張 凡， 崔瑞勤，黃必勝，李 娟，陳科力，曹 艷

(湖北中醫(yī)藥大學藥學院，湖北 武漢 430065)

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·論 著·

利膽排毒方提取物的高效液相色譜指紋圖譜研究Δ

張 凡*， 崔瑞勤，黃必勝，李 娟，陳科力，曹 艷#

(湖北中醫(yī)藥大學藥學院，湖北 武漢 430065)

目的：探討利膽排毒方提取物的指紋圖譜，為利膽排毒方的物質基礎和質量控制研究提供一定依據。方法：采用Waters Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈(B)-0.1%磷酸+2%四氫呋喃水溶液(A)，梯度洗脫，流速0.8 ml/min，檢測波長248 nm，柱溫35 ℃，采用相關系數法對10批利膽排毒方提取物進行分析。結果：建立了利膽排毒方提取物的高效液相色譜指紋圖譜，標定了19個共有峰，10批樣品的相似度在0.984～0.997之間。結論：建立的方法準確、可靠，可用于利膽排毒方的物質基礎研究和其新制劑開發(fā)時的質量控制。

利膽排毒方； 指紋圖譜； 高效液相色譜法

利膽排毒方由茵陳、梔子、丹參等8味中藥組成，是綜合了大承氣湯和茵陳蒿湯的臨床應用從而加減而成，其醫(yī)院制劑以口服液劑型用于臨床，療效較好，主要用于治療感染、創(chuàng)傷、腸源性內毒素移位和功能性病變引起的內毒素血癥[1-3]。課題組之前的研究以綠原酸為質量控制指標，測定成分單一，而中藥復方是多成分、多靶點協(xié)調發(fā)揮作用的，因此難以全面控制利膽排毒方的質量[4]。目前，中藥指紋圖譜法已成為國際公認的中成藥以及天然藥物實現質量控制的最有效方法[5-6]。高效液相色譜指紋圖譜是目前中藥色譜指紋圖譜研究的首選方法，其所提供的特征信息比其他方法更豐富、全面[7]。有研究對小承氣湯[8]、茵梔黃注射液[9]、四物湯[10]、金茵清熱口服液[11]等均采用了高效液相色譜指紋圖譜的方法進行質量控制，尤其是丹參制劑相關指紋圖譜研究相對成熟[12]，復方丹參滴丸的高效液相色譜指紋圖譜已上升為《中華人民共和國藥典：一部》(2015年版)的標準[13]。本研究對10批次藥材制得的利膽排毒方提取物進行色譜特征譜的分析與探討，為利膽排毒方的內在質量控制提供一種較全面的分析手段。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀(美國戴安公司)；Waters Cosmosil 5C-18-MS-Ⅱ色譜柱(美國Waters公司)；Anke TGL-16G型高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；XS205電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2 藥品與制劑

綠原酸(批號：110753-201314)、梔子苷(批號：110749-201316)、丹酚酸B(批號：111562-201313)均購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈(色譜純，美國Tedia公司)；磷酸(優(yōu)級純)、四氫呋喃(色譜級)均購于國藥集團化學試劑有限公司；利膽排毒方(自制)，10批次藥材分別來自于武漢龍?zhí)┧帢I(yè)有限公司、湖北百草堂藥房連鎖公司、黃家湖醫(yī)院藥房、金世康大藥房、老百姓大藥房，每家各2批次。

2 方法與結果

2.1 供試品的制備

按處方量稱取各味藥材飲片，將大黃、金銀花以外的組分用水煎煮3次，每次20 min，過濾后合并3次濾液，再加入大黃煎煮40～50 min，濾過，濾液濃縮至1/2作為備用液。另取金銀花，用10倍量80%乙醇浸泡24 h后超聲提取2次，每次1 h，過濾合并2次濾液，濾液濃縮至無醇味，得濃縮液。濃縮液轉入備用液中繼續(xù)濃縮至藥液相對密度1.09(約含生藥量0.5 g/ml)，加入95%乙醇至表觀醇沉濃度為50%，于25 ℃下靜置36 h后，5 000 r/min離心10 min，取上清液，回收乙醇，濃縮，真空干燥，得利膽排毒方提取物。密封保存。取適量該提取物，加蒸餾水使其溶解，每毫升相當于原藥材1 g，即得供試品。

2.2 混合對照品的制備

取干燥至恒質量的綠原酸、梔子苷、丹酚酸B對照品分別精密稱取6.14、6.11、8.71 mg，分別置于25 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得每1 ml含綠原酸、梔子苷、丹酚酸B 245.6、244.4、348.4 μg的貯備液。再分別取3種對照品貯備液各3 ml，置于10 ml容量瓶中，定容至刻度，即得混合對照品溶液。

2.3 色譜條件

采用Waters Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流動相A為乙腈，流動相B為(0.1%磷酸+2%四氫呋喃水溶液)，檢測波長248 nm，流速0.8 ml/min，柱溫35 ℃，進樣20 μl。其梯度洗脫程序為：0～18 min，流動相B由90%→85%；>18～20 min，流動相B保持85%；>20～23 min，流動相B由85%→77%；>23～50 min，流動相B保持77%；>50～55 min，流動相B由77%→90%。

2.4 方法學考察

2.4.1 系統(tǒng)適應性：取對照品溶液按測定方法進樣，丹酚酸B的理論塔板數在40 000以上。

2.4.2 精密度試驗：取同一批供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測定高效液相色譜圖。結果表明，各共有峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.77%，相對峰面積的RSD為0.11%～0.36%。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗：取同一批供試品溶液，分別于配制后0、2、4、6、8、24 h進樣分析，測定高效液相色譜圖。結果表明，各共有峰相對保留時間的RSD為0.08%～0.82%，相對峰面積的RSD為0.09%～0.51%。

2.4.4 重復性試驗：取同一批供試品藥材飲片，按“2.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定高效液相色譜圖。結果表明，各共有峰的相對保留時間的RSD為0.02%～0.72%，相對峰面積的RSD為0.09%～0.37%。

2.5 樣品測定

取10批利膽排毒方提取物供試品，按照“2.3”項下的條件進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，見圖1—3。圖1為混合對照品的高效液相色譜圖，圖2為利膽排毒方提取物的對照指紋圖譜，圖3為10批次利膽排毒方的高效液相色譜疊加圖。

圖2 利膽排毒方提取物的對照指紋圖譜Fig 2 Reference fingerprint of extraction of Lidanpaidu prescriptions

圖3 10批次利膽排毒方提取物的高效液相色譜疊加圖Fig 3 HPLC overlay chart of 10 batches of extraction of Lidanpaidu prescriptions

2.6 指紋圖譜的建立

2.6.1 參照物的選擇：高效液相色譜圖中38.9 min時色譜峰的峰面積適中且穩(wěn)定，經與對照品鑒定為丹酚酸B，故選為參照峰(即圖2中16號峰)。

2.6.2 指紋圖譜的建立與相似度評價：采用國家藥典委員會《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2004 A版)，評價10批次利膽排毒方提取物的高效液相色譜圖，確定了19個共有峰(見圖2)，建立了利膽排毒方提取物指紋圖譜的共有模式。取利膽排毒方單位藥材飲片提取樣品，按照相同的高效液相色譜條件分析確定峰的來源[14]。通過對照，確定1、4號峰來源于梔子，2、5、9、11、12、13號峰來源于金銀花，3號峰來源于金銀花、梔子、茵陳，6、10號峰來源于黃芪，7號峰來源于連翹，8、14、15、16、17號峰來源于丹參，18、19號峰來源于大黃，炙甘草對共有峰沒有貢獻。以丹酚酸B為參照峰，其保留時間和峰面積均為1.000，計算其他各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，10批次樣品的相似度分別為0.983、0.993、0.993、0.985、0.984、0.995、0.997、0.990、0.992、0.994，各批次的相似度都在0.98以上，見表1—2。

3 討論

3.1 色譜柱的考察

本實驗考察了WelchromTM色譜柱、Waters Cosmosil 5C-18-MS-Ⅱ色譜柱。結果顯示，Waters Cosmosil 5C-18-MS-Ⅱ色譜柱基線較平穩(wěn)，出峰較多且分離度較好，故選擇Waters Cosmosil 5C-18-MS-Ⅱ色譜柱。

3.2 檢測波長的考察

本實驗對已知對照品與利膽排毒方提取物進行波長掃描，選取230、248、254、290、360 nm 5個波長，分別對利膽排毒方提取物進行分析。結果顯示，230 nm下雖然出峰較多，但基線漂移較為嚴重；254 nm下分離度較差；290與360 nm下色譜峰較少；而在248 nm下，色譜峰較多，用于對照的3個標準品分離度適中，基線比較平穩(wěn)，故選擇248 nm為最佳檢測波長。

3.3 流動相的考察

本實驗考察了甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸+2%四氫呋喃水溶液3種流動相系統(tǒng)。結果顯示，乙腈-0.1%磷酸+2%四氫呋喃水溶液系統(tǒng)基線最為平穩(wěn)，各峰分離度較好，適合高效液相色譜分析，所以最終選擇以乙腈-0.1%磷酸+2%四氫呋喃水溶液為流動相。

表1 10批次利膽排毒方提取物特征圖譜共有峰的相對保留時間

表2 10批次利膽排毒方提取物特征圖譜共有峰的相對峰面積

3.4 指紋圖譜的建立

對10批次利膽排毒方提取物進行相似度分析，結果顯示，其指紋圖譜之間吻合度較高，相對保留時間的RSD均<0.6%，而相對峰面積的RSD卻達到了36.69%，這客觀顯示了中藥復方制劑這一傳統(tǒng)劑型的缺陷，有效成分因為產地、炮制以及煎煮方法和優(yōu)化條件的無法量化而差異較大，因此，中藥復方新劑型的開發(fā)及其質量標準的建立是目前應該思考和解決的問題[15]。雖然有些成分峰表面看上去不明顯，或者部分峰難以分離，但通過高效液相檢測器檢測出各成分間的相對比例較為相似，整體輪廓均符合共有模式，對相似度影響不大，以共有模式作為利膽排毒方制劑質量控制研究的參考依據還是有可行性的，能夠確保產品的相對一致。

3.5 展望

中藥復方的物質基礎研究比較困難，但指紋圖譜可以較為全面和綜合地控制其內在質量，可為復方藥效學、毒理學研究、制劑工藝及質量標準研究提供參考。利膽排毒方提取物指紋圖譜的建立，有望為其新制劑、新劑型的研究開發(fā)提供參考。

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Study on Fingerprint of Lidanpaidu Prescription by HPLCΔ

ZHANG Fan, CUI Ruiqin, HUANG Bisheng, LI Juan, CHEN Keli, CAO Yan

(College of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine,Hubei Wuhan 430065, China)

OBJECTIVE：To probe into the fingerprint of Lidanpaidu prescription, and provide basis for the material foundation and quality control of Lidanpaidu prescription. METHODS: Waters Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ chromatographic column(4.6 mm×250 mm，5 μm)was adopted with the mobile phase of acetonitrile(B)-0.1% phosphate and 2% tetrahydrofuran aqueous solution(A) by gradient elution at flow rate of 0.8 ml/min, detection wavelength of 248 nm and column temperature of 35 ℃. Analysis was conducted on 10 batches of Lidanpaidu extraction by correlation coefficient method. RESULTS: The HPLC fingerprint of Lidanpaidu prescription was established, 19 common peaks were signed, and the similarity threshold of 10 batches of samples were between 0.984-0.997. CONCLUSIONS: The established method is accurate and reliable, and can be used for the study on the chemical material foundation of the formula and the evidence for quality control of Lidanpaidu prescription.

Lidanpaidu prescription; Fingerprint; HPLC

?對照品的高效液相色譜圖 Fig 1 HPLC of mixed

ubstance

湖北省教育廳中青年人才項目資助(No.Q20121610)

R927.11

A

1672-2124(2016)10-1314-04

2016-05-22)

*在讀碩士研究生。研究方向：中藥制劑新劑型新技術的研究。E-mail：249255521@qq.com

#通信作者：博士，副教授。研究方向：中藥制劑新劑型新技術的研究。E-mail：caoyan7593@163.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2016.10.006