王譯偉，陳治梁

(四川醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，四川 瀘州 646000)

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膠原蛋白提取工藝和臨床應用進展

王譯偉，陳治梁

(四川醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，四川 瀘州 646000)

摘要：指出了膠原蛋白是一種功能性蛋白，應用廣泛。簡要概述了膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和提取，對膠原蛋白的臨床應用及其成效進行了著重介紹，并展望了今后膠原蛋白的研究前景和應用趨勢。

關(guān)鍵詞：膠原蛋白；臨床應用；成效；進展

1引言

膠原蛋白是一種白色、不透明、無支鏈的纖維蛋白質(zhì)，主要存在于動物的皮、骨、軟骨、肌腱和韌帶等中，是結(jié)締組織極其重要的結(jié)構(gòu)蛋白，起著支撐器官、保護機體的作用[1]。皮膚是所有動物的最大的器官，也是膠原蛋白最豐富的蘊藏之處；在真皮蛋白質(zhì)中，膠原蛋白占85%～90%[2]。

國家統(tǒng)計局資料顯示，2010年全國肉類總產(chǎn)量7 925萬t，其中，豬肉產(chǎn)量5 070萬t(64.20%)；牛肉產(chǎn)量653萬t(9.50%)；羊肉產(chǎn)量398萬t(6.45%)，然而，目前我國的豬皮除少量制成皮革外，絕大部分沒得到合理利用。例如大部分牛羊皮被用于皮革業(yè)，但在加工過程中仍然會產(chǎn)生大量的下腳料。再者，我國也是漁業(yè)大國，商品加工過程中也產(chǎn)生大量廢料，如魚皮、魚鱗、魚鰭、魚尾、魚骨等，約占原料魚質(zhì)量的40%～55%。如能從這些廢棄物中提取膠原蛋白加以利用，不僅能夠減少環(huán)境污染，而且也是一種新型膠原資源的開發(fā)途徑。膠原蛋白被廣泛的應用于食品、營養(yǎng)保健、美容以及生物醫(yī)學材料等諸多領(lǐng)域，其提取、性能和應用等方面的研究也一直備受關(guān)注。本文主要對膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及臨床應用成效進行了概述，并展望了今后膠原蛋白的研究應用趨勢。

2膠原蛋白的結(jié)構(gòu)

膠原蛋白是一個龐大的家族，種類繁多，機構(gòu)高度復雜[3]，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅺ5種類型[5]?，F(xiàn)以動物體內(nèi)含量最多、分布最廣的Ⅰ型膠原蛋白為例介紹其各級結(jié)構(gòu)：一級結(jié)構(gòu)是組成膠原蛋白多肽鏈的氨基酸序列，每條肽鏈的相對分子質(zhì)量約為10萬，由1 052個氨基酸殘基組成，直徑約1.5 nm，長300 nm，螺旋區(qū)含有388個(Gly—X—Y)重復序列，X常為脯氨酸，Y常羥脯氨酸或羥賴氨酸，其中脯氨酸是膠原特有的氨基酸。二級結(jié)構(gòu)是膠原蛋白多肽鏈的左手螺旋，螺距為0.87 nm，每轉(zhuǎn)一圈約有3.3個氨基酸殘基，這是因為a鏈中吡咯環(huán)的存在使N—C鍵不能自由旋轉(zhuǎn)。三級結(jié)構(gòu)是3條具有二級結(jié)構(gòu)的多肽鏈依靠側(cè)鏈殘基相連并相互纏繞形成一個在中心分子軸周圍的右手三股份螺旋，螺距96 nm，每圈友36個氨基酸殘基[2，4，6，7]。具有完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)的膠原才能發(fā)揮其功效。

3膠原蛋白的功能

膠原蛋白具有許多獨特的生化性質(zhì)和生理功能。

3.1靜電學性能

膠原分子約有240個賴氨酸、羥賴氨酸和精氨酸的氨基和胍基，以及230個天門冬氨酸和谷氨酸的羧基。這些基團在生理條件下都帶電荷，通過改變環(huán)境的pH值可以改變膠原纖維內(nèi)靜電狀態(tài)[3]。

3.2離子和大分子結(jié)合性能

在自然狀態(tài)和生理條件下，膠原分子約有60個自由羧基，其有結(jié)合陽離子(如鈣)的能力，并在易溶鹽(如硫氰酸鉀)存在時，該性能將會提高。

3.3成纖維性能

天然的膠原在組織中以特定的順序組織起來,具有良好的細胞適應性，加速細胞增殖和促進傷口愈合的作用[8]。

3.4止血功能

膠原蛋白有具有良好的凝聚能力，能夠促進血小板黏附于其表面，誘導血小板釋放，進而產(chǎn)生止血栓。

3.5細胞功能調(diào)節(jié)性能

在細胞外基質(zhì)(ECM)與細胞膜成分之間的相互作用關(guān)系中,膠原蛋白能直接與細胞膜受體或間接與ECM中的糖蛋白或糖胺聚糖作用,從而對細胞膜受體施加影響以達到參與細胞行為的調(diào)控作用[9]。

3.6低免疫原性

膠原雖然是大分子物質(zhì)，但結(jié)構(gòu)重復性大，與其它具有免疫性的蛋白質(zhì)相比，其免疫原性非常低。因而慢性排斥反應少見[10]。

3.7可生物降解性

膠原肽鍵能在膠原蛋白酶的水解作用下被打斷，螺旋結(jié)構(gòu)隨之破壞，這樣膠原蛋白就可以被蛋白酶徹底水解。

3.8促進骨的形成

食膠原多肽，可增強低鈣水平下的骨膠原結(jié)構(gòu)，從而提高骨強度，達到促進骨形成的作用。

3.9增強皮膚代謝作用

纖維細胞、脂肪細胞及毛細血管向植入膠原蛋白的部位移動，并組合成自身膠原蛋白，從而形成新的正常的結(jié)締組織，活化真皮。

4膠原蛋白的提取

對膠原蛋白的提取研究，最早來自魚類膠原的研究，可追溯至20世紀50年代。其后，陸續(xù)有了學者開展了對動物中膠原蛋白提取技術(shù)的研究。膠原蛋白的提取工藝過程大致包括選材、除雜、溶出和純化；提取方法有酸法、減法、鹽法、酶法以及上述各發(fā)的混合使用等[1～3]。各種方法根據(jù)條件的不同，所得的膠原蛋白產(chǎn)物可分為膠原、明膠和水解膠原蛋白。它們雖然具有同源性，但在結(jié)構(gòu)和性能上卻有很大差異：在低溫下提取得到的膠原，仍然保持三股螺旋結(jié)構(gòu)，形成的膜具有較好的柔韌性、彈性和強度，在模擬生理條件下能再形成纖維，明顯激活細胞的生長。明膠能成凍、成膜，但明膠膜性脆、強度較差。水解膠原蛋白是多肽混合物且不能成膜。明膠和水解膠原蛋白均不能再度形成纖維，而且細胞生長實驗證明，它們不具有促進細胞生長的性質(zhì)，即明膠和水解膠原蛋白不具有生物活性[10]。因此，提取方法成功的關(guān)鍵在于能使膠原不致過度水解成明膠，保證所提取膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)的完整。

(1)酸法[2]提取是用酸浸泡預處理后的材料，再經(jīng)離心等操作提純的提取方法。常用的酸有：乙酸、鹽酸、草酸、檸檬酸、醋酸以及乳酸等，主要是利用低離子濃度酸性條件破壞分子間鹽鍵和Schiff堿，從而引起纖維膨脹，降低膠原內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)間的連接作用，最終使其溶解，但是其溶解量很少。

(2)堿法多用于從皮革廢棄物中提取膠原蛋白，其中最關(guān)鍵的是脫鉻。該法操作簡便，水解作用強，脫鉻率比酸法高，但只能得到相對分子量較小的水解膠原蛋白，應用價值并不太高。若堿對肽鍵水解非常嚴重的話，還會產(chǎn)生D型氨基酸消旋混合物，即旋光性化合物。而有些D型氨基酸是有毒的，甚至有致癌、致畸和致突變作用[2，3]。顯然，要得到具有三螺旋結(jié)構(gòu)的活性膠原蛋白，并用于食品醫(yī)藥生產(chǎn)，堿法幾乎是不可取的。

(3)膠原蛋白作為蛋白質(zhì)的一種，也具有鹽溶和鹽析性質(zhì)。依據(jù)不同類型膠原蛋白溶解度與NaCl濃度的關(guān)系，可采取鹽法對混合膠原蛋白進行分離。常用的中性鹽主要有鹽酸-三羥甲基氨基甲烷、NaCl、檸檬酸鹽等。中性鹽種類對膠原蛋白的溶解和鹽析影響較大，有的鹽可以提高膠原蛋白的穩(wěn)定性，而有的則可降低膠原蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定性[3]，加之提取率不是很理想，因此該方法沒得到普及。

(4)酶具有特異性和高效性，能快速準確的提取膠原蛋白；不同的原料選擇酶類和確定酶解的最佳條件組合，是提高工業(yè)生產(chǎn)膠原蛋白量的關(guān)鍵。酶的種類有胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、鳳梨酶等。其中胃蛋白酶最常用，且只作用于膠原的端肽，不影響螺旋區(qū)段，保持了膠原的生物學特性，又能使膠原從皮組織中溶出[6]。其最佳條件主要有酶解溫度、pH值、時間、酶量以及酶和原料的理化狀態(tài)等。該法節(jié)約原材料，能大大提高膠原蛋白的品質(zhì)和創(chuàng)造了更豐厚的利潤，使得其在科學研究和工業(yè)生產(chǎn)中使用最為普遍。

5膠原蛋白的臨床研究、應用及其成就

(1)臨床應用。針對臨床應用的適宜性和可操作性，膠原蛋白經(jīng)不同的加工工藝制備成不同劑型的膠原蛋白生物材料。目前，應用較多的劑型有膜劑型、多孔基質(zhì)、凝膠劑型、溶液劑型、纖維狀劑型、管狀劑型、復合劑型。1976年美國將膠原蛋白制品列入醫(yī)療器械進行管理及審批并批準上市，近30年來膠原蛋白制品及其膠原蛋白基生物醫(yī)用材料在臨床上的應用正與日俱增[7]。如膜片型膠原在燒傷整形科用作人工皮膚，腦外科替代硬腦膜，普外擴增與修復聲帶，眼耳鼻喉科替換鼓膜、移植角膜；管型膠原能引導引導周圍神經(jīng)再生而被用于神經(jīng)外科，管型還是心血管外科的良好人造血管移植物；凝膠型膠原于泌尿外科可輔助治療尿失禁、修復腎；海綿型作為傷口敷料在各大科室應用廣泛；顆粒型用途較多，可作為藥物輸送載體、生長因子和生物活性大分子輸送載體、組織和器官再生的細胞載體；溶液型在各科主要用作膠原涂層；復合型也常制成各種組織用于相應的科室。

(2)膠原蛋白與臨床止血。手術(shù)創(chuàng)傷必然會引起不同程度的出血和滲血，血海綿狀的膠原蛋白制品具有良好的滲水和吸水能力，可吸附大量血液，從而對滲血表面造成局部壓迫，達到止血目的。海綿狀框架可被紅細胞填塞，引起血小板凝集和纖維蛋白原沉積，貼敷在血管破損處堵塞血液外流，促進血栓形成，加速局部血液凝固；它可引起血管痙攣，促使血栓形成，起到血管栓塞的作用；膠原蛋白海綿還可促使血小板破裂，釋放出凝血激活酶，加速凝血；它還有支架作用，使血塊不易脫落而止血。同時，膠原蛋白對創(chuàng)面有很好的黏附性，能與組織緊密粘連在一起，一般情況下只需較短時間的壓迫就可達到滿意的止血效果，使用十分方便。而且膠原蛋白海綿無異物反應，降解速度也非?？臁Ｒ虼伺c其它止血材料單純的止血作用相比，膠原蛋白在促進組織再生和功能恢復方面也具有獨特的效果[7～11]。

(2)膠原蛋白與美容。具有三股螺旋結(jié)構(gòu)的膠原蛋白分子相互交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)后，與彈力蛋白及多糖類形成富有彈性的結(jié)締組織，提供支持、保護功能及各種機械性質(zhì)，并賦予皮膚彈性與強度。膠原蛋白的生物兼容性使植入的分散膠原蛋白分子具有柔軟性、粘性，從而停留在植入部，持續(xù)修補效果；數(shù)月后，人體的結(jié)締組織能同化植入的膠原蛋白，使其成為人體組織的一部分。又由于膠原蛋白具有生物分解性，能被體內(nèi)的膠原蛋白酶分解，而不至于永久留在植入部。自2009年11月至2010年5月，金寶玉[12]等采用雙美膠原蛋白對30例求美者面部行面部年輕化填充治療，效果滿意且沒產(chǎn)生過敏反應或嚴重的并發(fā)癥。

(3)膠原蛋白及其改性產(chǎn)物也已大量用于制備生物敷料，如將膠原蛋白覆蓋在燒、燙傷病患的傷口上，可促進表皮細胞的移人與生長，利于傷口的愈合，可大幅縮短愈合時間，提高燒傷病人的存活能力。馬慧軍[13]等的膠原蛋白凝膠促皮膚創(chuàng)面修復的臨床研究結(jié)果表明為，膠原蛋白凝膠可促進美容性皮膚創(chuàng)面的修復，減少創(chuàng)面色素沉著發(fā)生，療效好，安全性高，值得臨床大力推廣應用。

(4)膠原蛋白可用于治療皺紋等其他美容治療。隨著年齡增長膠原蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，成纖維細胞合成能力降低，皮膚中膠原蛋白缺乏，導致皮膚失去彈性并變薄，同時可導致真皮的纖維斷裂、脂肪萎縮、汗腺及皮脂腺分泌減少，皮膚出現(xiàn)皺紋、皮膚松弛、干燥等老化現(xiàn)象。祝霞[14]等就用膠原蛋白液治療人眼周皮膚皺紋，取得了良好的效果。

6展望

盡管膠原蛋白具有諸多良好的理化性質(zhì)和生物學性能，但必須清醒地看到其本身的不足和缺陷。如膠原蛋白的抗原性仍然存在，即使很低，有臨床應用研究表明，少數(shù)患者對膠原制品有輕微的過敏反應。為了使膠原蛋白及其制品更安全有效的造福人類，科研工作者們將繼續(xù)用物理或化學方法交聯(lián)和修飾膠原蛋白，增強純化后天然膠原蛋白的性能，提高和改善其它性能。目前，不少科研人員正致力于尋找高產(chǎn)率、清潔化的膠原蛋白提取方法，為研究其性能和應用提供更有利的條件?？傊?，優(yōu)化膠原蛋白提取工藝、改善膠原蛋白各種性能將繼續(xù)備受廣泛關(guān)注。又由于膠原蛋白制品及其衍生產(chǎn)物具有巨大的市場發(fā)展空間和潛力，其在高附加值領(lǐng)域(如食品、醫(yī)藥材料工業(yè))的應用研究將必然成為今后的熱點和重點。

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Progress of Extraction Technologyand Clinical Application of Collagen

Wang Yiwei,Chen Zhiliang

(CollegeofPreclinicalMedicine,SichuanMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Abstract:Collagen is a kind of functional proteins,which is applied diffusely.Based on a brief introduction about the structure,function,and extraction of collagen,the article emphatically introducesthe clinical applications and achievements of collagen.Moreover,the article forecaststhe future research prospects and tendency of application.

Key words:collagen; clinical application; effect; progress

文章編號：1674-9944(2016)02-0180-03

中圖分類號：TS59

文獻標識碼：A

作者簡介：王譯偉(1984—)，女，四川瀘州人，講師，主要從事有機化學和量子化學研究。

收稿日期：2015-12-08