雷小平，鄒禮樂，董文斌，康蘭，趙帥，羅梅

(1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000；2西南醫(yī)科大學(xué))

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宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠老年期血脂水平、肝脂肪含量及脂肪特異性蛋白27表達(dá)變化

雷小平1，鄒禮樂2，董文斌1，康蘭1，趙帥1，羅梅1

(1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000；2西南醫(yī)科大學(xué))

目的 觀察宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)大鼠老年期血脂水平、肝脂肪含量及脂肪特異性蛋白27(Fsp27)表達(dá)變化。方法 取IUGR和適于胎齡(AGA)大鼠各8只，分別設(shè)為IUGR組和AGA組。兩組大鼠予標(biāo)準(zhǔn)配方飼料喂養(yǎng)至12月齡時處死，心腔穿刺采血，用酶法檢測血漿LDL-C、TC、游離脂肪酸(FFA)、HDL-C及TG；取肝組織行HE染色，光鏡下觀察兩組大鼠肝臟形態(tài)學(xué)改變；采用酶法測定肝臟TG和TC；采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測肝組織Fsp27 mRNA，采用Western blotting法檢測肝組織Fsp27蛋白。結(jié)果 IUGR組、AGA組血漿TC分別為(0.57±0.14)、(0.32±0.15)mmol/gprot，LDL-C分別為(7.16±1.08)、(5.32±0.88)mmol/L，HDL-C分別為(3.33±0.54)、(4.47±0.71)mmol/L，TG分別為(2.21±0.23)、(1.66±0.15)mmol/L，F(xiàn)FA分別為(1.46±0.25)、(1.17±0.21)mmol/L，兩組比較，P均<0.01。AGA組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)、大小正常，胞質(zhì)呈均勻紅染，細(xì)胞內(nèi)少見脂滴及空泡，而IUGR組大鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量大小不等的脂滴及空泡。IUGR組、AGA組大鼠肝組織TC分別為(1.41±0.37)、(1.03±0.30)mmol/gprot，TG分別為(2.38±0.39)、(1.81±0.54)mmol/L，兩組比較，P均<0.05。IUGR組、AGA組肝組織Fsp27 mRNA相對表達(dá)量分別為4.35±1.12、2.37±0.75，F(xiàn)sp27蛋白相對表達(dá)量分別為1.19±0.23、0.69±0.16，兩組比較，P均<0.01。結(jié)論 與AGA大鼠相比，IUGR大鼠老年期血漿TC、LDL-C、TG、FFA水平高，血漿HDL-C水平低，肝組織脂肪含量高，這可能與肝組織Fsp27表達(dá)升高有關(guān)。

宮內(nèi)發(fā)育遲緩；脂肪特異性蛋白27；脂代謝紊亂；動物實驗

宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)[1,2]胎兒成年期脂質(zhì)和糖代謝紊亂風(fēng)險增加，各種以代謝紊亂為特點的慢性非傳染性疾病易感性增加[3,4]。誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的DNA分裂因子α樣效應(yīng)子C(CIDEC)，其在嚙齒類動物中被命名為脂肪特異性蛋白27(Fsp27)，是一種與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，可調(diào)控脂肪酸的攝取及脂質(zhì)的合成、聚集、分解等過程[5～8]。但CIDEC/Fsp27是否參與IUGR胎兒成年期脂質(zhì)代謝紊亂的發(fā)生機制未見報道。本研究觀察了IUGR大鼠老年期血脂水平、肝脂肪含量及Fsp27表達(dá)變化，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器 TC、TG檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，F(xiàn)sp27兔單克隆抗體(美國Santa公司)，HRP標(biāo)記驢抗山羊IgG(武漢博士德生物公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，熒光定量PCR儀(德國Biometra公司)，凝膠成像系統(tǒng)(英國UVP公司)，電泳儀(美國BIO-RAD公司)等。

1.2 動物分組及處理 健康成年SD雌性大鼠30只，雄性10只，均由本校SPF實驗動物中心提供。雌雄鼠按2∶1的比例合籠使之交配，根據(jù)有無陰栓確定雌鼠是否受孕。受孕后母鼠隨機分為正常飲食組(10只)和低蛋白飲食組(20只)。正常飲食組予標(biāo)準(zhǔn)配方飼料喂養(yǎng)(蛋白20%，熱量1 583 kJ/100 g)，低蛋白飲食組飼以低蛋白飲食(蛋白8%，熱量1 558 kJ/100 g)[9]。所有孕鼠自然分娩后12 h內(nèi)稱量新生仔鼠體質(zhì)量，精確到0.1 g。正常飲食組孕鼠所生新生雄鼠排除出生體質(zhì)量低于和高于2個標(biāo)準(zhǔn)差者，選取8只納入適于胎齡(AGA)組。低蛋白飲食組孕鼠所生產(chǎn)的新生雄鼠中，選取8只出生體質(zhì)量低于正常飲食組新生鼠出生體質(zhì)量平均值2個標(biāo)準(zhǔn)差者納入IUGR組。 兩組仔鼠出生后均由標(biāo)準(zhǔn)配方飼料喂養(yǎng)的母鼠哺乳，斷乳后均予以標(biāo)準(zhǔn)配方飼料喂養(yǎng)至生后12個月(老年期)。隔夜禁食后處死，立即心腔穿刺采血，靜置15 min后，3 000 r/min離心10 min，分離血漿于-80 ℃保存。同時取部分肝臟標(biāo)本于多聚甲醛中固定，以備石蠟切片所需。剩余部分肝臟標(biāo)本置于-80 ℃保存待測。

1.3 血脂檢測 采用酶法測定兩組血漿LDL-C、TC、游離脂肪酸(FFA)、HDL-C及TG，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及肝TG、TC檢測 將多聚甲醛固定后的肝臟組織塊置于不同濃度梯度乙醇中依次脫水，然后氯仿透明，石蠟包埋后切片(片厚5 μm)，HE染色、封片后光鏡下觀察兩組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。 取肝組織0.1 g，剪碎，置于加有5 mL脂質(zhì)提取液的勻漿器進(jìn)行勻漿，振蕩提取脂質(zhì)，1 800 r/min離心10 min，收集上層有機相溶液，真空干燥箱干燥，用PBS(含1%Triton X-100)500 μL溶解，酶法測定TG和TC。

1.5 肝組織Fsp27檢測 ①Fsp27 mRNA：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法。取大鼠肝臟組織1 g，提取肝細(xì)胞總RNA，分光光度法測定總RNA的濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用Primer3軟件設(shè)計引物序列?；蛞镄蛄校篎sp27正向引物為5′-TGGTGTTGGAGGAAGATGGC-3′，反向引物為5′-CGCTGTTCTGATGGGGACTT-3′;GAPDH正向引物為5′-GGAAAGCTGTGGCGTGATGG-3′，反向引物為5′-TATCCTTGCTGGGCTGGGTG-3′。反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 10 min，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s，總循環(huán)數(shù)40次，最后延伸72 ℃ 10 min。取PCR產(chǎn)物10 μL在10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離后，攝像分析掃描，計算目的基因條帶A值與GAPDH條帶A值的比值，即為Fsp27 mRNA相對表達(dá)量。②Fsp27蛋白：采用Western blotting法。稱取0.1 g肝臟組織標(biāo)本，加入RIPA裂解液裂解30 min后將碎片和裂解液移至1.5 mL離心管中(整個操作在冰上進(jìn)行)，12 000 r/min離心5 min。Bradford法測定蛋白含量。配制十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉1 h后，加入1∶1 000的Fsp27兔單克隆抗體，4 ℃下孵育過夜后，TBST室溫下脫色搖床上洗3次，每次10 min，再用TBS洗1次，10 min。將膜放入辣根過氧化物酶(0.01 L封閉液稀釋)標(biāo)記的1∶2 000二抗的雜交袋內(nèi)，封口，室溫?fù)u床上緩慢搖動1 h。顯色曝光，并用掃描儀進(jìn)行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)測算目標(biāo)條帶的分子質(zhì)量和凈吸光度值。計算目標(biāo)蛋白凈吸光度值與內(nèi)參GAPDH凈吸光度值的比值，即為Fsp27蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠血脂水平比較 結(jié)果見表1。

表1 兩組大鼠血脂水平比較±s)

注：與AGA組相比，#P<0.01。

2.2 兩組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)及肝TG、TC含量比較 AGA組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)、大小正常，胞質(zhì)呈均勻紅染，細(xì)胞內(nèi)少見脂滴及空泡，而IUGR組大鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量大小不等的脂滴及空泡。IUGR組、AGA組大鼠肝組織TC分別為(1.41±0.37)、(1.03±0.30)mmol/gprot，TG分別為(2.38±0.39)、(1.81±0.54)mmol/L，兩組比較，P均<0.05。

2.3 兩組大鼠肝組織Fsp27 mRNA、蛋白比較 IUGR組、AGA組大鼠肝臟組織Fsp27 mRNA相對表達(dá)量分別為4.35±1.12、2.37±0.75，F(xiàn)sp27蛋白相對表達(dá)量分別為1.19±0.23、0.69±0.16，兩組比較，P均<0.01。

3 討論

IUGR是圍產(chǎn)期常見并發(fā)癥之一，10%～15%的胎兒發(fā)生IUGR[1]。流行病學(xué)調(diào)查及動物實驗均證實，IUGR胎兒在生后營養(yǎng)充足的條件下容易伴發(fā)脂質(zhì)和糖代謝紊亂，其慢性非傳染性疾病的患病風(fēng)險增加30%～40%[10，11]。成人疾病的胎兒起源假說[12]認(rèn)為，胎兒在宮內(nèi)暴露于營養(yǎng)不良的環(huán)境時，能預(yù)測到未來環(huán)境可能發(fā)生營養(yǎng)匱乏，從而通過表觀遺傳學(xué)的調(diào)節(jié)來適應(yīng)不良的未來環(huán)境。但這種預(yù)適應(yīng)性改變可能永久性地編程代謝系統(tǒng)，導(dǎo)致IUGR胎兒出生后雖已經(jīng)處于營養(yǎng)充足環(huán)境，但是仍然維持其節(jié)儉基因表型，從而導(dǎo)致脂肪及糖合成代謝相對增加，以致代謝綜合征發(fā)生率明顯增加。

本課題組前期臨床流行病學(xué)調(diào)查證實，部分IUGR胎兒在出生后會出現(xiàn)體質(zhì)量過度追趕，以致他們在7歲時發(fā)生超重及肥胖的風(fēng)險是AGA胎兒的6.7倍[13]。但該研究結(jié)果受限于采集的人體樣本，不能獲得糖和脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)的生化和組織改變證據(jù)。王成斌等[14]利用孕期低熱卡飲食構(gòu)建IUGR新生大鼠模型，出生后大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)增高，脂肪組織中與胰島素抵抗相關(guān)的因子表達(dá)增加。在本研究中，我們采用孕鼠妊娠期全程低蛋白飲食的方法構(gòu)建IUGR新生大鼠模型，觀察到IUGR大鼠生后12個月(老年期)時血脂水平及肝臟脂肪含量明顯高于AGA組，形態(tài)學(xué)觀察也發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯脂滴。表明IUGR大鼠在老年期確實存在脂質(zhì)的代謝紊亂，脂肪合成增加。

近年國內(nèi)外相關(guān)研究[15]表明，機體的脂質(zhì)和糖代謝受大量的細(xì)胞因子調(diào)控。CIDEC/Fsp27是近年新發(fā)現(xiàn)的一種與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的蛋白，其基因定位于3p25，相對分子質(zhì)量為27.3 kD。正常狀態(tài)下，CIDEC/Fsp27主要表達(dá)于成熟的白色脂肪細(xì)胞[7]。CIDEC/Fsp27定位于脂滴表面，參與形成單泡性脂滴，能促進(jìn)TG蓄積，抑制脂肪的分解利用[5,6,16～18]。Singh等[18]研究發(fā)現(xiàn)，敲除體外培養(yǎng)人脂肪細(xì)胞中的CIDEC基因后可促進(jìn)TG的合成。并且CIDEC/Fsp27對于脂肪滴的形態(tài)調(diào)節(jié)也起著重要作用：脂肪細(xì)胞內(nèi)的CIDEC/Fsp27表達(dá)減少時，細(xì)胞內(nèi)的大脂滴破碎為小顆粒，而CIDEC/Fsp27過度表達(dá)則導(dǎo)致脂肪滴體積增加但數(shù)量減少，這證實CIDEC/Fsp27還可通過對脂滴大小的調(diào)節(jié)而導(dǎo)致脂肪細(xì)胞內(nèi)TG含量增加[19]。另有研究[20]認(rèn)為，F(xiàn)sp27對脂滴大小調(diào)節(jié)的機制在于它可限制脂肪酶接近脂肪滴表面，從而降低脂肪酶同大脂肪滴接觸面積而介導(dǎo)脂肪滴的融合。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，雖然CIDEC/Fsp27主要在成熟的白色脂肪細(xì)胞中表達(dá)，在正常肝細(xì)胞中表達(dá)很少甚至不表達(dá)，但是在發(fā)生脂肪肝的患者或?qū)嶒瀯游锏母谓M織中，CIDEC/Fsp27表達(dá)顯著上升[7]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，老年期AGA大鼠肝臟脂肪蓄積較少，同時肝細(xì)胞中Fsp27表達(dá)也較少；反之，老年期IUGR大鼠在發(fā)生脂肪肝的同時，肝細(xì)胞中Fsp27表達(dá)顯著增加，與上述文獻(xiàn)報道相一致。

綜上可見，IUGR大鼠老年期血漿TC、LDL-C、TG、FFA水平高，血漿HDL-C水平低，肝組織脂肪含量高，這可能與肝組織Fsp27表達(dá)升高有關(guān)。

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Blood lipid level, liver fat content and expression changes of fat-specific protein 27 in aged intrauterine growth restriction rats

LEIXiaoping1,ZOULile,DONGWenbin,KANGLan,ZHAOShuai,LUOMei

(1TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To observe the blood lipid level, liver fat content and the expression changes of fat-specific protein 27 (Fsp27) in the aged intrauterine growth restriction (IUGR) rats. Methods A total of 8 newborn IUGR rats (IUGR group) and 8 newborn appropriate-for-gestational-age (AGA) rats (AGA group) were breastfed by their mothers and then were fed on normal diet after weaning until the age of 12 months. The morphology of hepatocyte was observed under optical microscopes. We detected the levels of LDL-C, TC, FFA, HDL-C and TG in the plasma as well as TC and TG in the liver tissues by enzymatic method. We also detected the mRNA and protein expression of Fsp27 in the liver tissues by RT-PCR and Western-blotting, respectively. Results In the plasma of IUGR group and AGA group, the serum TC was respectively (0.57±0.14) and (0.32±0.15) mmol/gprot, LDL-C was respectively (7.16±1.08) and (5.32±0.88) mmol/L, HDL-C was respectively (3.33±0.54) and (4.47±0.71) mmol/L, TG was respectively (2.21±0.23) and (1.66±0.15) mmol/L, FFA was respectively (1.46±0.25) and (1.17±0.21) mmol/L, and significant difference was found between these two groups (allP<0.01). At the age of 12 months, the morphology and size of hepatocyte was normal and the cytoplasm was homogeneous in AGA rats. The hepatocyte cytoplasm of AGA rats had rare lipid droplets and vacuoles, while the IUGR rats had large unequal-sized lipid drops in cytoplasm. In the liver tissues of IUGR group and AGA group, TC was respectively (1.41±0.37) and (1.03±0.30) mmol/gprot, TG was respectively 2.38±0.39 and 1.81±0.54, and significant difference was found between these two groups (allP<0.05). In addition, the mRNA expression of Fsp27 (4.35±1.12) in the IUGR group was significantly higher than that (2.37±0.75) of the AGA group as well as the protein expression [(1.19±0.23) vs (0.69±0.16)] (allP<0.01).Conclusion Compared with the AGA rats, the aged IUGR rats have higher levels of TC, LDL-C, TG and FFA in blood lipids, lower level of HDL-C and higher liver fat content, which may be associated with the higher expression of Fsp27 in liver tissues.

intrauterine growth restriction; fat-specific protein 27; lipid metabolism disorder; animal experiment

國家自然科學(xué)基金資助項目(81401280)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.010

714.51

A

1002-266X(2016)35-0033-04

2016-03-30)