邵紅霞，趙 巍，黃 健，錢 琨，葉建強(qiáng)，秦愛(ài)建

（1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州225009；2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

·研究論文·

不同ELISA試劑盒檢測(cè)牛結(jié)核病效果比較

邵紅霞1,2，趙 巍1,2，黃 健1,2，錢 琨1,2，葉建強(qiáng)1,2，秦愛(ài)建1,2

（1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州225009；2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

本研究對(duì)自行研制的檢測(cè)牛γ干擾素的雙夾心ELISA試劑盒與商品化試劑盒進(jìn)行了比較。用自行研制的雙夾心ELISA試劑盒對(duì)1255份經(jīng)牛PPD刺激的牛全血培養(yǎng)上清樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)94份陽(yáng)性樣品，檢測(cè)陽(yáng)性率為7.5%。同時(shí)用進(jìn)口的ELISA試劑盒對(duì)其中的472份樣品進(jìn)行了對(duì)比檢測(cè)，兩者陽(yáng)性符合率為97.6%，陰性符合率為96.4%，總符合率為96.6%。比較檢測(cè)結(jié)果證明，自行研制的檢測(cè)牛γ干擾素的雙夾心ELISA試劑盒有很好的應(yīng)用前景。

檢測(cè)牛γ干擾素；雙夾心ELISA；比較

牛結(jié)核?。╞ovine tuberculosis）是由分支桿菌感染引起的一種慢性消耗性的人畜共患病，不僅對(duì)畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生嚴(yán)重影響，而且還威脅人類的健康[1]。近年來(lái)，人結(jié)核病雖然處于有效控制中，但是仍然呈現(xiàn)一種緩慢上升趨勢(shì)[2]。根據(jù)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2011年我國(guó)感染肺結(jié)核的人數(shù)為953 275，死亡人數(shù)為2840。值得注意的是，人結(jié)核病中有10%左右是由牛結(jié)核分枝桿菌引起的。因此，牛結(jié)核病的有效診斷和防治，對(duì)控制人結(jié)核病具有十分重要的公共衛(wèi)生意義。目前，我國(guó)牛結(jié)核病的檢測(cè)方法主要有細(xì)菌學(xué)方法、PCR方法和免疫學(xué)方法等[9]。細(xì)菌學(xué)檢測(cè)雖然能確診牛結(jié)核，但是由于牛結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，分離率低，且需要特定實(shí)驗(yàn)室，因此細(xì)菌學(xué)檢測(cè)應(yīng)用不廣[10]。PCR目前未能有效應(yīng)用于牛結(jié)核的檢測(cè)與診斷中。免疫學(xué)方法主要有結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和γ干擾素-ELISA[5,6]。皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)由于其敏感性和特異性問(wèn)題逐漸被淘汰。牛γ干擾素檢測(cè)牛結(jié)核的商用ELISA 試劑盒已經(jīng)在澳大利亞和歐美一些國(guó)家得到了廣泛的應(yīng)用[7]，已被OIE列為牛結(jié)核病診斷方法之一。本研究應(yīng)用兩株特異性抗牛γ干擾素單克隆抗體3E1和6E5，建立了檢測(cè)牛γ干擾素雙夾心ELISA試劑盒，對(duì)臨床樣本進(jìn)行了檢測(cè)，并與商品化ELISA試劑盒進(jìn)行了比較。

1　材料與方法

1.1材料 BPPD購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；酶標(biāo)儀購(gòu)自BioTek公司；檢測(cè)牛γ干擾素雙夾心ELISA試劑盒，為本實(shí)驗(yàn)室研制[3,4]和商品化的BOVIGAM采集試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 牛全血培養(yǎng)

1．2．1．1 采血 無(wú)菌采集12頭牛的抗凝血，每頭5ml。采集好的血液（含有抗凝劑）輕輕顛倒幾次充分混合。采血后30 h內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)（抗凝血不能貯存于冰箱中）。

1．2．1．2 血液培養(yǎng) 血液培養(yǎng)前輕輕顛倒，充分混勻。由于本試驗(yàn)需要活的淋巴細(xì)胞，因此需要將細(xì)胞損傷降至最低。將12頭牛的血液樣品依次，且每頭牛的血液樣品加入24孔培養(yǎng)板，加2孔，每孔1．5 mL。用一次性自動(dòng)移液器或吸管在無(wú)菌條件下進(jìn)行操作。

1．2．1．3 加入刺激原 每頭牛的血液樣品，一孔無(wú)菌加入100μL PBS（陰性抗原對(duì)照）和一孔無(wú)菌加入100μL 牛型提純結(jié)核菌素（purified protein derivative from M·bovis，BPPD）。注：抗原必須與血液充分混勻，最好用一個(gè)微量振蕩器高速振蕩1

min。如果沒(méi)有合適的儀器，將培養(yǎng)板及其蓋緊緊固定在一起，在光滑的表面上順時(shí)針和逆時(shí)針各旋轉(zhuǎn)10次。小心操作不要引起交叉污染，也不要讓血液附在蓋上，避免血液起泡。只有刺激抗原與血液完全混合，試驗(yàn)才能達(dá)到最佳效果。

1．2．1．4 孵育 將含有血液和抗原的培養(yǎng)板放于37℃，CO2濕溫培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1．2．1．5 血漿樣品的收獲 用可調(diào)移液器小心吸取上層血漿，轉(zhuǎn)入獨(dú)立的1．5 mL離心管中。吸取血漿時(shí)應(yīng)盡量避免吸入細(xì)胞，若吸入少量紅細(xì)胞進(jìn)行離心去除。

1．2．1．6 血漿的貯存 血漿可在2℃～8℃貯存7 d，在-20℃可貯存幾個(gè)月。貯存前，每個(gè)貯存管必須用合適的蓋子密封。檢測(cè)前，樣品需恢復(fù)至室溫并充分混勻。

1.2.2 試劑盒檢測(cè) 用自行研制的雙夾心ELISA試劑盒對(duì)經(jīng)BPPD刺激的1255份牛全血上清中牛γ干擾素進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用進(jìn)口的BOVIGAM試劑盒對(duì)其中的472份樣本進(jìn)行了同步對(duì)比檢測(cè)與分析。

2　結(jié)果

2.1 自行研制試劑盒與進(jìn)口試劑盒對(duì)牛γ-干擾素檢測(cè)結(jié)果 用自行研制的雙夾心ELISA試劑盒對(duì)1255份牛全血刺激上清中牛γ-干擾素進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)94份陽(yáng)性樣品，檢測(cè)陽(yáng)性率為7．5%。同時(shí)用進(jìn)口的ELISA試劑盒對(duì)其中的472份牛全血刺激上清進(jìn)行了對(duì)比檢測(cè)。在這472份樣品中，進(jìn)口的ELISA試劑盒檢出82份陽(yáng)性，自制ELISA試劑盒檢出94份陽(yáng)性樣品，其中80份陰性樣品與進(jìn)口ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果相同，陽(yáng)性符合率為 80/82=97．6%。自制ELISA試劑盒檢出陰性樣品376份，與進(jìn)口ELISA試劑盒陰性符合率為376/390=96．4%，總符合率為（80+376）/（82+390）=96．6%。

2.2 不同奶牛場(chǎng)檢測(cè)結(jié)果分析 對(duì)某地區(qū)奶牛場(chǎng)A奶牛采樣875份牛血樣，選取部分樣本，用自制試劑盒進(jìn)口試劑盒進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果在所比對(duì)的346份樣本中，進(jìn)口試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性樣本數(shù)為46份，自行研制的試劑盒陽(yáng)性樣本數(shù)為52份，共同陽(yáng)性的樣本數(shù)為45份，共同陰性的樣本為293份，總符合率為97．7%。陽(yáng)性樣本的檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

圖1　自制試劑盒與進(jìn)口試劑盒BPPD刺激與PBS刺激OD值差（陽(yáng)性）Fig.1 Comparison of the sandwich ELISA with commercial ELISA kit for OD of BPPD-PBS

對(duì)某奶牛場(chǎng)B的奶牛采樣22份，用自行研制試劑盒和進(jìn)口試劑盒同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果自制試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性樣本為5份，進(jìn)口試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性樣本為4份，共同檢測(cè)出的陽(yáng)性樣本為4份，共同陰性樣本為17份，符合率為95．5%。檢測(cè)結(jié)果詳見(jiàn)圖2。

對(duì)某奶牛場(chǎng)C的奶牛采樣92份牛血樣，自制ELISA試劑盒檢測(cè)出18份陽(yáng)性樣品，74份陰性樣品。進(jìn)口試劑盒檢測(cè)出16份陽(yáng)性樣品，76份陰性樣品。兩者共同檢測(cè)出的陽(yáng)性樣品15份，陰性樣品73份，總符合率為95．7%，陰性樣本檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

對(duì)某奶牛場(chǎng)D的奶牛，選取10份牛血樣，用自制試劑盒與進(jìn)口試劑盒方法檢測(cè)結(jié)果均顯示，陽(yáng)性樣品8份，陰性樣品2份。符合率為100%，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖2　自制試劑盒與進(jìn)口試劑盒BPPD刺激與PBS刺激OD值差Fig.2 Comparison of the sandwich ELISA with commercial ELISA kit for OD of BPPD--PBS

圖3　自制試劑盒與進(jìn)口試劑盒BPPD刺激與PBS刺激OD值差Fig.3 Comparison of the sandwich ELISA with commercial ELISA kit for OD of BPPD-PBS

圖4　自制試劑盒與進(jìn)口試劑盒BPPD刺激與PBS刺激OD值差Fig.4 Comparison of the sandwich ELISA with commercial ELISA kit for OD of BPPD-PBS

3　討論

牛結(jié)核是一種由牛分枝桿菌引起的臨床癥狀不典型的慢性消耗性疾病。因此，早期臨床檢查與診斷比較困難。在免疫學(xué)檢測(cè)方法中，結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)被廣泛使用，但其靈敏性和特異性不高，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。1990年，Wood等[5]建立了通過(guò)檢測(cè)經(jīng)牛PPD刺激的牛全血釋放出來(lái)的γ干擾素，從而診斷牛結(jié)核病的ELISA方法。牛結(jié)核病γ干擾素檢測(cè)方法具有特異性好、靈敏度高等特點(diǎn)。目前，商品化的γ干擾素ELISA檢測(cè)試劑盒已在澳大利亞和歐美的一些國(guó)家得到應(yīng)用[8,10,11]，在我國(guó)也有一定應(yīng)用，但是價(jià)格十分昂貴。我國(guó)農(nóng)業(yè)部已提出凈化牛結(jié)核，并在十三五作為主要目標(biāo)進(jìn)行落實(shí)。因此，研制出高質(zhì)量的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的γ干擾素檢測(cè)試劑盒具有重要意義。本研究應(yīng)用自行研制的試劑盒能夠有效用于經(jīng)PPD刺激的牛全血培養(yǎng)中釋放出的牛γ干擾素，從而對(duì)牛結(jié)核病進(jìn)行快速診斷。與進(jìn)口商品化ELISA試劑盒比較研究發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性符合率為97．6%、陰性符合率為96．4%，總符合率達(dá)96．6%。這些結(jié)果證明，自行研制的雙夾心ELISA試劑盒具有良好的特異性和靈敏性，可以應(yīng)用于臨床樣本的檢測(cè)，為我國(guó)牛結(jié)核病的檢疫和根除提供了一種實(shí)用、快速、有效的檢測(cè)工具，并展示了很好的應(yīng)用價(jià)值。

[1] 劉思國(guó), 于輝． 牛結(jié)核病研究進(jìn)展[J]． 畜牧獸醫(yī)科技信息，2003, 19(10): 10-14．

[2] Humblet M F, Boschiroli M L, Saegerman C．Classification of worldwide bovine tuberculosis risk factors in cattle: a stratified approach[J]． Vet Res, 2009, 40(5): 50．

[3] 黃大盧． BoIFN-γ 基因的原核表達(dá)及其單克隆抗體的研制[D]． 揚(yáng)州: 揚(yáng)州大學(xué), 2012．

[4] 黃健． 牛結(jié)核病診斷方法的建立及初步應(yīng)用[D]． 揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué), 2015．

[5] Wood P R, Corner L A, Placjett P． Development of a simple, rapid in vitro cellular assay for bovine tuberculosis based on the production of gamma interferon[J]． Res Vet cSi, 1990, 49(1): 46-49．

[6] 袁群芳． IFN-γ體外釋放法檢測(cè)牛結(jié)核病[J]． 中國(guó)動(dòng)物保健, 2014, 16(7): 32-35．

[7] Denis Mi, Wedlock D N, McCarthy A R, et al．Enhancement of the sensitivity of the whole-blood gamma interferon assay for diagnosis of Mycobacterium bovis infections in cattle[J]． Clin Vaccine Immunol, 2007, 14(11): 1483-1489．

[8] de la Rua-Domenech R, Goodchild A T, Vordermeier H M, et al． Antemortem diagnosis of tuberculosis in cattle: a review of the tuberculin tests, gamma-interferon assay and other ancillary diagnostic techniques[J]． Res Vet Sci, 2006, 81(2): 190-210．

[9] Sarnaik R M, Sharma M, Kate S K, et al． Serodiagnosis of tuberculosis:assessment of kaolin agglutination test[J]．Tuber Lung Dis, 1993, 74(6): 405-406．

[10] 陳祥． γ-干擾素試驗(yàn)和皮試變態(tài)反應(yīng)對(duì)檢測(cè)奶牛結(jié)核病的比較[J]． 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2011, 27(2), 97-100．

[11] EmmerzaalA, Deleu S． Cattle tuberculosis: caused by Mycobacterium bovine is difficult to detect and to treat [J]．Veehouderen Dierenarts, 2000, 14(2): 4-7．

COMPARISON OF DIFFERENT ELISA KITS FOR DETECTION OF BOVINE γ-IFN

SHAO Hong-xia1,2, ZHAO Wei1,2, HUANG Jian1,2, QIAN Kun1,2, YE Jian-qiang1,2, QIN Ai-jian1,2
(1. Ministry of Education Key Laboratory for Avian Preventive Medicine, Key Laboratory of Jiangsu Preventive Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

To select high quality diagnostic kit for bovine tuberculosis, the domestic sandwich ELISA developed in our laboratory and a commercial ELISA kit were compared for detection of bovine γ-IFN in whole blood stimulated with BPPD. The positive percentage was 7.5% (94/1,255) with the domestic sandwich ELISA. Furthermore, 472 of these 1,255 samples were tested in both ELISA kits. Our data showed that the positive, negative and total agreement between the two ELISAs were 97.6%, 96.4% and 96.6%, respectively. The direct comparison demonstrated that the domestic sandwich ELISA developed in our laboratory had promising application for detection of bovine γ-IFN.

Bovine γ-IFN; sandwich ELISA; comparison

S852.618

A

1674-6422（2016）05-0029-04

2016-01-06

江蘇省科技支撐計(jì)劃（BE2013391）；江蘇省優(yōu)勢(shì)學(xué)科項(xiàng)目

邵紅霞，女，博士，講師，主要從事動(dòng)物病原學(xué)研究

秦愛(ài)建，E-mail : aijian@yzu．edu．cn