樊紅秀，劉鴻鋮，董 欣，張艷榮

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

玉米環(huán)二肽（組氨酸-脯氨酸）的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其生物活性

樊紅秀，劉鴻鋮，董 欣，張艷榮*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

環(huán)二肽（組氨酸-脯氨酸）（cyclo (His-Pro)，CHP）是一種活性環(huán)二肽，在降血糖、抗氧化方面具有顯著效果。實(shí)驗(yàn)通過(guò)DE-52陰離子交換層析、Sephadex G-25凝膠層析、半制備型高效液相色譜等方法，對(duì)高溫高壓環(huán)化后的玉米蛋白水解物進(jìn)行分離純化研究，得到CHP。采用超高效液相色譜、傅里葉變換紅外光譜、核磁共振氫譜和碳譜對(duì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，并通過(guò)體外降血糖和抗氧化實(shí)驗(yàn)初步測(cè)定了其生物活性。結(jié)果表明：采用本研究的分離純化方法制備得到的CHP的純度為97.36%，傅里葉變換紅外光譜和核磁共振波譜的測(cè)定表明該肽的結(jié)構(gòu)與預(yù)期結(jié)構(gòu)相符，初步的生理活性鑒定結(jié)果表明，玉米CHP經(jīng)分離純化后對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性具有很強(qiáng)抑制能力，半抑制濃度（IC50）分別為1.1、1.9 mg/mL；且具有很強(qiáng)的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除活性（IC5067 μg/mL）和還原力。

環(huán)二肽（組氨酸-脯氨酸）；玉米蛋白；分離純化；結(jié)構(gòu)鑒定

環(huán)二肽（組氨酸-脯氨酸）（cyclo (His-Pro)，CHP）是一種活性環(huán)二肽，廣泛分布于人和動(dòng)物的組織和體液中[1]，在抗糖尿病、抗氧化、預(yù)防肥胖等方面有明顯效果[2-5]。CHP是內(nèi)源性環(huán)二肽，由促甲狀腺素釋放激素，經(jīng)氨肽酶水解脫去焦谷氨酸后環(huán)化而成[6]。但天然存在的CHP在動(dòng)物體內(nèi)含量極低，且原料成本較高，難以實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn)供給所需，人工化學(xué)合成的CHP成本昂貴且毒性大。近幾年人們發(fā)現(xiàn)從某些多肽或蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物中可以得到CHP[7]。Minelli等[8]從一些富含蛋白質(zhì)的加工食品，如牛奶、火腿、干制蝦、金槍魚(yú)罐頭以及營(yíng)養(yǎng)保健品中發(fā)現(xiàn)了CHP，其含量是人體血漿的5～1 500 倍，這些CHP被認(rèn)為是在蛋白質(zhì)水解過(guò)程中釋放出來(lái)的。Choi等[9]發(fā)現(xiàn)乙醇回流后的大豆蛋白水解物中含有大量的CHP活性肽。通過(guò)酶解食源性蛋白質(zhì)獲得的CHP不僅安全性好、生物活性高，而且來(lái)源廣泛、成本低廉，易于工業(yè)化生產(chǎn)，越來(lái)越受到業(yè)內(nèi)學(xué)者及行業(yè)的關(guān)注[10-11]。

本研究以玉米黃粉為原料，通過(guò)可控酶解和高溫高壓環(huán)化技術(shù)制備CHP。在之前的研究中通過(guò)對(duì)酶解工藝和高溫高壓環(huán)化反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到了富含CHP的玉米蛋白水解產(chǎn)物。但初始水解物中CHP濃度很低，功能活性差，這限制了CHP的高附加值利用。在實(shí)際應(yīng)用中，根據(jù)在食品、保健品或者醫(yī)學(xué)上對(duì)CHP純度的不同要求，需要采用不同的分離手段對(duì)其進(jìn)行分離純化，此外，CHP的分離純化也成為制約進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)及功能的關(guān)鍵所在。尤其是利用酶解技術(shù)得到的小分子肽中，成分非常復(fù)雜，分子質(zhì)量分布多樣，其中有些雜質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)和目標(biāo)產(chǎn)物接近，這就給CHP的分離純化帶來(lái)很大困難。本研究借鑒目前新的色譜分離技術(shù)和手段，綜合運(yùn)用離子交換色譜、凝膠色譜和超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）技術(shù)，在定量跟蹤的基礎(chǔ)上從酶解液中分離富集CHP，首次建立了一套可大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化富集CHP的分離純化體系；綜合運(yùn)用傅里葉變換紅外光譜、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，完成其結(jié)構(gòu)鑒定，最終得到純度95%以上的玉米CHP，并初步探究了玉米CHP的活性，本研究建立從蛋白水解物中分離純化玉米CHP的方法，為玉米黃粉的深度開(kāi)發(fā)利用以及玉米蛋白CHP的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米黃粉（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)55.76%） 黃龍食品工業(yè)有限公司。

DE-52陰離子交換纖維素 英國(guó)Waterman公司；Sephadex G-25葡聚糖凝膠 北京索萊寶有限公司；α-葡萄糖苷酶（來(lái)自酵母，酶活力50 000U/g） 上海葉源生物有限公司；α-淀粉酶（來(lái)自豬胰腺，酶活力50 000 U/g）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA，純度98%）、1,1-二苯基-2-硝基苦肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl hydrate，DPPH） 美國(guó)Sigma公司；堿性蛋白酶（酶活力286 000 U/mL）、風(fēng)味蛋白酶（酶活力247 000 U/g）（均為食品級(jí)） 丹麥諾維信公司；CHP標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%） 上海吉爾生化有限公司；乙腈（色譜純） 美國(guó)Fisher公司；蒸餾水 廣州屈臣氏有限公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒 中生北控生物科技股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AVANCE 600超導(dǎo)脈沖傅里葉變換-NMR波譜儀瑞士布魯克公司；IR Prestige-21傅里葉變換紅外光譜儀、LC-6AD半制備液相色譜儀（包括LC-6AD并聯(lián)雙柱塞泵、紫外檢測(cè)器、LabSolutions色譜工作站）日本島津公司；Acquity H-Class UPLC儀（包括二極管陣列檢測(cè)器、Sample Mananger FTN自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower色譜工作站） 美國(guó)Waters公司；PHS-3BW電腦數(shù)顯酸度計(jì) 上海理達(dá)儀器廠；DZKW-4電子恒溫水浴鍋北京市中興偉業(yè)儀器有限公司；Alpha 1-4 LDplus凍干機(jī)德國(guó)Marin Christ公司；KDC-1402低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；HYP-1004消化爐 上海纖檢儀器有限公司；LDZM-80KCS-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；SPECTRA-MAX190酶標(biāo)儀美國(guó)Molecular Devices公司；TV-1901雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；DBS-100電腦全自動(dòng)部分收集器 上海嘉鵬科技有限公司；HDL-A紫外檢測(cè)儀 上海金達(dá)生化儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米黃粉中γ-醇溶蛋白的提取

參考Malumba[12]和Gupta[13]等的方法，將脫脂玉米黃粉與60%乙醇溶液按照1∶10的料液比（m/V）混合，于室溫條件下200 r/min攪拌90 min，3 800 r/min離心15 min，分別收集上清液和沉淀。對(duì)沉淀進(jìn)行3 次上述操作，上清液即為α-和β-醇溶蛋白；沉淀去除α-和β-醇溶蛋白后，按照1∶10的料液比加入70%乙醇溶液（含0.5%乙酸鈉和0.6%巰基乙醇），室溫條件下攪拌90 min，3 800 r/min離心15 min，收集上清液。對(duì)沉淀進(jìn)行3 次上述操作，上清液減壓濃縮后，蒸餾水透析，真空干燥得到γ-醇溶蛋白，作為制備CHP的原料。

1.3.2 富含CHP的玉米蛋白水解物的制備

1.3.2.1 γ-醇溶蛋白水解液的制備

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化得到的最佳酶解條件進(jìn)行制備[14]，稱取一定質(zhì)量的γ-醇溶蛋白并加水混合，使γ-醇溶蛋白終質(zhì)量濃度為50 mg/mL，在90 ℃水浴中預(yù)處理10 min，使γ-醇溶蛋白變性，酶解位點(diǎn)暴露出來(lái)，方便酶進(jìn)行酶解。調(diào)節(jié)溫度至55 ℃，同時(shí)調(diào)節(jié)溶液pH值為8.0，加入堿性蛋白酶（加入量為12 100 U/g底物），水解6.5 h。然后調(diào)節(jié)pH值至7.5，加入風(fēng)味蛋白酶（加入量為17 000 U/g底物），于55 ℃條件下繼續(xù)酶解6 h，反應(yīng)結(jié)束后在95 ℃條件下滅酶15 min，酶解液3 800 r/min離心15 min，收集上清液，向上清液中加入3 倍體積的無(wú)水乙醇，于4 ℃條件下靜置4 h，3 800 r/min離心15 min以去除蛋白酶和部分未反應(yīng)的大分子蛋白質(zhì)，收集上清液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，得到γ-醇溶蛋白水解產(chǎn)物。

1.3.2.2 高溫高壓環(huán)化法制備CHP

稱取一定質(zhì)量的γ-醇溶蛋白水解產(chǎn)物置于100 mL錐形瓶中，加入適量蒸餾水配成底物質(zhì)量濃度為20.5 mg/mL的多肽溶液，同時(shí)加入0.16 mol/L KHCO3溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為弱堿性。用紗布封口，放入壓力蒸汽滅菌器中進(jìn)行高溫高壓處理，使樣液中的脯氨酸-組氨酸二肽發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，生成CHP，反應(yīng)5.3 h后，溶液冷卻，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，得到富含CHP的玉米蛋白水解物。

1.3.3 玉米蛋白水解物中CHP的分離純化

1.3.3.1 陰離子交換層析

將富含CHP的水解物溶于0.01 mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液，配制成質(zhì)量濃度為40 mg/mL的多肽溶液。DE-52陰離子交換層析柱用0.01 mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液充分平衡后上樣，分別用含0.0、0.2、0.4 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行階段洗脫，流速為1 mL/min，用自動(dòng)部分收集器以5 min/管進(jìn)行收集，于220 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，收集CHP所在部分洗脫液，冷凍干燥。

1.3.3.2 Sephadex G-25 凝膠柱層析

用0.1 mol/L乙酸銨溶液平衡凝膠層析柱，流速為0.7 mL/min。將陰離子交換柱分離所得的CHP含量最高的組分復(fù)溶于平衡液中，終質(zhì)量濃度為20 mg/mL，上柱后用0.1 mol/L乙酸銨溶液以0.7 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，于220 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，用自動(dòng)部分收集器以5 min/管收集洗脫液，收集CHP所在部分洗脫液，冷凍干燥。

1.3.3.3 反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法分離純化

經(jīng)過(guò)凝膠層析法分離純化所得的CHP含量最高的組分用10%乙腈溶液溶解后，用RP-HPLC進(jìn)行分離，采用半制備柱Shim-pack PREP-ODS（250 mm×20 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水（90∶10，V/V），上樣量300 μL，樣品質(zhì)量濃度5 mg/mL，流速5 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，多次進(jìn)樣，收集CHP所在部分洗脫液，冷凍干燥。

1.3.4 CHP的定量分析

樣品中CHP含量的測(cè)定采用UPLC法。色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；保護(hù)柱：VanGuard Pre-Column HSS T3（5 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A為含0.05% TFA的超純水，流動(dòng)相B為乙腈；線性洗脫梯度：0～5 min，5% B；5～6 min，5%～80% B；6～20 min，80% B。流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，進(jìn)樣量1 μL，樣品質(zhì)量濃度0.2 mg/mL。

式中：X為CHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；c為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的樣液中CHP的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為樣液體積/mL；m為樣品質(zhì)量/mg。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜分析

傅里葉變換紅外光譜依據(jù)文獻(xiàn)[15]方法進(jìn)行掃描。將CHP樣品用甲醇配制成2 mg/mL的樣品溶液，將50 μL樣液添加至300 mg干燥的KBr中，于105 ℃條件下?lián)]發(fā)去除溶劑；將干燥的CHP樣品與KBr研細(xì)均勻，在10 MPa條件下壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm－1波數(shù)范圍測(cè)定吸收光譜。

1.3.6 NMR分析

稱取樣品10 mg，加入0.5 mL D2O，置于樣品管中，采集1H-NMR和13C-NMR譜圖。

1.3.7 體外降血糖活性的測(cè)定

1.3.7.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定

表 1α-葡萄糖苷酶活性抑制各實(shí)驗(yàn)組的溶液配制Table 1 Reagents used in each experimental group forα-glucosidasey inhibition assay μL

[16]的方法，實(shí)驗(yàn)分為空白組、不加抑制劑的陰性組、CHP標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性對(duì)照組和待測(cè)樣品組。將10 U/mL α-葡萄糖苷酶溶解在0.1 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液中。在96 孔板中，依次加入如表1所示的各試劑，于37 ℃條件下溫育15 min；再加入24?μL?30?mmol/L麥芽糖溶液，于37 ℃溫育20 min；溫育結(jié)束后，每孔加入100?μL?0.1?mol/L?Na2CO3中止反應(yīng)。取10?μL中止后的反應(yīng)液于另一96 孔板中，加入200?μL葡萄糖測(cè)定試劑盒溶劑，于37 ℃條件下溫育15 min，在505 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，吸光度與葡萄糖生成量呈線性相關(guān)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。根據(jù)公式（2）計(jì)算該樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。

式中：A陰性組、A空白組、A樣品組分別為陰性組、空白組、待測(cè)樣品組的吸光度。

最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果表述為半抑制濃度（half?maximal?inhibitory?concentration，IC50）：當(dāng)α-葡萄糖苷酶的抑制率為50%時(shí)，加入抑制劑的有效質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.3.7.2 α-淀粉酶抑制活性的測(cè)定

表 2α-淀粉酶活性抑制各實(shí)驗(yàn)組的溶液配制Table 2 Reagents used in each experimental group ofα-amylase inhibition assay mL

參考Yu Zhipeng等[17]的方法，α-淀粉酶溶解于20?mmol/L?pH?6.9的磷酸鹽緩沖液中，使酶質(zhì)量濃度達(dá)到5?mg/L。向比色管中依次加入如表2所示的各種試劑，將混合溶液置于37 ℃水浴鍋中溫浴15 min，然后往該溶液里加入0.2?mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的馬鈴薯淀粉溶液（溶于磷酸鹽緩沖液中），37 ℃條件下恒溫浴5 min。最后再加入1?mL?3,5-二硝基水楊酸試劑終止反應(yīng)，并將反應(yīng)液置于100 ℃水浴中10 min，于冰水浴中迅速冷卻，加3?mL蒸餾水稀釋后測(cè)定540 nm波長(zhǎng)處的吸光度，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。根據(jù)公式（2）計(jì)算該樣品對(duì)α-淀粉酶的抑制率。

最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果表述為IC50：當(dāng)α-淀粉酶的抑制率為50%時(shí)，加入抑制劑的有效質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.3.8 體外抗氧化活性的測(cè)定

1.3.8.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

參考馬井喜等[18]的方法，取2.0?mL各種質(zhì)量濃度的樣品溶液、陰性對(duì)照（蒸餾水）和陽(yáng)性對(duì)照（CHP標(biāo)準(zhǔn)品），分別加入到2.0?mL?0.2?mmol/L?DPPH的乙醇溶液中，振蕩混勻，室溫暗室反應(yīng)30 min后，以2?mL乙醇加入2?mL蒸餾水調(diào)零，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度?？瞻捉M為2?mL樣品溶液和2?mL乙醇混合，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，根據(jù)公式（3）計(jì)算樣品的DPPH自由基清除率。

式中：A陰性組、A空白組、A樣品組分別為陰性組、空白組、待測(cè)樣品組的吸光度。

最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果表述為IC50：當(dāng)DPPH自由基清除率為50%時(shí)，加入抗氧化劑的有效質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.3.8.2 還原力的測(cè)定

參考顧敏[19]的方法，取1?mL各種質(zhì)量濃度的樣品溶液、空白 （蒸餾水）和陽(yáng)性對(duì)照（CHP標(biāo)準(zhǔn)品），分別與2.5?mL?0.2?mol/L磷酸鈉緩沖液（pH6.6）和2.5?mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%鐵氰化鉀溶液混合，并置于50 ℃水浴20 min。加入2.5?mL?10%三氯乙酸溶液，3?800?r/min離心10 min。取2.5?mL上清液，與2.5?mL蒸餾水混合，并加入0.5?mL?0.1%氯化鐵溶液，搖勻后于室溫條件下靜置5 min，用空白組調(diào)零，測(cè)定其在700 nm波長(zhǎng)處的吸光度。吸光度A700nm越高，表征樣品的還原力越強(qiáng)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ-醇溶蛋白的提取及其氨基酸序列組成

玉米醇溶蛋白是玉米黃粉中的主要儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)，約占玉米黃粉蛋白質(zhì)含量的68%，根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和溶解性，醇溶蛋白可分為4 類：α-、β-、γ-和δ-醇溶蛋白[20-21]。使用美國(guó)國(guó)立生物信息中心（National?Center?for?Biotechnology?Information，NCBI）的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)—— GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（www.ncbi.nlm.nih.gov/Database/index.html）對(duì)已收錄的玉米蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸序列搜索，發(fā)現(xiàn)γ-醇溶蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)中富含組氨酸-脯氨酸（His-Pro和Pro-His）序列（圖1），而α-、β-和δ-醇溶蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)中His-Pro和Pro-His序列很少，由此可知γ-醇溶蛋白是制備高附加值CHP的良好來(lái)源。本研究參考文獻(xiàn)[12-13]方法，依次用乙醇溶液和含還原劑的醇溶液提取α-、β-和γ-醇溶蛋白。α-和β-醇溶蛋白具有良好的成膜性，可以生產(chǎn)可食性蛋白膜、緩釋性壁材等[22]；γ-醇溶蛋白則作為下一步酶解實(shí)驗(yàn)的原料，經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為87.78%。由此可見(jiàn)本研究的蛋白質(zhì)分類提取法可大大提高玉米黃粉蛋白的綜合利用率。

圖 1γ-醇溶蛋白（GenBank登陸號(hào)：AF371261.1）的氨基酸序列Fig. 1 Amino acid sequence of γ-zein (GenBank accessing number: AF371261.1)

2.2 玉米蛋白水解物中CHP的分離純化結(jié)果

按1.3.1節(jié)方法，1.0 g玉米γ-醇溶蛋白中可以得到富含CHP的蛋白水解物682 mg，CHP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.66%，為了進(jìn)一步去除一些雜多肽，提高目標(biāo)產(chǎn)物的濃度，將富含CHP的玉米蛋白水解物分別用DE-52陰離子交換柱層析、Sephadex G-25凝膠柱層析和C18反相制備柱進(jìn)行分離和純化。

圖2 水解物的DE-52陰離子交換色譜圖（a）及所得組分A的UPLC色譜圖（b）Fig. 2 Anion exchange chromatography of the hydrolysate on a DE-52 column (a) and UPLC chromatogram of the obtained fraction A (b)

如圖2a所示，用陰離子交換層析對(duì)富含CHP的水解物進(jìn)行分離純化得到3 個(gè)洗脫組分，其中組分A未被離子交換劑吸附，表明這部分肽段組成是堿性氨基酸；B、C、D組分是0.2～0.4 mol/L NaCl梯度洗脫所得，說(shuō)明B～D峰以酸性肽組分為主。收集各組分冷凍干燥，UPLC法測(cè)定各峰的CHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)，可見(jiàn)A組分的CHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為10.53%（圖2b），而B(niǎo)、C、D組分中均不含CHP，由此推測(cè)CHP屬于弱堿性肽。故取A組分通過(guò)Sephadex G-25凝膠層析柱進(jìn)一步分離，如圖3a所示，得到3 個(gè)組分（A1、A3和A2）。分別對(duì)其進(jìn)行UPLC分析，結(jié)果表明A2組分的CHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為46.44%（圖3b），而A1、A3組分中均不含CHP，故選取A2組分進(jìn)行下一步的分離純化。

圖3 組分A的Sephadex G-25凝膠層析色譜圖（a）及所得組分A2的UPLC色譜圖（b）Fig. 3 Gel filtration chromatography of fraction A on a Sephadex G-25 column (a) and UPLC chromatogram of the obtained fraction A2 (b)

圖4 半制備型RP-HPLC分離A2組分的色譜圖（a）及所得組分A2-2的UPLC色譜圖（b）Fig. 4 Elution profile of fraction A2 separated by semi-preparative RP-HPLC (a) and UPLC chromatogram of the obtained fraction A2-2 (b)

經(jīng)過(guò)Sephadex G-25分離所得的A2組分進(jìn)一步通過(guò)RP-HPLC進(jìn)行分離純化，如圖4a所示，組分A2加載到半制備柱上，被分為3 個(gè)峰（A2-1、A2-2和A2-3），根據(jù)CHP標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間可以確定A2-2為CHP峰，將此峰組分多次收集、冷凍干燥后，采用UPLC進(jìn)行CHP定量分析，結(jié)果如圖4b所示。組分A2-2為單一峰，已達(dá)到很高的純度，其CHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.36%。

2.3 組分A2-2的傅里葉變換紅外光譜鑒定

圖5 組分A2-2的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 5 Infrared spectrum of fraction A2-2

由圖5可知，組分A2-2的傅里葉變換紅外光譜在3 443 cm-1處顯示酰胺N—H的伸縮振動(dòng)峰，在1 627 cm-1和1 697 cm-1處的峰分別為游離酰胺（-CONHR）和締合酰胺（-CONR1R2）的吸收峰，在1 433 cm-1和1 369 cm-1處出現(xiàn)的峰可歸屬為二酮哌嗪環(huán)C—H的彎曲振動(dòng)峰，證明二酮哌嗪環(huán)骨架的存在；1 573 cm－1處的峰為咪唑環(huán)的C＝C吸收峰，1 244 cm-1和1 159 cm-1處的峰為咪唑環(huán)的C-N吸收峰，證明組氨酸咪唑環(huán)的存在；在2 927 cm-1處出現(xiàn)的峰為-CH2的C-H伸縮振動(dòng)峰，在794 cm-1處顯示吡咯環(huán)的特征吸收峰，證明了脯氨酸吡咯環(huán)的存在。紅外測(cè)定結(jié)果表明，所制備的A2-2組分與文獻(xiàn)[23]報(bào)道的CHP的光譜特征一致。

2.4 組分A2-2的NMR分析

圖6 組分A2-2的1H-NMR圖譜Fig. 6 1H-NMR spectrum of fraction A2-2

圖7 組分A2-2的13C-NMR譜圖（a）和13C-NMR的135°無(wú)畸變極化轉(zhuǎn)移增強(qiáng)譜圖（b）Fig. 713C-NMR spectrum of fraction A2-2 (a) and 135° distortionless enhancement by polarization transfer spectrum (b) of13C-NMR

將分離純化后的組分A2-2進(jìn)行1H和13C-NMR分析，結(jié)果見(jiàn)圖6、7。由圖6可知，1H-NMR（600 MHz，D2O）δ：1.563 0（1H，m，J＝7.74 Hz，H-c）、1.716 1～1.768 2（1H，m，H-b）、1.796 6～1.834 1（1H，m，H-b）、2.123（1H，m，J＝5 Hz, H-c）、3.091 4（1H，d，J＝16 Hz，H-f）、3.236 2（1H，d，J＝16 Hz，H-f）、3.294 0～3.357 2（2H，m，H-a）、4.127 4～4.16（1H，m，H-d）、4.475 7（1H，m，H-e）、7.104 8（1H，s，H-g）、8.440 7（1H，s，H-h），通過(guò)與文獻(xiàn)[24]比較，其NMR數(shù)據(jù)與報(bào)道的CHP化合物基本一致。

圖7為組分A2-2的13C-NMR圖譜以及13C-NMR的135°無(wú)畸變極化轉(zhuǎn)移增強(qiáng)譜，由圖7可知，13C-NMR（600 MHz，D2O）δ：22.00（C-4）、25.72（C-3）、28.25（C-8）、45.71（C-5）、54.53（C-2）、59.35（C-7）、117.54（C-10）、128.34（C-9）、133.58（C-11）、165.97（C-6）、172.47（C-1），結(jié)合氫譜數(shù)據(jù)，可進(jìn)一步證明該組分為CHP。

2.5 玉米CHP分離純化各目標(biāo)產(chǎn)物的體外降血糖活性和抗氧化活性

圖8 不同質(zhì)量濃度的玉米蛋白水解物、組分A、A2和A2-2以及陽(yáng)性對(duì)-淀粉酶（b）活性的抑制Fig. 8 Inhibitory activities of corn protein hydrolysate, fractions A, A2 and A2-2, and positive control (CHP standard) at various concentrations on α-glucosidase (a) and α-amylase (b)照組（CHP標(biāo)準(zhǔn)品）對(duì)α-葡萄糖苷酶（a）和α

由圖8可知，玉米蛋白水解物和各分級(jí)組分均具有一定程度的抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性，且隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，4 種物質(zhì)對(duì)酶的抑制率均增大。玉米CHP的分離純化步驟及目標(biāo)組分體外α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性的IC50值如表3所示，可發(fā)現(xiàn)隨著CHP純度的增大，對(duì)酶的抑制作用也逐漸增強(qiáng)。經(jīng)過(guò)陰離子交換層析、凝膠層析和RP-HPLC純化得到的組分A2-2表現(xiàn)出最高的α-葡萄糖苷酶抑制活性和α-淀粉酶抑制活性（IC50分別為1.1 mg/mL和1.9 mg/mL），其IC50值與CHP標(biāo)準(zhǔn)品差異不顯著（P＞0.05），表明玉米蛋白水解物中對(duì)降血糖活性起主要作用的是CHP。本研究制備的玉米CHP能夠很好地抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性，這為后續(xù)研究其體內(nèi)降血糖及作用機(jī)制的闡明提供了一定的參考。

表3 玉米CHP分離純化及各目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性的IC50值以及對(duì)DPPH自由基清除能力的IC50值（n=3）Table 3 IC50for inhibition ofα-glucosidase andα-amylase as well as DPPH scavenging by the purified fractions from corn CHP and CHP standard (n= 3)

圖9 不同質(zhì)量濃度的玉米蛋白水解物、組分A、A2和A2-2以及CHP標(biāo)準(zhǔn)品的DPPH自由基清除率和還原力Fig. 9 DPPH scavenging rates and reducing capacities of corn protein hydrolysate, fractions A, A2 and A2-2, and CHP standard at various concentrations

通過(guò)DPPH自由基清除活性實(shí)驗(yàn)和還原力實(shí)驗(yàn)來(lái)比較玉米蛋白水解物及其各分級(jí)組分的抗氧化活性，如圖9所示，玉米蛋白水解物和組分A、A2、A2-2都具有一定的清除DPPH自由基活性和還原力活性，且隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，4 種物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除率和還原能力均增大。組分A2-2表現(xiàn)出最高的DPPH自由基清除活性（IC50= 67 μg/mL）和還原能力，并且其DPPH自由基清除活性和還原能力與CHP標(biāo)準(zhǔn)品差異不顯著（P＞0.05），表明玉米蛋白水解物中對(duì)抗氧化起主要作用的是CHP。

3 討 論

本研究以高溫高壓環(huán)化后的玉米蛋白酶解物為原料，采用離子交換色譜、凝膠過(guò)濾色譜和半制備型RP-HPLC技術(shù)，成功建立了玉米CHP的分離、純化體系。采用UPLC法對(duì)各級(jí)分離產(chǎn)物的CHP含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示經(jīng)離子交換色譜、凝膠過(guò)濾色譜和半制備型RP-HPLC逐級(jí)分離純化后，玉米CHP的純度由0.66%提高到97.36%，純化倍數(shù)高達(dá)148 倍，與購(gòu)買(mǎi)的CHP標(biāo)準(zhǔn)品的純度（98%）差異不顯著。對(duì)純化后終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，綜合UPLC、傅里葉變換紅外光譜和NMR波譜的結(jié)果，最終確定產(chǎn)物為目標(biāo)化合物CHP。Park等[11]采用超濾和活性炭吸附法從酵母蛋白的水解物中對(duì)CHP進(jìn)行純化，得到的CHP的純度僅為5%；Song等[25]采用溶劑萃取（乙酸乙酯法和異丙醇法）、兩次正相硅膠柱層析和一次反相硅膠柱層析法從狗的前列腺中分離富集CHP，得到的CHP的純度為97.2%，純化倍數(shù)為97，但工藝繁雜，消耗大量的有機(jī)溶劑，溶劑泄漏和環(huán)境污染的隱患較大，不適合工業(yè)化應(yīng)用。而本研究的分離純化工藝操作簡(jiǎn)便、條件溫和、無(wú)污染，符合市場(chǎng)要求，因此適合大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化富集。

分別測(cè)試分離純化各目標(biāo)產(chǎn)物的α-葡萄糖苷酶抑制活性、α-淀粉酶抑制活性、清除DPPH自由基活性和還原力，結(jié)果顯示用經(jīng)分離純化得到的玉米CHP表現(xiàn)出最高的體外降血糖和抗氧化活性，其α-葡萄糖苷酶抑制活性、α-淀粉酶抑制活性和清除DPPH自由基活性比分離前的玉米蛋白水解物分別提高了19、14 倍和62.7 倍，與購(gòu)買(mǎi)的CHP標(biāo)準(zhǔn)品相比差異不顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本實(shí)驗(yàn)建立的玉米CHP分離富集法，每千克玉米黃粉可以制備673 mg高純度的玉米CHP，以目前CHP的市場(chǎng)價(jià)格計(jì)算（10 美元/mg），可創(chuàng)產(chǎn)值6 730 美元，與將玉米黃粉直接作為飼料相比，可增值20 000 倍。我國(guó)玉米黃粉來(lái)源廣泛，利用率很低，很多未經(jīng)利用即自然排放，據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)字顯示每年全國(guó)通過(guò)廢液自然排放的玉米黃粉的產(chǎn)量達(dá)8萬(wàn) t以上[26]。因此將玉米黃粉通過(guò)生物技術(shù)、分離技術(shù)等手段生產(chǎn)CHP，不僅可以在一定程度上解決我國(guó)糧食資源的浪費(fèi)和環(huán)境污染問(wèn)題，還能帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)促進(jìn)降血糖、抗氧化等肽類藥物及保健食品的開(kāi)發(fā)，提高玉米蛋白的附加值，推進(jìn)玉米精深加工進(jìn)程，具有重要意義。

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Separation, Purification, Structural Identification and Bioactivities of Corn Cyclo (His-Pro)

FAN Hongxiu, LIU Hongcheng, DONG Xin, ZHANG Yanrong*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Cyclo (His-Pro) (CHP) is an active dipeptide that has remarkable anti-diabetic and antioxidant activities. In the present study, CHP was isolated and purified from corn protein hydrolysate treated by high pressure/temperature treatment using DE-52 anion-exchange chromatography, gel filtration chromatography and semi-preparative high performance liquid chromatography (HPLC). The structure of the purified product was identified by ultra-high performance liquid chromatography (UPLC), Fourier infrared (FI-IR) spectroscopy and1H and13C nuclear magnetic resonance (NMR), and its bioactivities including in vitro anti-diabetic and antioxidant capacity were determined. The results showed that the purity of the prepared corn CHP was more than 97.36%. FI-IR and NMR spectra showed that the corn CHP was the target compound. The results of physiological activities indicated that the CHP exhibited strong α-glucosidase and α-amylase inhibitory activity with half maximal inhibitory concentrations (IC50) of 1.1 and 1.9 mg/mL, respectively, as well as high scavenging activity on 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl hydrate with IC50of 67 μg/mL and potent reducing capacity.

cyclo (His-Pro); corn protein; separation and purification; structural identification

10.7506/spkx1002-6630-201621010

O629.73

A

1002-6630（2016）21-0053-08

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2016-06-30

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD16B08）；吉林省重大科技攻關(guān)項(xiàng)目（2012ZDGG007）

樊紅秀（1987—），女，博士研究生，研究方向?yàn)榧Z油植物蛋白工程。E-mail：xcpyfzx@163.com

*通信作者：張艷榮（1965—），女，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z油植物蛋白工程及功能食品。E-mail：xcpyfzx@163.com