謝金碩 周義欽 陳松 邵加華 符培亮 許震宇 吳海山

Kartogenin與TGF?β3/BMP?2/DEX對兔滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成軟骨分化的對比研究

謝金碩 周義欽 陳松 邵加華 符培亮 許震宇 吳海山

目的 比較Kartogenin（KGN）與轉(zhuǎn)化生長因子β3（TGF?β3）/骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP?2）/地塞米松（DEX）對兔滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞（synovial?derivedmesenchymal stem cells,SMSCs）增殖及成軟骨分化的作用。方法 于6～10月齡新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)處滑膜中分離培養(yǎng)SMSCs，并進(jìn)行鑒定。設(shè)置KGN組（采用KGN干預(yù)）、T/B/D組（TGF?β3/BMP?2/DEX聯(lián)合干預(yù)）及空白對照組，采用PELLET系統(tǒng)培養(yǎng)法分別培養(yǎng)各組細(xì)胞。通過比較各組細(xì)胞的增殖速度、軟骨微球的直徑和重量、Ⅱ型膠原（Col?Ⅱ）表達(dá)情況、成軟骨分化相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)及蛋白質(zhì)合成量等指標(biāo)來評價KGN對SMSCs增殖及成軟骨能力的影響。結(jié)果 成功從兔膝關(guān)節(jié)滑膜分離出SMSCs；KGN組的SMSCs增殖能力弱于T/B/D組，但KGN組軟骨微球直徑最大，重量最重，Ⅱ型膠原合成量最多，且均顯著高于其他組；PCR及Western Blot結(jié)果表明KGN組成軟骨分化相關(guān)基因的表達(dá)最強(qiáng)，蛋白質(zhì)合成量最多。結(jié)論 KGN不能明顯增強(qiáng)SMSCs的增殖能力，但對SMSCs的成軟骨分化能力強(qiáng)于TGF?β3/BMP?2/DEX，將來可能應(yīng)用于修復(fù)軟骨損傷。

滑膜；間質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞分化；軟骨細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長因子

滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞（synovial?derivedmesenchy? mal stem cells,SMSCs）是一種關(guān)節(jié)滑膜源性的組織特異性的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）［1］，具有很強(qiáng)的成軟骨分化能力［2］，而眾多細(xì)胞因子參與這一過程并起到關(guān)鍵作用。多項研究報道，轉(zhuǎn)化生長因子β3（transforming growth factor?β3, TGF?β3）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bonemorphogenetic protein?2,BMP?2）、地塞米松（dexamethasone,DEX）

是促肝細(xì)胞成軟骨分化的常用因子，并且三者聯(lián)合體外誘導(dǎo)SMSCs成軟骨分化比單一因子或兩兩聯(lián)合的誘導(dǎo)效率都要高［3?6］。

Kartogenin（KGN）是一種新的小分子化合物，2012年由Johnson等［7］在22 000多種不同結(jié)構(gòu)的藥性化學(xué)分子中篩選出來，他發(fā)現(xiàn)KGN不僅對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrow mesenchymal stem cells, BMSCs）有著很強(qiáng)的成軟骨分化能力，還能促使BM?SCs單一地向軟骨細(xì)胞分化。KGN對BMSCs的誘導(dǎo)效率與濃度相關(guān)，10μmol/L的KGN促軟骨分化能力最強(qiáng)，并且在修復(fù)受損軟骨時可減少再生軟骨的表層及中層纖維化，生物安全性良好［7］。自KGN被發(fā)現(xiàn)以來，相關(guān)研究主要針對BMSCs，而對具有組織特異性的SMSCs幾乎沒有研究［7?9］。體外實驗研究幾乎都是以二甲基亞砜（DMSO）作為空白對照組，缺乏有說服力的陽性對照，并不能反映KGN成軟骨分化能力的強(qiáng)度。

本實驗在已有的研究基礎(chǔ)上，分離培養(yǎng)鑒定兔滑膜SMSCs，采用PELLET系統(tǒng)培養(yǎng)法，設(shè)立陽性對照（TGF?β3/BMP?2/DXM）及空白對照（DMSO或完全培養(yǎng)基），通過檢測軟骨微球的性質(zhì)、軟骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)情況以及成軟骨細(xì)胞分化過程中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，來分析KGN對SMSCs成軟骨細(xì)胞分化的影響及其程度。

材料與方法

一、主要試劑、儀器和實驗動物

1.主要試劑 戊巴比妥鈉（Sigma公司，美國），胎牛血清、DMEM、液體培養(yǎng)基（Gibco/BRL公司，美國），0.25%胰蛋白酶/EDTA、Ⅰ/Ⅱ型膠原（Monosan公司，美國），KGN粉劑、免疫熒光試劑盒［賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司，中國］，小鼠抗人、羊抗鼠單克隆熒光標(biāo)記抗體（BD公司，美國），RneasyMiniKit試劑盒、Western Blot試劑盒、DMSO（上海浩然生物技術(shù)有限公司，中國），TGF?β3/BMP?2/DEX（Sigma公司，美國）。

2.主要儀器 SBD 50恒溫水浴搖床（Heto公司，丹麥），CO2培養(yǎng)箱（Thermo Forma，美國），SMZ 645型光學(xué)顯微鏡（Nikon公司，日本），IX70型熒光顯微鏡（Olympus公司，日本），流式細(xì)胞儀（BD公司，美國），流式結(jié)果分析軟件CellQuest（Becton Dickinson公司，美國），超凈工作臺（蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司，中國），超低溫冰箱（Forma Scientific公司，美國）。

3.實驗動物 新西蘭大白兔4只，月齡6～10個月，雌雄不限，體重1.6～2.2 kg（第二軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供）。

4.分組 設(shè)立KGN組（濃度為10μmol/L）、T/B/ D組（10μg/m l的TGF?β3、0.5mg/m l的BMP?2、100 nmol/L的DXM）以及空白對照組（含2%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基或DMSO）。

本研究獲第二軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

二、兔SMSCs的觀察及鑒定

（一）細(xì)胞分離、培養(yǎng)

新西蘭大白兔4只，兔膝關(guān)節(jié)活檢術(shù)收集兔膝關(guān)節(jié)處滑膜，0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，離心10 min，吸凈上清，加入DMEM完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。光學(xué)顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞生長和形態(tài)學(xué)特征，每隔1 d換液1次。培養(yǎng)至90%融合時，按1∶3比例傳代。

（二）細(xì)胞表面抗原鑒定

取傳代至第3代貼壁生長的SMSCs，0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，1 600 r/min離心10min，細(xì)胞重懸并使其密度約為每毫升2×106個，然后取0.1ml待測細(xì)胞懸液，加入不同單克隆抗體（CD44、CD45、CD90、CD105），避光常溫條件下反應(yīng)30min。收集待檢細(xì)胞，多聚甲醛固定液200ml，對待檢細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記物檢測。

三、促增殖能力的比較

將粉末狀的KGN充分溶解在DMSO中，配制成1mmol/L的KGN初始液，進(jìn)而稀釋至10μmol/L。將分離獲得的第3代SMSCs以1 000個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中。分別加入對應(yīng)組的干預(yù)試劑，連續(xù)培養(yǎng)3 d后，向每孔中加入CCK?8試劑10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用分光光度儀檢測每孔波長為450 nm的吸光度A值，計算相對增殖速率。

四、成軟骨分化能力的比較

（一）軟骨微球的相關(guān)檢測

將分離培養(yǎng)的第3代SMSCs通過體外PELLET系統(tǒng)法進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，EDTA消化吸收，通過細(xì)胞計數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升2×105個接種于9個15ml的離心管中。每組3支SMSCs離心管，分別加入對應(yīng)組的干預(yù)試劑。1 000 r/min離心15min后，取出離心管放置在預(yù)先設(shè)定好的37℃、5%CO2的溫箱中培養(yǎng)21 d。

1.檢測軟骨微球的直徑和重量 PELLET系統(tǒng)下，在各組成軟骨細(xì)胞系分化21 d后，測量各組形成的軟骨微球直徑；在各組成軟骨細(xì)胞系分化過程中，

分別在第7、14、21天時，使用重量測量儀檢測各組軟骨小球的重量。

2.觀察蛋白聚糖表達(dá)情況 培養(yǎng)21 d后，取各組細(xì)胞，清洗后以4%多聚甲醛固定30min，石蠟包埋切片，切片厚度為5μm，脫蠟蒸餾水沖洗，甲苯胺藍(lán)染色，倒置顯微鏡下觀察蛋白聚糖的表達(dá)情況。

3.分析Ⅱ型膠原（Col?Ⅱ）的表達(dá)情況 ①各組SMSCs成軟骨細(xì)胞系分化21 d后，于PELLET系統(tǒng)培養(yǎng)管取出軟骨微球，吸凈培養(yǎng)基，PBS沖洗液清洗2次，4%多聚甲醛溶液完全浸泡30min；②待完好固定后，使用細(xì)胞封閉液對各組SMSCs非特異性結(jié)合位點(diǎn)封閉反應(yīng)20min；③按試劑盒中說明進(jìn)行操作，結(jié)束后拍照。

（二）RT?PCR分析成軟骨分化標(biāo)志基因的表達(dá)

檢測成軟骨分化標(biāo)志基因Sox9、aggrecan、Col?Ⅱ）的表達(dá)情況。

將分離培養(yǎng)的SMSCs細(xì)胞，以1×105個/孔的密度種植在6孔培養(yǎng)板中，先給予各孔基礎(chǔ)培養(yǎng)液，每組3孔，分別加入對應(yīng)組的干預(yù)試劑。

成軟骨細(xì)胞系分化14 d后，對各組SMSCs先用胰蛋白酶/EDTA消化分離貼壁細(xì)胞，除去上清液，收集各組細(xì)胞團(tuán)塊，37℃下用3mg/ml胰腺酶溶解消化3 h。Trizol提取總RNA，以總RNA為模板，行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為70℃5min，42℃1 h，95℃10 min。PCR反應(yīng)條件為94℃5min；94℃45 s，60℃45 s，72℃45 s，30～35個循環(huán)；72℃延伸5min。相關(guān)引物序列詳見表1。

（三）分析成軟骨分化相關(guān)蛋白的表達(dá)

采用Western Blot分析相關(guān)蛋白。在100 V的恒壓下電泳60min；在200mA的恒流下采用半干轉(zhuǎn)膜法持續(xù)90min。室溫下封閉1 h，4℃一抗孵育過夜，TBS洗膜3次，每次10min，室溫下二抗孵育2 h，TBS洗膜3次，每次10min，滴加ECL顯色液，觀察并拍照。

五、統(tǒng)計學(xué)方法

表1 成軟骨分化標(biāo)志基因的引物序列

結(jié)果

一、細(xì)胞觀察及鑒定

（一）SMSCs的細(xì)胞學(xué)觀察

SMSCs剛剛接種時，顯微鏡下可見大量雜亂的形態(tài)不規(guī)則的細(xì)胞，1 d后可見雜亂的細(xì)胞向周圍培養(yǎng)液爬行，并出現(xiàn)沿器皿壁生長的細(xì)胞，隨著細(xì)胞培養(yǎng)，鏡下細(xì)胞形態(tài)各異，大部分為橢圓或多邊形，細(xì)胞透亮度高（圖1 a）；隨著時間延長，鏡下見細(xì)胞數(shù)量急劇增多，密度變大，細(xì)胞形態(tài)有一定的規(guī)則和一致性，肥大的細(xì)胞核消失，多邊形外觀消失，出現(xiàn)了菱形和星形的細(xì)胞（圖1 b）；繼續(xù)傳代擴(kuò)增培養(yǎng)后，第3代SMSCs細(xì)胞形態(tài)基本上達(dá)到了規(guī)則一致性，細(xì)胞呈細(xì)梭形狀滿整個視野（圖1 c）。

（二）流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原

運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測第3代培養(yǎng)的待測細(xì)胞表面抗原發(fā)現(xiàn)：CD44、CD105、CD90呈陽性表達(dá)，而CD45表達(dá)呈陰性（圖2），與SMSCs表面抗原表達(dá)特

征相符。

圖1 細(xì)胞接種1 d（a）、7 d（b）、14 d（c）時顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)（×100）

圖2 流式細(xì)胞儀檢測樣品細(xì)胞表面抗原 CD44、CD90、CD105呈陽性表達(dá)，而CD45表達(dá)呈陰性

二、對SMSCs增殖的影響

細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)3 d后，T/B/D組SMSCs的增殖速度明顯高于其他兩組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05，圖3）。KGN組與空白對照組相比，增殖速度差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。

圖3 三組中SMSCs的增殖情況（與空白對照組比較，*P＜0.05；與T/ B/D組比較，#P＜0.05）

三、對SMSCs成軟骨分化的影響

（一）軟骨微球相關(guān)檢測

1.微球的直徑 成軟骨細(xì)胞系誘導(dǎo)分化21 d后，KGN組和T/B/D組中軟骨微球的直徑較空白對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；而KGN組軟骨微球的直徑顯著大于T/B/D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

2.微球的重量 成軟骨細(xì)胞系誘導(dǎo)分化7、14、21 d，隨著時間的延長，各組軟骨微球重量都有所增加，KGN組、T/B/D組的軟骨微球重量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；KGN組軟骨微球重最重，與T/B/D組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。

（二）各組成軟骨分化蛋白聚糖的表達(dá)

成軟骨細(xì)胞系誘導(dǎo)分化21 d后，KGN組較T/B/ D組甲苯胺藍(lán)染色更深，密度更密（圖6）。

圖4 各組成軟骨誘導(dǎo)21 d后軟骨微球的直徑（與空白對照組相比，*P＜0.05；與T/B/D組相比，#P＜0.05）

圖5 三組成軟骨分化各時間點(diǎn)軟骨微球重量的比較（與空白對照組相比，*P＜0.05；與T/B/D組相比，#P＜0.05）

（三）免疫組織化學(xué)染色檢測Col?Ⅱ表達(dá)

成軟骨分化21 d，KGN組與T/B/D組均有Col?Ⅱ表達(dá)，而空白對照組未見Col?Ⅱ表達(dá)。KGN組Col?Ⅱ較T/B/D組更密集（圖7）。

四、RT?PCR分析成軟骨分化標(biāo)志基因的表達(dá)

RT?PCR的檢測結(jié)果顯示，KGN組與T/B/D組均有成軟骨分化相關(guān)基因Sox9，aggrecan、Col?Ⅱ的表達(dá)，但KGN組成軟骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)更多（圖8）。

圖6 各組細(xì)胞成軟骨分化21 d后（甲苯胺藍(lán)染色） KGN組（c）較T/B/D組（b）染色更深，密度更密，a為對照組

圖7 各組細(xì)胞Col?Ⅱ免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×100） KGN組（c）與T/B/D組（b）均有Col?Ⅱ表達(dá)，KGN組表達(dá)更強(qiáng)，而空白對照組（a）未見表達(dá)

圖8 成軟骨分化相關(guān)基因表達(dá)情況（與對照組相比，*P＜0.05；與T/ B/D組相比，#P＜0.05）

圖9 各組成軟骨分化蛋白合成情況

五、Western Blot分析成軟骨分化相關(guān)蛋白

KGN組與T/B/D組均有成軟骨分化相關(guān)蛋白Sox9、aggrecan、Col?Ⅱ的合成，并且均高于空白對照組，KGN組相關(guān)蛋白合成量更多（圖9）。

討論

SMSCs作為MSCs的一種，具有增殖速度快以及可多向分化等能力［10］，而且是一種關(guān)節(jié)滑膜源性的組織特異性的MSCs［1］，與骨髓、脂肪和肌肉等分離的MSCs相比，有更強(qiáng)的成軟骨分化能力［2］。

Eslaminejad等［11］在體外誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化過程中，通過檢測Sox9、aggrecan、Col?Ⅱ等相關(guān)軟骨標(biāo)志發(fā)現(xiàn)TGF?β3較TGF?β1體現(xiàn)了更強(qiáng)的成軟骨分化能力。隨后有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，TGF?β除了有促進(jìn)成軟骨分化作用外，還可以促進(jìn)SMSCs遷移歸巢，從而進(jìn)行軟骨原位修復(fù)［12］。Ichinose等［13］發(fā)現(xiàn)TGF?β3、BMP?2、DEX三者聯(lián)合體外誘導(dǎo)SMSCs向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化時，隨著培養(yǎng)時間的延長，SMSCs體積及其重量在不斷增加。本研究中也有相似發(fā)現(xiàn)。

Johnson等［7］發(fā)現(xiàn)不同濃度（10 nmol/L、100 nmol/L、1μmol/L、10μmol/L）的KGN對BMSCs向軟骨細(xì)胞分化的能力不同，以10μmol/L KGN的結(jié)果最為顯著，但是各濃度對生物體均無副作用。同時，在進(jìn)行了為期21 d的軟骨小球培養(yǎng)后，他們發(fā)現(xiàn)，在

加入KGN后，Col?Ⅱ和聚集蛋白聚糖含量均增多。本實驗通過與T/B/D進(jìn)行對比，探究KGN對SMSCs成軟骨分化的影響，所以直接采用10μmol/L KGN作為實驗組，并未設(shè)置濃度梯度。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)KGN組蛋白聚糖、Col?Ⅱ以及成軟骨分化相關(guān)基因及蛋白表達(dá)均強(qiáng)于T/B/D組，而且軟骨微球染色蛋白聚糖含量最多，與Johnson等［7］的發(fā)現(xiàn)相似。

Zhang等［14］發(fā)現(xiàn)隨著KGN濃度的逐步提高，BMSCs中成軟骨分化相關(guān)基因Sox9、aggrecan、Col?Ⅱ的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，KGN濃度為10μmol/L時，Sox9的表達(dá)可提升3倍左右。Shi等［15］發(fā)現(xiàn)KGN體外可以促進(jìn)人來源SMSCs向軟骨細(xì)胞分化。本研究也有相似的發(fā)現(xiàn)。

本研究也存在不足，由于未設(shè)立KGN濃度梯度，無法探討不同濃度KGN對SMSCs的影響。而且，本研究只進(jìn)行了體外細(xì)胞實驗，下一步將在體內(nèi)通過KGN聯(lián)合支架材料，探索KGN對軟骨損傷修復(fù)能力，為臨床軟骨修復(fù)提供新的方法。

綜上所述，本研究成功從新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)處分離獲取了SMSCs，并對其進(jìn)行了鑒定。在前期研究的基礎(chǔ)上，我們將高濃度KGN與TGF?β3/BMP?2/DXM進(jìn)行對比研究，并設(shè)立空白對照組，探索KGN對SMSCs成軟骨細(xì)胞分化的影響，借助軟骨微球相關(guān)檢測，PCR以及Western Blot等相關(guān)檢測方法，分析各組成軟骨能力的強(qiáng)弱，結(jié)果顯示KGN組誘導(dǎo)SMSCs成軟骨分的能力強(qiáng)于T/B/D組，為SMSCs修復(fù)軟骨損傷奠定基礎(chǔ)。

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A comparative study of effects of kartogenin vs.TGF?β3/BMP?2/DEX on proliferation and chondro?genic differentiation of rabbit synovialmesenchymal stem cells.

XIE Jinshuo*,ZHOU Yiqin,CHEN Song, SHAO Jiahua,FU Peiliang,XU Zhenyu,WU Haishan.*Department of Joint Center,Shanghai Changzheng Hospital,Shanghai200003,China

WUHaishan,E?mail:drisland@vip.sina.com

Objective The effectof kartogenin(KGN)on chondrogenic differentiation of rabbitsyno?vial mesenchymal stem cells(SMSCs)was evaluated by comparing with TGF?β3/BMP?2/DEX.Methods SMSCs were isolated from the knee joints of rabbits,and cultured in the PELLET system for chondrogenic differentiation.The cell pellets were divided into 3 groups:KGN group(given KGN),T/B/D group[given the combination of transforming growth factor?β3(TGF?β3),bonemorphogenetic protein?2(BMP?2)and dexametha?sone(DEX)],and blank controlgroup.The cellmultiplication,diameter,weight,collagen typeⅡ,expression of cartilage related genes and protein synthesis of cell pellets in each group weremeasured to analyze the effect of KGN on the proliferation and chondrogenic differentiation of SMSCs.Results SMSCs were successfully isolated from the knee joints of rabbits.The ability of proliferation of pellets in KGN group was significantly weaker than that in TGF?β3/BMP?2/DEX group.The pellets in KGN group presented larger diameter,heavier weight,more collagen typeⅡand higher expression of cartilage related genes and protein synthesis than those in the other groups.Conclusion KGN could not enhance SMSCs’proliferation,butmore strongly induce SMSCs’chondrogenic differentiation than TGF?β3/BMP?2/DEX.For this reason,KGN could be used as a new method for repairing cartilage in the future.

Synovial membrane;Mesenchymal stem cells;Cell proliferation;Cell differentiation; Chondrocytes;Transforming growth factors

2016?04?05）

10.3969/j.issn.1674?8573.2016.05.013

上海市自然科學(xué)基金項目（15ZR1414000）

200003 上海，上海長征醫(yī)院關(guān)節(jié)外科（謝金碩、周義欽、陳松、邵加華、符培亮、吳海山）；第二軍醫(yī)大學(xué)組織胚胎教研室（許震宇）

吳海山，E?mail：drisland@vip.sina.com