重要分子。

PDCD5；子宮內(nèi)膜癌；表達(dá)；預(yù)后

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1749～1753)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer)是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，每年大約有超過288 000女性發(fā)展成為子宮內(nèi)膜癌，約占全部惡性腫瘤的7%,占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%[1-2]。目前子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍然不清楚，因此研究子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制對于提高患者的診斷及預(yù)后評價具有重要意義。PDCD5原名TFAR19(TF-1 cell apoptosis related gene-19)，是由我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)的1個參與細(xì)胞凋亡過程調(diào)控的新基因[3]。研究表明，PDCD5廣泛表于人體的各個組織，其mRNA表達(dá)水平在胚胎組織中顯著低于成人組織[4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，PDCD5在腫瘤患者，特別是在肺癌，卵巢癌，胃癌和膠質(zhì)瘤中表達(dá)量降低，提示低表達(dá)量的PDCD5可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[5-7]。但PDCD5在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及與患者預(yù)后關(guān)系用尚不清楚。

本研究檢測了PDCD5在子宮內(nèi)膜癌及對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況，分析PDCD5表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系及其對子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的影響。通過體外實(shí)驗(yàn)檢測重組PDCD5對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，克隆形成以及凋亡的影響，以期為子宮內(nèi)膜癌的診斷與預(yù)后評估提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選擇2007年1月至2012年12月期間于我院婦產(chǎn)科行子宮內(nèi)膜癌手術(shù)治療并具有完整隨訪資料的患者60例。子宮內(nèi)膜癌及對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本手術(shù)切除后迅速進(jìn)行多點(diǎn)取材，分別置于液氮或4%多聚甲醛固定并石蠟包埋保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

RNA提取試劑，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，qRT-PCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；PDCD5及β-actin PCR引物有深圳華大基因生物科技有限公司合成；鼠抗人PDCD5單克隆抗體及兔抗小鼠二抗均購自美國Santa Cruz公司；重組PDCD5購于Novoprotein公司。MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒以及Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC1A用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待生長至70%～80%匯合度時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.4 qRT-PCR

取適量液氮凍存的組織標(biāo)本于研缽中研磨后加入1 ml RNA提取試劑提取癌及癌旁組織總RNA，按反轉(zhuǎn)錄說明書分別將1 μg總mRNA反轉(zhuǎn)成cDNA,以下列引物：PDCD5：上游引物5′-CGACTGATCCAGAACTTGGG-3′，下游引物5′-GAGCTGCAGGCCAAACAC-3′；β-actin：上游引物5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′，下游引物5′-TCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′，按qRT-PCR說明書要求配制反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用2-△△Ct法計算PDCD5 mRNA在癌及癌旁組織中的相對表達(dá)量。通過計算癌組織標(biāo)本中PDCD5表達(dá)量的平均值，將患者分為高表達(dá)PDCD5組和低表達(dá)PDCD5組，統(tǒng)計其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系及生存曲線。

1.5 四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，按5×103個/孔接種至96孔板，每孔培養(yǎng)基體積200 μL。過夜后按照不同的劑量給予重組PDCD5(10 μg)處理，分別培養(yǎng)24 h，48 h，72 h，96 h時間后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，震蕩混勻10 min使結(jié)晶完全溶解，選擇490 nm波長，應(yīng)用酶標(biāo)儀測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞凋亡

子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞按1×105個/孔接種至6孔板，次日給予rhPDCD5(5 μg和10 μg)處理，以加入PBS為對照組，處理24 h后收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI雙染法試劑盒說明書預(yù)染細(xì)胞，整個操作使樣品處于低溫避光，孵育好樣品后采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.7 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

將HEC1A細(xì)胞消化吹打成單個細(xì)胞并按200個孔接種于6孔板，置37 ℃，5%CO2環(huán)境下靜置培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組給予rhPDCD5(10 μg)處理，對照組給予PBS，繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的集落時終止培養(yǎng)，棄上清，PBS清洗3遍，甲醇固定15 min后，棄上清，加入0.1%結(jié)晶紫溶液染色10～30 min，流水緩慢沖洗后晾干，觀察克隆大小并計數(shù)克隆數(shù)。

1.8 免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blots)

子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC1A分別經(jīng)重組PDCD5處理以及對照組PBS處理培養(yǎng)48 h后提取總蛋白并測定蛋白濃度，相同質(zhì)量的蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉2～3 h，孵育PDCD5一抗4 ℃過夜，0.5% PBST洗膜，室溫孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗1 h，0.5% PBST洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料采用Pearson卡方檢驗(yàn)；Kaplan-Meier生存分析患者生存曲線，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織中PDCD5的表達(dá)

qRT-PCR檢測60例子宮內(nèi)膜癌組織及對應(yīng)的癌旁組織中PDCD5表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中PDCD5 mRNA表達(dá)量顯著低于癌旁組織中PDCD5的表達(dá)水平(P<0.01，圖1A)。Western blot檢測其中3份標(biāo)本中PDCD5蛋白表達(dá)水平也發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中PDCD5蛋白表達(dá)量均低于對應(yīng)癌旁組織(圖1B)。以上結(jié)果表明，PDCD5在子宮內(nèi)膜癌中呈低表達(dá)。

注：A為qRT-PCR檢測；B為Western blot檢測，1、2、3分別表示3份癌與癌旁組織樣本，N表示癌旁組織，T表示癌組織。

2.2 PDCD5表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系

按子宮內(nèi)膜癌組織中PDCD5基因表達(dá)水平將60例患者分成高表達(dá)和低表達(dá)兩組。Pearson卡方檢驗(yàn)結(jié)果見表1所示，子宮內(nèi)膜癌組織中低表達(dá)PDCD5基因與病理分期、組織學(xué)分級、肌層浸潤以及腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.002)均顯著相關(guān)，而與患者年齡無關(guān)(P>0.05)。以上結(jié)果提示，PDCD5可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過程。

表1 PDCD5表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系/例

2.3 PDCD5表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier分析PDCD5表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌患者的生存時間結(jié)果顯示，高表達(dá)PDCD5患者生存時間顯著長于PDCD5低表達(dá)患者的生存時間(P<0.05，圖2)。以上結(jié)果提示，PDCD5表達(dá)水平可以作為判斷子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。

圖2 Kaplan-Meier生存時間分析

2.4 重組PDCD5蛋白對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和克隆形成的影響

增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入rhPDCD5后，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖能力顯著弱于對照組(P<0.05，圖3)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)rhPDCD5處理后，HEC1A細(xì)胞的克隆大小顯著弱于對照組，加入重組PDCD5組的克隆數(shù)目也顯著少于未加入組(P<0.05，圖3)。

2.5 重組PDCD5蛋白對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的影響

檢測重組PDCD5 蛋白對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，當(dāng)加入5 μg和10 μg rhPDCD5處理細(xì)胞后顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生，細(xì)胞凋亡率分別為(3.2±0.01)%、(12.5±0.81)%和(35.6±0.61)%(P<0.05,圖4)。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌由于其復(fù)雜的發(fā)病過程，導(dǎo)致在確診時大部分患者已處于疾病晚期。盡管早期的子宮內(nèi)膜癌患者5年生存率達(dá)到90%，但是其中有約30%是高級別腫瘤，其發(fā)生深度浸潤及局部轉(zhuǎn)移，5年生存率在16%～66%[8]。近年來，對于治療子宮內(nèi)膜癌主要的治療方案有子宮切除術(shù)，激素治療以及放化療聯(lián)合做方案。這些治療方案對早期子宮內(nèi)膜癌具有顯著的治療效果，然而一旦腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，這些治療方案就失去作用[9-10]。因此，研究子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)理以及尋找早期診斷和預(yù)后標(biāo)志物已成為提高子宮內(nèi)膜癌診治水平的重要手段。

注：A為 MTT法檢測HEC1A增殖實(shí)驗(yàn)；PBS為對照組；rhPDCD5為實(shí)驗(yàn)組，重組的PDCD5；B為克隆形成實(shí)驗(yàn)。

注：PBS為對照組，未加rhPDCD5；實(shí)驗(yàn)組分別加入5μg和10μg rhPDCD5處理子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞。

PDCD5氨基酸序列在真核生物中相當(dāng)保守，是細(xì)胞凋亡相關(guān)基因。PDCD5在人類疾病中的作用已有廣泛研究。如在卵巢癌，膠質(zhì)瘤和前列腺癌中低表達(dá)PDCD5與患者的腫瘤級別及預(yù)后呈正相關(guān)[5,11-12]。而在另外一些疾病如急性髓細(xì)胞白血病患者中，PDCD5蛋白水平顯著高于正常人[13]。但其在子宮內(nèi)膜癌中的臨床價值尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，PDCD5在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平均顯著低于對應(yīng)癌旁組織，并且低表達(dá)PDCD5與病理參數(shù)如腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期等臨床病理特征具有顯著相關(guān)性。生存分析發(fā)現(xiàn)，與PDCD5基因高表達(dá)患者相比，PDCD5基因低表達(dá)患者的總生存率均顯著降低。PDCD5發(fā)揮功能主要是以一種依賴細(xì)胞因子的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)作用[3]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，細(xì)胞質(zhì)中的PDCD5迅速轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核并發(fā)揮促凋亡作用[14]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重組的PDCD5通過細(xì)胞內(nèi)吞作用抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。過表達(dá)PDCD5促進(jìn)了細(xì)胞對順鉑的敏感性，并抑制了肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，重組的PDCD5蛋白能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞體外增殖和克隆形成，流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，重組PDCD5蛋白能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡，提示PDCD5在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮抑癌作用。因而，我們得出結(jié)論，PDCD是一種重要的抑癌蛋白，在調(diào)控子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展方面具有重要作用。

綜上所述，PDCD5在子宮內(nèi)膜癌組織呈低表達(dá)狀態(tài)，低表達(dá)PDCD5與子宮內(nèi)膜癌惡性臨床病理特征及患者不良預(yù)后密切相關(guān)。一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)重組的PDCD5通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞體外增殖和克隆形成能力。因此，PDCD5在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

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(編輯：吳小紅)

The Expression of PDCD5 in Human Endometrial Cancer and Its Effect on Apoptosis

LIANGTingting,YUYunhai,DONGYanlei,etal.

TheSecondHospitalofShandongUniversity,Jinan,250033

Objective To investigate the effect of expression of PDCD5 on cell colony formation,proliferation and apoptosis in human endometrial cancer.Methods 60 cases of endometrial carcinoma and matched tumor-adjacent tissues were collected.mRNA and the protein expression of PDCD5 of endometrial carcinoma and matched tumor-adjacent tissues were detected by qRT-PCR and western blot.Effects of PDCD5 on HEC1A cell proliferation,colony formation and apoptosis were evaluated.Results Expression of PDCD5 in endometrial carcinoma tissues were lower than matched tumor-adjacent tissues(P<0.05).Low expression of PDCD5 was associated with histology grade,tumor stage,myometrial invasion and lymph nod metastasis (P<0.05).Moreover,patients with lower PDCD5 expression levels showed poor overall survival than high PDCD5 expression group (P<0.05).In addition,Recombinant human PDCD5 (rhPDCD5) inhibited HEC1A cell proliferation,colony formation and induced cell apoptosis in vitro.Conclusion PDCD5 is a candidate tumor suppressor gene in human endometrial carcinoma,and low expression is related to the malignant clinicopathological features and poor prognosis.It could inhibit tumor cell growth and colony formation though induce apoptosis in vitro.PDCD5 might offer future clinical utility in the treatment of endometrial carcinoma.

PDCD5;Endometrial carcinoma;Expression;Apoptosis

山東省科技發(fā)展計劃項(xiàng)目(編號：2011WSB21018)

250033 山東大學(xué)第二醫(yī)院

俆 暉

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.11.004

R737.33

A

1001-5930(2016)11-1749-05

2015-12-07

2016-05-31)