譚子虎，陳 延

(1. 湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430060;2. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，湖北 武漢 430060)

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論 著

血管性癡呆大鼠海馬區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)及加減薯蕷丸的干預(yù)機制

譚子虎1，陳 延2

(1. 湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430060;2. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，湖北 武漢 430060)

目的 觀察加減薯蕷丸對血管性癡呆模型大鼠行為學(xué)及海馬區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT-3)表達(dá)的影響，探討其改善學(xué)習(xí)記憶的可能機制。方法 選用SPF級雄性Wistar大鼠60只，隨機選取其中20只作為假手術(shù)組，其余大鼠采用雙側(cè)頸總動脈分次結(jié)扎并剪斷的方法制作血管性癡呆模型。將造模成功大鼠40只隨機分為模型組和中藥組各20只，中藥組給予0.01 mL/g加減薯蕷丸灌胃，其余2組灌胃等量生理鹽水，均1次/d。灌胃8周后進行Morris試驗，Morris試驗結(jié)束后取海馬組織采用熒光PCR法檢測海馬區(qū)NT-3表達(dá)水平。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長，穿越平臺次數(shù)減少，平臺象限停留時間縮短,大鼠海馬區(qū)NT-3表達(dá)明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；與模型組比較，中藥組大鼠逃避潛伏期明顯縮短,穿越平臺次數(shù)增加，平臺象限停留時間延長,大鼠海馬區(qū)NT-3表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論 加減薯蕷丸可能通過提高海馬區(qū)NT-3表達(dá)水平，影響神經(jīng)突觸可塑性，從而發(fā)揮對抗血管性癡呆的作用。

血管性癡呆；加減薯蕷丸；海馬；神經(jīng)營養(yǎng)因子

Key words: vascular dementia; Modified Yam Pill; neurotrophin-3

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是僅次于阿爾茲海默病的第二大癡呆類型，占癡呆總數(shù)的20%，其認(rèn)知功能的損失主要由腦血管病變導(dǎo)致。最新的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管細(xì)胞之間相互作用可導(dǎo)致腦血管病變及癡呆的發(fā)生[1]。神經(jīng)營養(yǎng)因子3(Neurotrophin-3，NT-3)隸屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族，目前發(fā)現(xiàn)其除了具有神經(jīng)營養(yǎng)、突觸保護等作用外，還具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖的作用[2]。加減薯蕷丸由已故名老中醫(yī)呂繼端根據(jù)張仲景《金匱要略》中治療虛勞的薯蕷丸化裁而來，更加符合癡呆的病機。先前的臨床研究發(fā)現(xiàn)，加減薯蕷丸可對非癡呆血管性認(rèn)知功能障礙進行有效地早期干預(yù)[3]。本研究擬通過觀察加減薯蕷丸對血管性癡呆模型大鼠行為學(xué)及海馬區(qū)NT-3表達(dá)的影響，探討加減薯蕷丸改善學(xué)習(xí)記憶的可能機制，為加減薯蕷丸干預(yù)血管性癡呆的作用機制提供實驗依據(jù)。

1 實驗資料

1.1 實驗動物 健康成年SPF級Wistar雄性大鼠60只，鼠齡8～10周，體質(zhì)量(200±20 )g，購自湖北省疾控中心，動物合格證號：SCXK(鄂)2008-0005。大鼠購買后養(yǎng)殖于自然光線下，保持溫度20～25 ℃，恒溫恒濕，自由進食進水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物與試劑 加減薯蕷丸由山藥、熟地黃、何首烏、西黨參、白芍、全當(dāng)歸、炙遠(yuǎn)志等14味中草藥組成，經(jīng)物理方法濃縮提純?yōu)槊亢辽幉? g，置于4 ℃冰箱中冷藏，備用。所用藥材購自湖北省中醫(yī)院中藥房，由該院藥材制劑科制備。引物由Invitrogen Biotechnology Co., LTD中國公司合成。

1.3 主要實驗儀器 MT-200 Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(成都)；image-pro plus圖像處理系統(tǒng)6.0(美國)；Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機(Heal Force)；SLAN熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(上海宏石醫(yī)療科技有限公司)；SW-CJ-1FD超凈工作臺(蘇凈安泰)。

1.4 方法 將動物飼養(yǎng)1周后，隨機選取其中20只作為假手術(shù)組，余大鼠采用頸總動脈分次結(jié)扎并剪斷的方法制備血管性癡呆模型：給予10%水合氯醛0.3 mg/100 g腹腔注射麻醉，于手術(shù)臺固定，去毛備皮，碘伏消毒，用手術(shù)刀沿頸部正中偏右切開皮膚，逐層分離，鈍性分離右側(cè)頸總動脈，用0號手術(shù)線結(jié)扎右側(cè)頸總動脈的近心端和遠(yuǎn)心端，用剪刀從中間剪斷，依次逐層縫合，1周后在同樣條件下結(jié)扎并剪斷左側(cè)頸總動脈。假手術(shù)組在相同條件下只分離雙側(cè)頸總動脈，既不結(jié)扎也不剪斷。術(shù)中以60 W燈泡照射,以防止低溫,保護腦組織。所有動物手術(shù)后暴露在同等條件下：室溫24 ℃左右,相對濕度(40±5)%,喂飼普通飼料,自由飲水。術(shù)后1周內(nèi)肌肉注射青霉素預(yù)防感染。模型制備后，手術(shù)大鼠進行一次Morris水迷宮定位航行訓(xùn)練,以假手術(shù)組大鼠從不同入水點爬上站臺消耗時間(即逃避潛伏期)的均值為參考值,計算每只大鼠的平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時間的比例,該值>20%定為癡呆鼠。最終選取造模成功大鼠40只，隨機分為模型組和中藥組,每組20只。中藥組于造模成功1周后開始給予0.01 mL/g加減薯蕷丸灌胃，1 mL/100g體質(zhì)量,假手術(shù)組、模型組予等量生理鹽水，均1次/d，連續(xù)8周。

1.5 觀察項目

1.5.1 行為學(xué)檢測 各組動物于灌胃8周后，采用Morris水迷宮實驗裝置及動態(tài)圖像采集分析系統(tǒng)進行定位航行及空間探索實驗,測試各組大鼠的學(xué)習(xí)及空間記憶能力。水迷宮實驗開始前1 d，先讓大鼠于無平臺水池中試游2 min；水池直徑150 cm,高45 cm；保持水溫在(22±2)℃。水迷宮實驗的第1—4天進行大鼠的定位航行測試: 水池由人為劃分成4個象限,在池中第1象限安置1個黑色平臺，平臺位于水下1 cm，直徑12 cm，高21 cm。按1—4象限的順序，將大鼠從不同入水點放入水池中,由計算機記錄大鼠在120 s內(nèi),從不同入水點爬上站臺消耗的時間(即逃避潛伏期)。如果大鼠在2 min內(nèi)爬上了站臺,則讓大鼠在站臺停留30 s,逃避潛伏期則為消耗的時間；如果未能找到站臺,則可以引導(dǎo)大鼠，讓其爬上站臺并同樣停留30 s,潛伏期相應(yīng)的記錄為2 min。每次訓(xùn)練完成后，將大鼠從水池取出，用干布擦干，并用取暖器保持大鼠體溫，實驗進行時關(guān)閉周圍光源，并減少人員走動。第5天拆去站臺，對大鼠進行空間探索實驗,從同一象限放入水中，計算機記錄2 min內(nèi)大鼠穿越原有站臺位置的次數(shù)及游動的速度。

1.5.2 海馬組織NT-3表達(dá)檢測 于行為學(xué)實驗結(jié)束后當(dāng)天，各組動物分別斷頭取腦組織(海馬),用熒光PCR法測定NT-3表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮實驗

2.1.1 定位航行實驗 經(jīng)過4 d訓(xùn)練，各組大鼠逃避潛伏期均逐漸變短，但模型組逃避潛伏期明顯長于假手術(shù)組(P<0.05)，中藥組逃避潛伏期明顯短于模型組(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠的逃避潛伏期

2.1.2 空間探索實驗 與假手術(shù)組比較，模型組穿越平臺次數(shù)和游動速度均明顯下降(P均<0.05)；與模型組比較，中藥組穿越平臺次數(shù)和游動速度均顯著增加(P均<0.05)。見圖2及圖3。

2.2 海馬組織NT-3表達(dá)水平 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織NT-3表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，中藥組大鼠海馬組織NT-3表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見圖4。

圖2 各組大鼠穿越平臺次數(shù)

圖3 各組大鼠游動速度

圖4 各組大鼠海馬NT-3表達(dá)水平

3 討 論

血管性癡呆是由腦血管病及其危險因素所導(dǎo)致的疾病，并且隨著人類生活方式的改變，高血壓、糖尿病、高血脂癥的發(fā)生率在不斷上升，間接地影響著血管性癡呆的發(fā)生率[4]。認(rèn)知功能與大腦皮質(zhì)功能密切相關(guān)，而血管性癡呆的發(fā)生與海馬的功能有關(guān)，在慢性腦灌注不足時，海馬等區(qū)域?qū)θ毖跞毖貏e敏感，也最容易受到損傷而導(dǎo)致認(rèn)知功能下降。目前研究發(fā)現(xiàn)，突觸變化與記憶的鞏固及適應(yīng)性行為的發(fā)生密切相關(guān)，而神經(jīng)營養(yǎng)信號通路在突觸生長及可塑性中發(fā)揮著重要作用[5-6]。NT-3及與其具有高親和力的受體TrkC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，神經(jīng)元的分化、軸突的生長、突觸的可塑性等都離不開其營養(yǎng)作用[7-8]。Ramos-Languren等[9]通過在大鼠海馬內(nèi)注射NT-3發(fā)現(xiàn)，其可誘導(dǎo)海馬DG-CA3神經(jīng)投射LTP的增強，并伴有海馬苔蘚纖維突觸的改變，而這種作用可被受體TrkC抑制劑所限制。近年來，影響突觸發(fā)生的黏附復(fù)合物不斷被發(fā)現(xiàn)，而對于其調(diào)節(jié)機制研究不多。有研究發(fā)現(xiàn)，突觸后的受體TrkC通過與突觸前蛋白酪氨酸磷酸酶σ(presynaptic protein tyrosine phosphatase σ，PTPσ)的相互作用，形成TrkC /PTPσ復(fù)合物，誘導(dǎo)細(xì)胞黏附反應(yīng)，發(fā)揮谷氨酸能神經(jīng)突觸樣作用，而NT-3可增強大鼠海馬神經(jīng)元TrkC的活性，促進PTPσ與TrkC的結(jié)合，有助于突觸作用的發(fā)揮[10]。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，NT-3通過激活鈣調(diào)蛋白依賴性激酶(CaMK)IIα，作用于瞬時型感受器點位通道蛋白5(transient receptor potential canonical 5 protein，TRPC-5)形成鈣流，抑制神經(jīng)突觸的生長[11]。

目前國內(nèi)外對于控制血管性癡呆的進程尚無有效的藥物，從中醫(yī)藥寶庫中尋找方法和藥物不失為一種選擇。血管性癡呆在中醫(yī)屬“呆病”范疇，中醫(yī)認(rèn)為其由髓減腦消，神機失用引起[12]。髓海不足，腦髓空虛，腦竅失于濡養(yǎng)，導(dǎo)致智能低下、健忘等。髓由精所化，而精藏于腎，故髓由腎所主。腎精充足，則上充髓腦。腎藏先天之精，秉承于父母，需要有后天之精經(jīng)由五臟六腑之精所充養(yǎng)，故腦髓充盈與腎精及五臟六腑之精密切相關(guān)。脾屬土，位居中央，為氣血生化之源，臟腑之精充盛，與脾胃密不可分，因此補養(yǎng)脾腎，使臟腑精氣血得養(yǎng)，髓腦充盈，則腦主司精神、意識、思維等生理功能活動得以發(fā)揮，從而主宰生命運動。故對腦病的治療，尤以虛性病變，常采用補養(yǎng)之法治療[13-14]。加減薯蕷丸具有健脾補腎之功，方中何首烏制用補益精血，其主要成分二苯乙烯苷對于大鼠海馬超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量、自由基代謝具有改善作用，另外可以拮抗β淀粉樣蛋白和過氧化氫所致的神經(jīng)細(xì)胞存活率下降，具有神經(jīng)保護作用[15]。熟地黃補血養(yǎng)陰，填精益髓，其有效成分地黃寡糖可通過提高海馬乙酰膽堿的含量改善認(rèn)知功能[15]。山藥補益三焦，其富含薯蕷皂苷元、黏液質(zhì)、膽堿、游離氨基酸等物質(zhì)，可提高人體細(xì)胞免疫及體液免疫功能，并有降血糖、抗氧化等作用[16]。

本實驗結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長，穿越平臺次數(shù)減少，平臺象限停留時間縮短,大鼠海馬區(qū)NT-3表達(dá)水平明顯下降；與模型組比較，中藥組大鼠逃避潛伏期明顯縮短,穿越平臺次數(shù)增加，平臺象限停留時間延長,大鼠海馬區(qū)NT-3表達(dá)顯著升高。提示模型大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力損傷，而加水平減薯蕷丸可改善模型大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，具有神經(jīng)營養(yǎng)及保護功能。

綜上所述，加減薯蕷丸可能通過提高海馬區(qū)NT-3表達(dá)水平，影響神經(jīng)突觸可塑性，從而發(fā)揮對抗血管性癡呆的作用，這一研究有助于對加減薯蕷丸治療血管性癡呆的機制有更好的認(rèn)識。

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Study on the expression of neurotrophin in the hippocampus of vascular dementia rats and the intervention mechanism of Modified Yam Pill

TAN Zihu1, CHEN Yan2

(1. Hubei Provincial Hospital of TCM, Wuhan 430060，Hubei, China; 2. Clinical College of Chinese Medicine, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430060, Hubei, China)

Objective It is to observe the influence of Modified Yam Pill (MYP) on the expression of Neurotropin-3 (NT-3) in the hippocampus of vascular dementia rats, and explore the possible mechanism of improving learning and memory. Methods 60 cases of male Wistar rats in SPF grade were selected, 20 cases of them were randomly selected as sham operation group, and the others were treated by bilateral common carotid artery ligation and cut to make vascular dementia model. 40 cases of successful rat model were randomly divided into model group and Chinese medicine group with 20 cases in each groups, the animals were given 0.01 mL/g MYP to fill the stomach in Chinese medicine group, and the other two groups were given the same amount of normal saline, 1 times per day. Morris test was carried out after 8 weeks of filling the stomach, the hippocampal tissue was taken to detect the expression level of NT-3 using fluorescence PCR method after the Morris test. Results Compared with sham operation group, the escape latency was significantly longer, and the number of cross platform was reduced, and the platform quadrant dwell time was shorter, and the expression of NT-3 in hippocampus was decreased significantly in the model group, there were significant difference (allP<0.05). Compared with model group, the escape latency was significantly shorten, and the number of cross platform was increase, and the platform quadrant dwell time was longer, and the expression of NT-3 in hippocampus was increased in the Chinese medicine group, there were significant difference (allP<0.05). Conclusion MYP can enhance the expression of NT-3 in the hippocampus, and affect the plasticity of the synapse, so as to play a role in anti vascular dementia.

譚子虎，男，博士，教授，主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療心腦血管疾病的研究工作。

湖北省科技廳自然基金資助項目(2010CDB11002)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.18.001

R-332

A

1008-8849(2016)18-1939-04

2015-11-10