陳柏齡，崔昊文，林 燾，肉孜卡熱·依米提，呂 中

基礎(chǔ)研究

骨質(zhì)疏松模型小鼠不同骨密度條件下的基因表達(dá)譜分析

陳柏齡，崔昊文，林 燾，肉孜卡熱·依米提，呂 中

目的探討不同骨密度（bone mineral density，BMD）骨質(zhì)疏松模型小鼠基因表達(dá)譜的差異，分析骨質(zhì)疏松基因表達(dá)譜系的特征。方法采用30只C57BL/6J去勢雌性小鼠建立骨質(zhì)疏松模型，以微計(jì)算機(jī)斷層掃描（Micro-CT）技術(shù)測量其BMD。根據(jù)BMD選取10只小鼠并分為2組：BMD最高的5只小鼠分入H組（high BMD組），BMD最低的5只小鼠分入L組（low BMD組）。應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測兩組骨質(zhì)疏松小鼠基因的表達(dá)，通過Gene Ontology（GO）數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行基因信息學(xué)分析。結(jié)果共篩選出差異表達(dá)基因684條，包含功能明確的基因610條，其中299條表達(dá)上調(diào)、311條表達(dá)下調(diào)。結(jié)論炎癥以及免疫反應(yīng)、細(xì)胞黏附、膠原代謝及骨質(zhì)礦化等相關(guān)基因群的差異表達(dá)，可能對骨質(zhì)疏松小鼠BMD的改變發(fā)揮重要作用。

骨質(zhì)疏松；骨密度；基因表達(dá)譜；疾病模型，動物；小鼠

骨質(zhì)疏松癥是以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)損壞為主要特征，致使骨脆性增加而易于發(fā)生骨折的一種全身性骨病[1]。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜過程，其演進(jìn)過程涉及大量的基因突變、缺失、擴(kuò)增及失活等異常表達(dá)信息[2-3]。基因芯片技術(shù)可以獲得大量的生物學(xué)信息，為在基因水平診斷、預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥提供可能。目前大部分骨質(zhì)疏松相關(guān)的基因芯片研究將重點(diǎn)放在骨質(zhì)疏松患者、動物模型與正常人、動物基因表達(dá)譜差異的探討上[4-6]。而對于非遺傳因素相似的骨質(zhì)疏松患者或動物模型，其骨質(zhì)疏松嚴(yán)重程度事實(shí)上也可存在巨大差別，但還未見與其相關(guān)的表達(dá)譜芯片的研究報(bào)道。本研究利用小鼠全基因組芯片，探討不同骨密度（bone mineral density，BMD）骨質(zhì)疏松小鼠基因表達(dá)譜的變化，并對差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為揭示骨質(zhì)疏松癥的基因調(diào)控機(jī)制提供參考。

1　材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

主要實(shí)驗(yàn)儀器：Latheta LCT-200（Hitachi-Aloka公司，日本），ND1000紫外分光光度計(jì)（NanoDrop公司，美國）。

主要試劑：Mouse Gene Expression v2 4x44K Microarray試劑盒（G4846A，Agilent公司，美國），Gene Expression Hybridization試 劑 盒（5188-5242，Agilent公司，美國），RNasey Mini試劑盒（74106，Qiagen公司，美國）；Trizol（15596-018，Invitrogen公司，美國）；C57BL/6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）完全培養(yǎng)基（MUBMX-90011）、C57BL/6小鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（MUBMX-90021）購自中國蘇州賽業(yè)生物科技有限公司。

1.2骨質(zhì)疏松模型小鼠的建立

C57BL/6J近交系雌性小鼠30只，8周齡左右，SPF級，由中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供（實(shí)驗(yàn)動物合格證號：11400700134037、11400700139179）。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，小鼠被隨機(jī)分為模型組（Ovx組，25只）和假手術(shù)組（Sham組，5只）。1%戊巴比妥鈉麻醉后，對Ovx組采用背部脊柱旁切口雙側(cè)卵巢切除術(shù)，于子宮頸部結(jié)扎后切除卵巢，依次縫合肌層及皮層，碘伏消毒；對Sham組采用相同切口，于卵巢周圍切除相同體積脂肪組織，保留卵巢，縫合傷口。置于SPF級動物房飼養(yǎng)8周后，以微計(jì)算機(jī)斷層掃描（micro-computer tomography，Micro-CT）技術(shù)檢測其腰椎骨BMD。

1.3Micro-CT測量BMD

術(shù)后8周頸髓離斷處死小鼠。取小鼠胸椎下段至骶椎，置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定48 h，其余部位則用于提取小鼠BMSCs。用Latheta LCT-200對制備好的腰椎標(biāo)本進(jìn)行Micro-CT掃描，條件為源電壓55 kV、源電流131 μA、曝光時(shí)間300 ms，分辨率為10 μ m。使用VGStudio MAX V2.2三維重建處理軟件，對脊柱腰椎的Micro-CT掃描圖片進(jìn)行三維圖像重建，選取各組小鼠腰椎體4個(gè)部位重組圖像中的相同位置進(jìn)行BMD定量分析。計(jì)算平均值后，依據(jù)BMD的大小對Ovx組小鼠排序，選取其中BMD最高和最低的骨質(zhì)疏松模型小鼠各5只，分別作為H組（high BMD組）和L組（low BMD組）。

1.4BMSCs體外培養(yǎng)

于多聚甲醛溶液固定小鼠胸椎下段至骶椎后，將小鼠身體其余部分以75%乙醇浸泡5 min，無菌條件下取小鼠雙側(cè)股骨、脛骨，無菌剪鈍性剝離肌肉，用1 mL注射器吸取PBS液反復(fù)沖洗小鼠骨髓腔，沖出骨髓經(jīng)過離心，將細(xì)胞重懸于C57BL/6小鼠BMSCs完全培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后半量換液，72 h后全量換液，以后每2天換液1次，當(dāng)小鼠BMSCs生長密度達(dá)到80%左右時(shí)對其進(jìn)行消化計(jì)數(shù)，按1∶2比例傳代。待小鼠BMD測定完成后，對選出的10只小鼠（L組和H組）和5只Sham組小鼠對應(yīng)的BMSCs進(jìn)行RNA提取和檢測。

1.5RNA提取、純化、質(zhì)檢

將L組和H組的小鼠BMSCs傳至第三代，使用Trizol法分別提取兩組小鼠總RNA。RNA的質(zhì)量通過ND-1000紫外分光光度計(jì)進(jìn)行評估，標(biāo)準(zhǔn)變性凝膠電泳評估RNA完整性。紫外分析及電泳檢測顯示獲得高質(zhì)量的純凈RNA，使用RNasey Mini試劑盒純化總RNA。

1.6標(biāo)記和芯片雜交

將樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用Gene Expression Hybridization試劑盒對其進(jìn)行Cy3-UTP熒光標(biāo)記。采用小鼠4x44K基因表達(dá)譜芯片v2和雜交探針分別進(jìn)行94℃水浴變性后，加入混合探針，置42℃雜交箱中避光雜交16～18 h。按順序用1×SSC+0.2%SDS、0.1×SSC+0.2% SDS、0.1×SSC洗滌，室溫晾干，避光保存于干燥器中。

1.7數(shù)據(jù)分析

使用Agilent Feature Extraction軟件（v11.0.1.1）獲得芯片圖并讀值，得到原始數(shù)據(jù)。使用GeneSpring GX v12.1軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Quantile標(biāo)準(zhǔn)化，而后對經(jīng)過篩選的高質(zhì)量探針進(jìn)一步分析。根據(jù)Benjamini Hochberg FDR方法得到修正的P值（即FDR），進(jìn)行差異基因篩選?；蝻@著性差異表達(dá)的判定標(biāo)準(zhǔn)：Fold Change≥2.0，F(xiàn)DR≤0.05，兩組樣品間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)基因通過散點(diǎn)圖表示（圖3）。使用標(biāo)準(zhǔn)富集計(jì)算方法進(jìn)行Gene Ontology（GO）分析。

2　結(jié)果

2.1小鼠BMD檢測結(jié)果

Sham組小鼠BMD明顯高于Ovx組，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（443±22）vs（332± 24）mg/cm2，P＜0.05]；L組和H組小鼠BMD分別為（298±10）和（365±3）mg/cm2，Sham組、L組和H組各組間BMD差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1　Sham組、L組和H組骨質(zhì)疏松小鼠骨密度 *P＜0.05

2.2RNA提取結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，2組樣品總RNA的18 s和28 s條帶清晰明亮，無明顯的拖尾或彌散，紫外分光光度計(jì)濃度測定結(jié)果顯示，A260/ A280比值符合芯片實(shí)驗(yàn)要求（表1、圖2）。

2.3基因表達(dá)譜結(jié)果分析

2.3.1芯片雜交結(jié)果 芯片掃描結(jié)果顯示芯片信號強(qiáng)度均一、清晰，背景值均勻，結(jié)果可靠。繪制各組信號值的散點(diǎn)分布圖（圖3），位置高于最上方綠線和低于最下方綠線的點(diǎn)分別由上調(diào)和下調(diào)的表達(dá)量Fold Change≥2.0基因信號產(chǎn)生，此部分基因即為差異表達(dá)基因，而大部分基因位于Fold Change lines以內(nèi)，不符合顯著性差異表達(dá)的判定標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.2差異基因表達(dá) 按照設(shè)定的基因顯著性差異表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：Fold Change≥2.0，F(xiàn)DR≤0.05，經(jīng)篩選分析發(fā)現(xiàn)，L組與H組的差異表達(dá)基因共有684條。其中未命名的基因44條，已命名的640條基因中，上調(diào)基因318條、下調(diào)基因322條。差異基因中功能未明確的基因74條，已明確功能的610條基因之中，上調(diào)基因299條、下調(diào)基因311條。

2.3.3差異基因GO分析結(jié)果 在我們發(fā)現(xiàn)的差異基因中，未命名的44條基因主要為功能未明確的基因或相同基因的不同轉(zhuǎn)錄本。針對已命名的640條基因進(jìn)行GO功能分類分析，在L組小鼠BMSCs中上調(diào)表達(dá)的基因主要與炎癥及免疫反應(yīng)（IRG1、IRF7、GATA3、LAG3、ZBP1、CXCL9、CXCL10、GZMB、TNIP3、TNFAIP3）等相關(guān)；下調(diào)表達(dá)的基因主要與細(xì)胞黏附（HAPLN1、NCAM2、CTNNAL1、PCDH9、PCDH18、LAMA3、CLDN1），膠原代謝（IGF1、FGFR2、PTN、ASPN、PRELP、OGN、MMP20、MMP24、COL11A1）及骨質(zhì)礦化（OMD）等活動有關(guān)。

表1　L組和H組骨質(zhì)疏松小鼠樣品RNA基本信息

圖2　L組和H組骨質(zhì)疏松小鼠樣品總RNA電泳圖

圖3　不同骨密度條件下骨質(zhì)疏松小鼠基因表達(dá)散點(diǎn)圖

3　討論

全基因組表達(dá)譜芯片作為一種高通量、快速、平行的基因表達(dá)信息分析技術(shù)，能同時(shí)進(jìn)行疾病多基因的高密度檢測，已用于多種疾病相關(guān)基因的篩選。現(xiàn)階段很多國內(nèi)外學(xué)者利用這一技術(shù)，在全基因組水平，進(jìn)行了大樣本量的關(guān)聯(lián)分析[2,7]。作為一種由遺傳因素和環(huán)境效應(yīng)共同決定的多基因疾病，骨質(zhì)疏松癥在人群中表現(xiàn)出顯著的遺傳異質(zhì)性[8]。而BMD仍是當(dāng)前診斷骨質(zhì)疏松癥、預(yù)測骨質(zhì)疏松性骨折風(fēng)險(xiǎn)、監(jiān)測自然病程以及評價(jià)藥物干預(yù)療效的最佳定量指標(biāo)[9]。在臨床工作中我們發(fā)現(xiàn)，具備相似生存環(huán)境、生活習(xí)慣和既往病史等的骨質(zhì)疏松患者，其BMD可以存在巨大差別，特別是停經(jīng)時(shí)長相近、非遺傳因素相似的中老年女性患者，有些BMD正?；騼H表現(xiàn)為骨量減少，有些則出現(xiàn)嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松。在本研究中，我們建立了骨質(zhì)疏松模型小鼠，篩選相同條件下BMD差別最大的10只小鼠（BMD最高和最低小鼠各5只），提取其BMSCs并探索相關(guān)基因表達(dá)譜系的變化，然后對差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以探討在排除雌激素干擾的情況下，骨質(zhì)疏松相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制。

我們發(fā)現(xiàn)，不同BMD的兩組骨質(zhì)疏松小鼠共有610個(gè)已明確功能的差異表達(dá)基因，其中299條基因上調(diào)表達(dá)、311條基因下調(diào)表達(dá)。經(jīng)GO分析后發(fā)現(xiàn)，在L組小鼠BMSCs中上調(diào)表達(dá)的基因主要與炎癥以及免疫反應(yīng)等相關(guān)；下調(diào)表達(dá)的基因主要與細(xì)胞黏附、膠原代謝及骨質(zhì)礦化等活動有關(guān)。

多種細(xì)胞黏附相關(guān)基因（HAPLN1、NCAM2、CTNNAL1、PCDH9、PCDH18、LAMA3、CLDN1）在L組小鼠BMSCs表達(dá)明顯減低。骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要機(jī)制之一是成骨細(xì)胞數(shù)量及功能的降低，骨代謝過程中骨形成與骨吸收失衡，骨吸收處于優(yōu)勢，導(dǎo)致骨量減少[10]。黏附作用是BMSCs發(fā)揮其增殖和成骨分化作用的前提。在多種細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子引導(dǎo)下，BMSCs于骨組織表面黏附，并在生長因子的作用下增殖分化為成骨細(xì)胞，分泌鈣基質(zhì)，最終礦化成骨[11]。據(jù)此推測，這可能是排除雌激素干擾下，骨質(zhì)疏松小鼠BMD明顯減低的重要調(diào)控機(jī)制。

膠原代謝相關(guān)的基因（IGF1、FGFR2、PTN、ASPN、 PRELP、OGN、 MMP20、MMP24、COL11A1）及骨質(zhì)礦化相關(guān)的基因（OMD）在L組小鼠BMSCs表達(dá)呈明顯下調(diào)。膠原在人體骨有機(jī)基質(zhì)中占90%，骨的穩(wěn)定性、可塑性等基本特征歸因于膠原，其賦予骨高抗張強(qiáng)度；更重要的是，膠原還提供礦鹽結(jié)晶的基質(zhì)，而礦鹽結(jié)晶則賦予骨高抗壓硬度。對于骨膠原纖維含量低的骨板，其骨鹽含量也低，表現(xiàn)出低BMD[12-13]。

多種炎癥以及免疫相關(guān)的基因（IRG1、IRF7、GATA3、LAG3、ZBP1、CXCL9、CXCL10、GZMB、TNIP3、TNFAIP3）在L組小鼠BMSCs出現(xiàn)明顯上調(diào)表達(dá)。而炎癥、自身免疫性疾病與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系，研究者們已早有認(rèn)識。此類疾病均伴有全身或局部的骨量改變，而T淋巴細(xì)胞及其產(chǎn)物是BMSCs增殖、成骨和破骨分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素[14-15]；也有學(xué)者提出“骨免疫學(xué)（osteoimmunology）”的概念，認(rèn)為在骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展過程中，免疫系統(tǒng)和免疫因素發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[16-17]。本研究顯示，這些炎癥以及免疫相關(guān)的基因可能對無雌激素影響下骨質(zhì)疏松小鼠BMD的變化起到重要作用。

綜合以上結(jié)果，我們分析得出，骨質(zhì)疏松模型小鼠表現(xiàn)出不同的BMD，可能是由于炎癥以及免疫反應(yīng)、細(xì)胞黏附、膠原代謝及骨質(zhì)礦化等過程相關(guān)基因群的異常表達(dá)所致。

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（本文編輯：白朝暉）

Analysis of gene expression profiles in mice with osteoporosis under the conditions of different bone mineral density

CHEN Bailing,CUI Haowen,LIN Tao,Rouzikare·Yimiti,LV Zhong.Department of Spinal Surgery,the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou,Guandong 510080,China

Objective To investigate the differences of the gene expression profiles in mice with osteoporosis under the conditions of different bone mineral density(BMD),and to analyze the characteristics of the osteoporotic gene expression profiles.Methods Osteoporotic model was established by applying 30 ovariectomized C57BL/6J female mice,which BMD were measured through micro computed tomography (Micro-CT)subsequently.According to BMD,10 mice were selected and divided into two groups,5 mice with the highest BMD were in H group and 5 mice with the lowest BMD were in L group.Gene chips were used to investigate the gene expression of osteoporotic mice in two groups,and the differential expression genes were analyzed through Gene Ontology(GO)database.Results A total of 684 genes expressed in osteoporotic mice with different BMD were screened out,comprising 610 known genes,among which,up-and down-regulatedgenes were 299 and 311,respectively.Conclusion Many abnormal expression gene groups,which involved in inflammatory and immune response,cell adhesion,collagen metabolism and bone mineralization,might play important roles in the changes of BMD in osteoporotic mice.

Osteoporosis;Bone density;Gene expression profiles;Disease models,animal;Mice

R681.4，R394.36

A

1674-666X(2016)05-309-06

10.3969/j.issn.1674-666X.2016.05.009

國家自然科學(xué)基金（31570976）

510080廣州，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院脊柱外科

E-mail：chenbl2012@163.com

（2016-08-19；

2016-09-22）