邱朋程， 王 輝， 董 育， 鄭 琳， 林 靜， 謝淑盈， 胡舜杰，陳瑞達(dá)， 應(yīng) 磊， 金可可△

(1． 溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 2． 附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科， 3． 病理生理學(xué)教研室， 浙江 溫州 325000)

?

氫氣預(yù)處理對(duì)離體缺氧-復(fù)氧胸主動(dòng)脈的保護(hù)作用*

邱朋程1+， 王 輝2+， 董 育1， 鄭 琳1， 林 靜1， 謝淑盈1， 胡舜杰1，陳瑞達(dá)1， 應(yīng) 磊3， 金可可3△

(1． 溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 2． 附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科， 3． 病理生理學(xué)教研室， 浙江 溫州 325000)

目的：觀察氫氣對(duì)缺氧-復(fù)氧離體小鼠胸主動(dòng)脈組織結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)作用。方法：90只ICR小鼠隨機(jī)分為6組(n=15)：分別為內(nèi)皮完整未通氫對(duì)照組(Con+E)、去內(nèi)皮未通氫對(duì)照組(Con-E)、內(nèi)皮完整預(yù)通氫組(Pre H2+E)、去內(nèi)皮預(yù)通氫組(Pre H2-E)、內(nèi)皮完整再通氫組(Post H2+E)、去內(nèi)皮再通氫組(Post H2-E)。血管環(huán)缺氧10 min后復(fù)氧以制備缺氧-復(fù)氧模型，氫氣干預(yù)在再通氫組于復(fù)氧后7 min開(kāi)始進(jìn)行，在預(yù)通氫組于缺氧前10 min開(kāi)始。經(jīng)生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)測(cè)定血管環(huán)張力的變化，觀察血管組織及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果：在缺氧-復(fù)氧后，去內(nèi)皮預(yù)通氫組的血管張力保持穩(wěn)定，而去內(nèi)皮未通氫對(duì)照組的血管張力明顯降低(P<0.01)。組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示預(yù)通氫處理的兩組血管組織細(xì)胞形態(tài)均良好，僅局部肌絲紊亂；再通氫處理的兩組血管出現(xiàn)輕度損傷：肌細(xì)胞局灶性溶解、局部肌絲紊亂或消失、核周隙增寬；而未通氫對(duì)照的兩組血管則均出現(xiàn)明顯的內(nèi)膜剝離等改變，肌細(xì)胞彌漫性溶解和線粒體空泡變、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯、核膜皺縮明顯、核周隙增寬、細(xì)胞凋亡明顯。結(jié)論：氫氣預(yù)處理具有維持缺氧-復(fù)氧后血管張力穩(wěn)定及保護(hù)組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的作用，其效果明顯優(yōu)于損傷后的氫氣再干預(yù)。

氫氣；缺氧；復(fù)氧；血管環(huán)；小鼠

hydrogen；hypoxia；reoxygenation；vascular ring；mice

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.013

氫氣具有選擇性抗氧化作用，溶解在液體中可選擇性中

和羥基(·OH)和過(guò)氧亞硝酸根(ONOOˉ)。有研究表明氫氣對(duì)腦、心、肺、腎等[1-3]器官組織的缺血/再灌注損傷具有治療效果，其機(jī)制與其選擇性中和氧化應(yīng)激產(chǎn)物有關(guān)。氧化應(yīng)激可引起血管功能障礙[4]，許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)氫氣在治療心血管疾病方面有改善作用[5]，但氫氣對(duì)血管功能的作用及其機(jī)制尚不明確。本研究采用離體小鼠胸主動(dòng)脈缺氧-復(fù)氧模型，觀察氫氣干預(yù)對(duì)離體缺氧-復(fù)氧胸主動(dòng)脈張力功能的影響和對(duì)組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用，以探索氫氣是否可以通過(guò)對(duì)抗血管氧化應(yīng)激損傷而改善其功能和結(jié)構(gòu)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡健康雄性ICR小鼠，體重(25±5)g，購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑與儀器

混合氣體(溫州市龍灣昌盛氣體有限公司)；重酒石酸去甲腎上腺素(noradrenaline，NE，天津金輝氨基酸有限公司)；乙酰膽堿(acetylcholine，Ach，Sigma公司)；NaCl、KCl、CaCl2、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaHCO3、Glucose均為國(guó)產(chǎn)分析純；Powerlab/8SP生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)和ML870 powerlab(澳大利亞ADIstruments公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠胸主動(dòng)脈環(huán)制備和處理[6]麻醉小鼠后迅速取出胸主動(dòng)脈，置于通有95%O2+5%CO2混合氣的4℃ K-H液中，剪除血管周圍的脂肪和結(jié)締組織，取2～3 mm長(zhǎng)血管環(huán)。將針灸針纏上一層薄棉絮,輕輕穿入血管環(huán)中并轉(zhuǎn)動(dòng)3～4圈[7]可去除內(nèi)皮。

1.3.2 內(nèi)皮完整度測(cè)定 血管環(huán)懸掛在含有K-H液的10 ml浴槽中,連接Powerlab/8SP 生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)記錄血管張力變化。持續(xù)通以95%O2+5%CO2混合氣體,調(diào)節(jié)張力至最適基礎(chǔ)張力值1.0 g[8]，保持(37.0±0.5)℃溫度，穩(wěn)定1 h。加入終濃度為60 mmo1/L的 KCl 重復(fù)刺激2次,檢驗(yàn)血管活性并誘發(fā)最大收縮幅度[9]。清洗3次，待血管環(huán)重新穩(wěn)定后,用終濃度為10-6mol/L的NE刺激血管，以加入藥物后的血管張力變化幅度與NE誘發(fā)最大收縮幅度之間的比率反映血管張力的變化。若再加入10-5mol/L Ach，血管舒張率達(dá)60%以上為內(nèi)皮完整[10]，若幾乎不舒張，則視為內(nèi)皮去除完全[11]。

1.3.3 缺氧復(fù)氧模型建立及分組 K-H液沖洗3次后，靜息30 min待血管張力穩(wěn)定，關(guān)閉95% O2+5% CO2混合氣，改通95% N2+5% CO2混合氣10 min以制造缺氧環(huán)境，重新?lián)Q通95% O2+5% CO2混合氣為復(fù)氧過(guò)程。血管環(huán)隨機(jī)分為6組：內(nèi)皮完整未通氫對(duì)照組(Con+E)、去內(nèi)皮未通氫對(duì)照組(Con-E)、內(nèi)皮完整預(yù)通氫組(Pre H2+E)、去內(nèi)皮預(yù)通氫組(Pre H2-E)、內(nèi)皮完整再通氫組(Post H2+E)、去內(nèi)皮再通氫組(Post H2-E)，每組初始血管數(shù)n=15，但以實(shí)驗(yàn)中實(shí)際有活性血管為準(zhǔn)。血管再通氫處理是在復(fù)氧7 min后加通20%H2+80%N2混合氣，預(yù)通氫處理是在缺氧前10 min開(kāi)始加通20%H2+80%N2混合氣。

1.3.4 病理切片觀察 血管環(huán)標(biāo)本取下后用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋，切片厚5 μm，常規(guī)HE染色并觀察。

1.3.5 透射電鏡觀察 血管環(huán)標(biāo)本取下后切成小于1 mm3的組織塊存于2.5%戊二醛固定，PBS漂洗后用1%鋨酸固定2 h，常規(guī)丙酮脫水后包埋，超薄切片后3%醋酸鈾-枸緣酸鉛雙染色后電鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以中位數(shù)(M)和第25、75位百分位數(shù)描述，兩因素非參數(shù)方差分析用Scheirer-Ray-Hare檢驗(yàn)，兩兩比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 氫氣對(duì)缺氧-復(fù)氧血管張力的影響

缺氧-復(fù)氧后血管張力變化在內(nèi)皮和通氫的交互效應(yīng)上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，在內(nèi)皮主效應(yīng)上無(wú)意義，通氫主效應(yīng)上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中去內(nèi)皮血管環(huán)預(yù)通氫處理較再通氫和未通氫明顯減少?gòu)埩p低(P<0.01，表1)。

Tab. 1 Variety of vascular tension during reoxygenation period from 7 min to 27 min [M(P25, P75)]

GroupnVarietyofvasculartension(%)Con+E14?12．1(?28．3，?7．4)Con?E12?35．4(?46．6，?17．5)PreH2+E110．00(?20．0，0．00)PreH2?E130．00(?3．7，11．1)??##PostH2+E13?4．0(?15．9，0．0)PostH2?E11?25．0(?28．0，?4．6)

Con+E: Endothelium-intact no H2control group; Con-E: Endothelium-rubbed no H2control group; Pre H2+E: Endothelium-intact previous H2group; Pre H2-E: Endothelium-rubbed previous H2group; Post H2+E: Endothelium-intact post H2group; Post H2-E: Endothelium-rubbed post H2group

**P<0.01vscontrol group of same-vascular ring；##P<0.01vspost-hydrogen group of same-vascular ring

2.2 病理組織觀察

缺氧-復(fù)氧后，預(yù)通氫血管的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持良好；再通氫組出現(xiàn)輕度平滑肌條索狀分離；未通氫對(duì)照組的組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，出現(xiàn)明顯的血管內(nèi)膜分離、肌纖維條索狀分離和血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)核碎裂等損傷性變化(圖1，圖1見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅹ)。

2.3 透射電鏡觀察

超微結(jié)構(gòu)顯示預(yù)通氫VSMC僅局部肌絲紊亂；再通氫血管顯示局灶性溶解，局部肌絲紊亂或消失，核周隙擴(kuò)大；而未通氫對(duì)照血管顯示彌漫性溶解和線粒體空泡變，肌絲排列紊亂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯，核膜皺縮明顯，核周隙增寬，凋亡明顯(圖2)。

3 討論

組織細(xì)胞在缺血/再灌注過(guò)程中可產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，當(dāng)其累積量超過(guò)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的清除能力時(shí)，易誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷。近年來(lái)研究表明氫氣可作為一種還原性氣體在體內(nèi)選擇性中和·OH和ONOOˉ而不影響其它介導(dǎo)正常生理過(guò)程的活性氧[12]，并在多種器官缺血/再灌注損傷中起到保護(hù)作用[13]。體外血管缺氧-復(fù)氧可使組織內(nèi)產(chǎn)生大量的·OH和ONOOˉ可引起脂質(zhì)過(guò)氧化損傷細(xì)胞膜及線粒體膜，改變膜的通透性和完整性，引發(fā)鈣超載，是線粒體水腫和功能障礙的重要原因[14]，可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成障礙，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)異常，嚴(yán)重可使DNA斷裂，促進(jìn)細(xì)胞核損傷及細(xì)胞凋亡，參與動(dòng)脈粥樣硬化及再狹窄[15]。

本實(shí)驗(yàn)病理結(jié)果提示預(yù)通氫血管在缺氧-復(fù)氧后保持良好的組織細(xì)胞形態(tài)，未出現(xiàn)因缺氧-復(fù)氧引起的VSMC核碎裂和內(nèi)膜分離等現(xiàn)象。細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示預(yù)通氫VSMC結(jié)構(gòu)及細(xì)胞器無(wú)明顯改變，而未通氫對(duì)照組則發(fā)生線粒體空泡變、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張及核皺縮，細(xì)胞凋亡明顯。光鏡與電鏡結(jié)果一致并提示在血管缺氧-復(fù)氧前預(yù)先給予氫氣處理，對(duì)組織形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)均起良好的保護(hù)作用。此外，預(yù)通氫干預(yù)能較好地穩(wěn)定缺氧-復(fù)氧后去內(nèi)皮血管的張力，而未通氫的血管張力明顯下降。由此推測(cè)氫氣可能不是通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞，而是直接作用于VSMC清除ROS，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)或者作用于離子通道以維持血管張力穩(wěn)定，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。有報(bào)道顯示ROS可以通過(guò)直接損傷血管內(nèi)皮和化學(xué)淬滅兩個(gè)途徑來(lái)削弱NO功能的發(fā)揮，抑制阻力血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)[16]，Sakai T等[17]報(bào)道健康者飲用富氫水后，對(duì)保護(hù)和維持NO介導(dǎo)的正常血管調(diào)節(jié)反應(yīng)有作用。這與本研究現(xiàn)象不同，可能與我們觀察時(shí)間段為復(fù)氧后期，VSMC損傷血管活性降低及NO耗盡有關(guān)。

Fig. 2 Electron microscope photographs for the effect of hydrogen on mice thoracic aorta smooth muscle cell with hypoxia-reoxygenation damage

A: Endothelium-intact no H2control group; B: Endothelium-rubbed no H2control group; C: Endothelium-intact previous H2group; D: Endothelium-intact previous H2group; E: Endothelium-intact post H2group; F: Endothelium-rubbed post H2group

綜上所述，血管缺氧-復(fù)氧后再給予氫氣處理，保護(hù)血管組織細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)作用明顯不如氫氣預(yù)處理，也對(duì)血管張力的維持無(wú)明顯作用。提示對(duì)于血管的氧化性損傷，氫氣預(yù)處理的保護(hù)作用要明顯優(yōu)于其治療作用，說(shuō)明氫氣可能更適合作為心血管疾病的預(yù)防性用藥。

[1] Cai J, Kang Z, Liu WW,etal. Hydrogen therapy reduces apoptosis in neonatal hypoxia-ischemia rat model[J].NeurosciLett, 2008, 441(2): 167-172.

[2] Hayashida K, Sano M, Ohsawa I,etal. Inhalation of hydrogen gas reduces infarct size in the rat model of myocardial ischemia-reperfusion injury[J].BiochemBiophysResCommun, 2008, 373(1): 30-35.

[3] Li H, Zhou R, Liu J,etal. Hydrogen-rich saline attenuates lung ischemia-reperfusion injury in rabbits[J].JSurgRes, 2012, 174(1): e11-16.

[4] Zheng H, Yu YS. Chronic hydrogen-rich saline treatment attenuates vascular dysfunction in spontaneous hypertensive rats[J].BiochemPharmacol, 2012, 83(9): 1269-1277.

[5] Sun Q, Kang Z, Cai J,etal. Hydrogen-rich saline protects myocardium against ischemia/reperfusion injury in rats[J].ExpBiolMed(Maywood), 2009, 234(10): 1212-1219.

[7] Russell A, Watts S. Vascular reactivity of isolated thoracic aorta of the C57BL/6J mouse[J].JPharmacolExpTher, 2000, 294(2): 598-604.

[8] Nakamura T, Saito Y, Ohyama Y,etal. Production of nitric oxide, but not prostacyclin, is reduced in klotho mice[J].JpnJPharmacol, 2002, 89(2): 149-156.

[9] Shen B, Ye CL, Ye KH,etal. Mechanism underlying enhanced endothelium-dependent vasodilatation in thoracic aorta of early stage streptozotocin-induced diabetic mice[J].ActaPharmacolSin, 2003, 24(5): 422-428.

[10]黃 萍, 范小芳, 龐玲霞, 等. Apelin對(duì)大鼠離體肺動(dòng)脈環(huán)的舒張作用及與一氧化氮的關(guān)系[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2011, 27(1): 1-5.

[11]Jiang J, Thoren P, Caligiuri G,etal. Enhanced phenylephrine-induced rhythmic activity in the atherosclerotic mouse aortaviaan increase in opening of KCa channels: relation to Kv channels and nitric oxide[J].BrJPharmacol, 1999, 128(3): 637-646.

[12]Ohta S. Molecular hydrogen as a novel antioxidant: overview of the advantages of hydrogen for medical applications [J].MethodsEnzymol, 2015, 555: 289-317.

[13]Ohta S. Molecular hydrogen as a preventive and therapeutic medical gas: initiation, development and potential of hydrogen medicine[J].PharmacolTher, 2014, 144(1): 1-11.

[14]Noda K, Shigemura N, Tanaka Y,etal. A novel method of preserving cardiac grafts using a hydrogen-rich water bath[J].JHeartLungTransplant, 2013, 32(2): 241-250.[15]Kawai D, Takaki A, Nakatsuka A,etal. Hydrogen-rich water prevents progression of nonalcoholic steatohepatitis and accompanying hepatocarcinogenesis in mice[J].Hepatol, 2012, 56(3): 912-921.

[16]馬 鑫, 高 琴, 李艷芳, 等. 超氧陰離子抑制大鼠腸系膜阻力血管內(nèi)皮依賴性舒張功能[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2008, 24(3): 363-366.

[17]Sakai T, Sato B, Hara K,etal. Consumption of water containing over 3.5 mg of dissolved hydrogen could improve vascular endothelial function[J].VascHealthRiskManag, 2014, 10(10): 591-597.

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LY14H070005)；溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)生科研項(xiàng)目(wyx2015101010, wyx2015101022, wyx2015101048)

2015-05-01

2016-03-01

+： 共同第一作者

R363

A

1000-6834(2016)04-335-04

△【通訊作者】Tel： 13868306996; E-mail: jkk6996@qq.com.