錢 琨，趙 巍，黃大盧，邵紅霞,4，秦愛建

（1.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州 225009；2.江蘇省動物預防醫(yī)學重點實驗室，揚州 225009；3.教育部禽類預防醫(yī)學重點實驗室，揚州 225009；4.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

·研究論文·

夾心ELISA檢測牛γ-干擾素方法的建立及應用

錢 琨1,2,3,4，趙 巍2,3，黃大盧2,3，邵紅霞2,3,4，秦愛建1,2,3,4

（1.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州 225009；2.江蘇省動物預防醫(yī)學重點實驗室，揚州 225009；3.教育部禽類預防醫(yī)學重點實驗室，揚州 225009；4.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

為建立檢測牛γ-干擾素（BoIFN-γ）的雙夾心ELISA方法，將前期獲得的針對BoIFN-γ的單克隆抗體作為捕捉抗體進行夾心ELISA檢測天然BoIFN-γ，結果表明單克隆抗體BoIFN-γ-6E5、BoIFN-γ-3E1、BoIFN-γ-3C2三株能捕捉到天然的牛γ干擾素。經(jīng)過條件摸索和優(yōu)化，最終建立了以3E1/HRP-6E5為最佳組合的檢測BoIFN-γ的夾心ELISA方法。用建立的雙夾心ELISA檢測方法和進口試劑盒同時對66份血樣進行檢測，結果表明雙夾心ELISA方法和進口試劑盒檢測結果的符合率達95.45%，說明該方法能有效地對牛結核病γ-干擾素進行檢測。

牛γ-干擾素；雙夾心ELISA；應用

牛結核病（bovine tuberculosis）是一種由結核分支桿菌引起的一種人畜共患病。人結核病中有10%左右是由牛結核分枝桿菌引起的。牛結核病的診斷及防治對控制人結核病具有十分重要的公共衛(wèi)生意義[1]。盡管動物的結核病在許多發(fā)達國家已經(jīng)被控制，但是在發(fā)展中國家，結核病在人類和家畜中仍是一個非常嚴重的問題。

牛結核的根除主要依靠診斷和凈化，國內(nèi)外用于診斷牛結核病的檢測主要有3種方法[2]：細菌學檢測法、分子生物學檢測法[3]、免疫學檢測法[4]。結合分枝桿菌培養(yǎng)法檢測時間長，不利于快速盡早地診斷結核病，不易達到早期阻斷結核病傳播的目的。分子生物學診斷法中的PCR法容易出現(xiàn)樣品間的交叉污染，同時還易出現(xiàn)假陽性和假陰性的結果。結核菌素（purified protein derivative，PPD）變態(tài)反應試驗結果主要是通過人肉眼判斷，所以會存在人為判斷誤差，同時它檢測的特異性差，時間長，同樣達不到快速診斷的目的，在臨床應用中靈敏度也不高，影響因素多[5]。1990年，Rothel等[6]建立了一種通過檢測γ-干擾素（interferon γ，IFN-γ）來檢測牛結核病的方法，由于其特異性好，靈敏度高的特點而被推廣。IFN-γ檢測法的田間試驗已在許多國家完成[7]，在愛爾蘭、澳大利亞和新西蘭等國家，IFN-γ正式試驗已被批準[8]。IFN-γ試驗的發(fā)展已成為牛結核病診斷的一個主要發(fā)展趨勢[9]，相關試劑盒在國外已商品化，但由于進口試劑盒價格昂貴，限制了其在我國的推廣應用。因此，本研究在前期制備得到針對牛γ-干擾素單克隆抗體的基礎上，建立了檢測牛γ-干擾素的雙夾心ELISA方法，為我國牛結核病的防控與根除提供技術支持。

1　材料與方法

1.1 抗體、待檢血樣與生物試劑 單克隆抗體BoIFN-γ-6E5、BovIFN-γ-3E1、BoIFN-γ-3C2、His-BoIFN-γ融合蛋白由本實驗室自行研制保存[10,11]；66份待檢牛血清樣品分別來自江蘇省、山東省和北京市；TMB購自AMRESCO公司；30%過氧化氫購自國藥集團化學試劑有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記兔抗鼠IgG 、OPD（鄰苯二胺）購自上海生工生物公司；澳大利亞的進口試劑盒Mycobacterium bovis Gamma interferon Test Kit for Cattle；辣根過氧化物酶標記試劑盒購于Thermo公司；抗體純化Protein G柱購于GE公司；其他有關試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 天然牛γ-干擾素的刺激 參照文獻[12]，用肝素抗凝管無菌采集江蘇省某牛場可疑的結核病牛全血，總共9份血樣，無菌環(huán)境下分裝到24孔板中，每孔1．5 mL，每個血樣設3個孔。分別加100μLBPPD、100μL APPD、100μL 1640，輕輕混勻，放置37℃、含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集全血上清檢測。

1.3 單克隆抗體與天然BoIFN-γ的反應性 按照文獻[12]進行，最終得到的陽性單抗利用過氧化物酶標記試劑盒標記進行后期的夾心ELISA實驗。

1.4 雙夾心ELISA檢測牛γ-干擾素方法的建立

14.1 最適包被抗體和最適酶標抗體的篩選及反應條件優(yōu)化 將能結合天然BoIFN-γ反應的抗體BoIFN-γ-6E5、BoIFN-γ-3E1、BoIFN-γ-3C2分別包被，同時酶標抗體HRP-BoIFN-γ-6E5、HRP-BoIFN-γ-3E1分別做雙夾心ELISA檢測天然BoIFN-γ，以最終確定夾心ELISA方法中的最佳包被單抗和最佳酶標抗體。參考文獻[11]，通過常規(guī)方法確定最佳包被抗體和酶標抗體的使用條件。

1.4.2 雙夾心ELISA靈敏度和特異性確定 將原核表達的His-BoIFN-γ按照10、5、2．5、1．25、0．7、0．3、0．1、0．01 μg/mL依次稀釋以每孔100 μL的量加入相應的孔中計算夾心ELISA方法的靈敏度；將建立的夾心ELISA方法檢測已知的陰性和陽性牛全血上清，同時用原核表達的His-BoIFN-γ作為陽性對照，確定夾心ELISA方法的特異性。

1.5 夾心ELISA方法的臨界值判定 選擇優(yōu)化好的ELISA條件，對已知的陽性以及陰性樣品與進口試劑盒進行比對檢測的基礎上，制定本ELISA的判定標準。

1.6 夾心ELISA方法的臨床應用 用建立好的夾心ELISA方法檢測臨床收集的66份樣品，同時與進口試劑盒檢測結果進行比較。

2　結果

2.1 單克隆抗體結合天然BoIFN-γ的反應結果 包被前期實驗篩選到的9株單抗，用HRP酶標抗BoIFN-γ抗體作為檢測抗體，檢測9株單抗是否能捕獲到已知陽性血清中天然的BoIFN-γ，結果顯示BoIFN-γ-6E5、BoIFN-γ-3E1、BoIFN-γ-3C2三株單抗能夠捕獲到天然BoIFN-γ，結果見表1。

表1　夾心ELISA檢測單抗與天然BoIFN-γ反應性結果Table 1 The results of McAb to natural BoIFN-γdetected by sandwish ELISA

2.2 3 株單抗識別的抗原表位分析結果 為了了解BoIFN-γ-6E5、BoIFN-γ-3E1、BoIFN-γ-3C2三株單抗是否針對不同的抗原表位，進行了單克隆抗體相加ELISA試驗，在抗體相加ELISA試驗中，當兩兩抗體疊加的AI值＞10%時，表明這兩種抗體所識別不同的抗原表位。從表2可知，3E1、3C2和6E5I識別不同的抗原表位。

表2　單抗相加ELISA試驗結果Table 2 Result of additive ELISA of monoclonalantibodies to BoIFN-γ

注：數(shù)值為AI值

Note: The data was the AI value

2.3 最適捕捉抗體和最適檢測抗體的配對實驗 將BoIFN-γ-6E5、BoIFN-γ-3E1、BoIFN-γ-3C2三株單抗作為捕捉抗體包被，酶標抗體HRP-BoIFN-γ-6E5和HRP-BoIFN-γ-3E1作為檢測抗體進行夾心ELISA，檢測已知的陽性和陰性牛全血上清。結果顯示，BoIFN-γ-3E1包被，用HRP-BoIFN-γ-6E5檢測時特異性和反應性都較好，結果見表3。

2.4 最佳捕捉抗體溶度和酶標檢測抗體濃度的確定 以直接ELISA方法檢測酶標抗體HRP- BoIFN-γ-6E5的最低稀釋度和工作濃度，以表達的His-BoIFN-γ融合蛋白為包被抗原，酶標抗體作系列稀釋，計算OD450平均值。直接ELISA結果表明，酶標結合物HRP-BoIFN-γ-6E5最佳工作濃度確定為0．09 μg/mL。

將捕捉抗體BoIFN-γ-3E1按照4、2、1、0．5、0．25、0．125、0．07、0．03 μg/孔包被反應板，每孔加樣的體積為100 μL，HRP- BoIFN-γ-6E5工作濃度為0．09 μg/mL，結果顯示BoIFN-γ-3 E1抗體最適包被量為0．5 μg/孔。

2.5 雙夾心ELISA檢測方法的靈敏度與特異性 將BoIFN-γ-3E1按照0．5 μg/孔包被；將原核表達的His-BoIFN-γ融合蛋白作為檢測抗原按照10 μg/mL、5 μg/mL、0．5 μg/mL、0．05 μg/mL、0．005 μg/mL、0．0005 μg/mL濃度梯度稀釋，每孔加樣100 μL；HRP- BoIFN-γ-6 E5按照1:4 000工作濃度稀釋。夾心ELISA結果顯示，檢測原核表達rBoIFN-γ的靈敏度為0．5 ng，結果見表4。同樣的方法檢測抗原為His-BoIFN-γ融合蛋白、His蛋白、試劑盒檢測出的含天然BoIFN-γ牛全血上清和不含天然BoIFN-γ陰性牛全血上清，結果顯示雙夾心ELISA方法既不與His蛋白反應也不與陰性牛全血上清反應，說明該方法特異性較好，結果見表5。

表3　包被抗體和檢測抗體的篩選Table 3 The selection of detecting antibody

表4　夾心ELISA檢測rBoIFN-γ的靈敏性結果Table 4 The sensitivity results of sandwich ELISA to detect rBoIFN-γ

表5　夾心ELISA檢測BoIFN-γ結果Table 5 The results of sandwich ELISA to detect BoIFN-γ

2.6 雙夾心ELISA檢測方法臨界值的確定 對已知的陽性以及陰性樣品與進口試劑盒進行比對檢測的基礎上，制定了本ELISA的判定標準：當BPPD的OD450-1640的OD450≥0．15，且BPPD的OD450-APPD的OD450≥0．1，判斷為陽性；BPPD的OD450-1640的OD450＜0．15，或者BPPD的OD450-APPD的OD450＜0．15判斷為陰性。

2.7 雙夾心ELISA檢測方法的臨床檢測 利用本研究建立的雙夾心ELISA方法檢測分別來自北京市、江蘇省和山東省的共66份牛血樣，雙夾心ELISA方法檢測到陽性樣品36份，陰性樣品30份，所檢測結果與進口試劑盒結果相比較，符合率達95．45%。具體檢測結果見表6。

表6　雙夾心ELISA與進口試劑盒對比實驗Table 6 Comparison of the results between the sandwichELISA and commercial ELISA kit

3　討論

結核病是威脅人類健康的重大疫病之一，世界衛(wèi)生組織對結核病的防控一直保持高度重視，每年投入的結核病的防控治療基金也在逐年上升[13]。牛結核病是由牛分枝桿菌引起的慢性消耗性傳染病，是一種能夠傳染人的人畜共患病。近年來人結核病雖然已經(jīng)有所控制，但是仍然呈現(xiàn)一種緩慢上升趨勢[14]，并且人結核病中有一部分病例是牛結核分枝桿菌引起的。同時牛結核病也嚴重影響全球奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，并嚴重阻礙著國際貿(mào)易的正常進行[15]。所以對牛結核病的防治具有十分重大的公共衛(wèi)生意義，我國長期發(fā)展規(guī)劃中也將牛結核病列為動物重要疫病之一。

目前，國內(nèi)外檢測牛結核的方法主要有細菌學方法、PCR方法和免疫學方法等[2]。在免疫學檢測方法中，結核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應被廣泛使用，但其靈敏性和特異性不高，檢測時間較長。1990年，Wood等[6]建立了通過檢測經(jīng)牛PPD刺激的牛全血釋放出來的γ干擾素，從而診斷牛結核病的ELISA方法。牛結核分枝桿菌侵染機體后會刺激機體淋巴細胞形成記憶淋巴細胞，即會使淋巴細胞致敏。因此將無菌采集到的牛血用牛結核分枝桿菌的特異性抗原（BPPD）再次刺激，就會導致全血中的致敏淋巴細胞被活化，短時間釋放出大量的γ-干擾素，因此就可以通過檢查牛全血上清中的γ-干擾素來達到檢查牛結核病的目的。這種方法雖然需要一定的實驗技術和實驗條件，但是作為結核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應的有益補充，已經(jīng)幫助許多國家控制或根除了牛結核病。牛結核病在我國部分地區(qū)仍然存在，目前生產(chǎn)一線的檢測方法還停留在結核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應方法的應用。由于進口檢測試劑盒價格昂貴，無法大范圍推廣應用，因此我國急需自主研發(fā)具有完全獨立知識產(chǎn)權的檢測牛γ-干擾素的檢測方法。

本研究利用2株針對不同抗原表位，并能結合天然牛γ-干擾素的單克隆抗體建立了雙夾心ELISA檢測方法，能檢測到0．5 ng原核表達的rBoIFN-γ。在66份臨床樣品的對比檢測中，自制的雙夾心ELISA檢測方法檢測到36份陽性樣品，而進口試劑盒僅檢測到其中的33份，陰性樣品檢測結果一致，這其中差異的3份牛血清樣品，還有待利用其他的方法來確定，同時還需要更多的檢測樣品來補充和完善應用結果數(shù)據(jù)。此外，自制雙夾心ELISA檢測方法檢測靈敏度還可以進一步提高，從而提高檢測方法的靈敏性。

本研究成功建立了單抗雙夾心ELISA檢測牛γ-干擾素方法，可以應用于臨床樣本的檢測，并且該方法與進口試劑盒檢測結果符合率高，為今后牛γ-干擾素檢測試劑盒的研發(fā)打下基礎，為我國牛結核病的檢疫和根除提供了一種實用、有效的檢測方法，具有很好的應用價值。

[1] Humblet M F, Boschiroli M L, Saegerman C． Classification of worldwide bovine tuberculosis risk factors in cattle: a stratified approach[J]． Vet Res, 2009, 40(5): 50．

[2] Sarnaik R M, Sharma M, Kate S K, et al． Serodiagnosis of tuberculosis: assessment of kaolin agglutination test[J]．Tuber Lung Dis, 1993, 74(6): 405-406．

[3] Dalovisio J R, Montenegro-James S, Kemmerly S A, et al． Comparison of the amplified Mycobacterium tuberculosis (MTB) direct test, Amplicor MTB PCR, and IS6110-PCR for detection of MTB in respiratory specimens[J]． Clin Infect Dis, 1996． 23(5): 1099-1106．

[4] Sugden E A, Stilwell K, Rohonczy E B, et al． Competitive and indirect enzyme-linked immunosorbent assays for Mycobacterium bovis infections based on MPB70 and lipoarabinomannan antigens[J]． Can J Vet Res, 1997, 61(1): 8-14．

[5] Corrin K C, Carter C E, Kissling R C, et al． An evaluation of the comparative tuberculin skin test for detecting tuberculosis in farmed deer[J]． N Z Vet J, 1993, 41(1): 12-20．

[6] Rothel J S, Jones S L, Corner L A, et al． A sandwich enzyme immunoassay for bovine interferon-gamma and its use for the detection of tuberculosis in cattle[J]． Aust Vet J, 1990, 67(4): 134-137．

[7] Ameni G, Mi?rner H, Roger F, et al． Comparison between comparative tuberculin and gamma-interferon tests for the diagnosis of bovine tuberculosis in Ethiopia[J]． Trop Anim Health Prod, 2000, 32(5): 267-276．

[8] González Llamazares O R, Gutiérrez Martín C B, Alvarez Nistal D, et al． Field evaluation of the single intradermal cervical tuberculin test and the interferongamma assay for detection and eradication of bovine tuberculosis in Spain[J]． Vet Microbiol, 1999, 70(1-2): 55-66．

[9] Pollock J M, Neill S D． Mycobacterium bovis infection and tuberculosis in cattle[J]． Vet J, 2002, 163(2): 115-127．

[10] 許金?。?奶牛干擾素-γ基因的表達及其在乳房炎防治中的初步應用[D]． 揚州: 揚州大學, 2005．

[11] 尹天燕． γ-干擾素介導牛結核快速檢測方法的研究及初步應用[D]． 揚州: 揚州大學, 2010．

[12] 黃大盧． BoIFN-γ基因的原核表達及其單克隆抗體的研制[D]． 揚州: 揚州大學, 2012．

[13] Sattah M V, Aye S S, Azen C, et al． Interferon-gamma release assay T-SPOT．TB and HIV-related tuberculosis[J]． Int J Tuberc Lung Dis, 2012, 16(2): 281-282．

[14] Humblet M F, Boschiroli M L, Saegerman C．Classification of worldwide bovine tuberculosis risk factors in cattle: a stratified approach[J]． Vet Res, 2009, 40(5): 50．

[15] Sabio y García J V, Bigi F, Rossetti O, et al． Expression of MPB83 from Mycobacterium bovis in Brucella abortus S19 induces specific cellular immune response against the recombinant antigen in BALB/c mice[J]． Microbes Infect, 2010, 12(14-15): 1236-1243．

DEVELOPMENT AND APPLICATION OF SANDWICH ELISA FOR DETECTING BOVINE INTERFERON GAMMA

QIAN Kun1,2,3,4, ZHAO Wei2,3, HUNAG Da-lu2,3, SHAO Hong-xia2,3,4, QIN Ai-jian1,2,3,4
(1. Colledge of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2. Key Laboratory of Jiangsu Preventive Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 3. Ministry of Education Key Lab for Avian Preventive Medicine, Yangzhou 225009, China; 4. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

To develop a sandwich ELISA for detection of bovine interferon γ (BoIFN-γ), 3 monoclonal antibodies against BoIFN-γ were tested as capture antibodies. All of 3 monoclonal antibodies recognized BoIFN-γ. The sandwich ELISA method was optimized and monoclonal antibody 3E1 was determined as the capture antibody. Total 66 serum samples from different regions were tested using the sandwich ELISA developed here and a commercial ELISA kit. The agreement between these two methods was 95.45%, suggesting the promising possibility of the sandwich ELISA for effective detection of BoIFN-γ in bovine tuberculosis disease.

Bovine interferon γ; sandwich ELISA; application

S852.4

A

1674-6422（2016）05-0057-06

2016-01-18

江蘇省科技支撐計劃（BE2013391）；江蘇省優(yōu)勢學科項目

錢 琨，男，博士，主要從事動物傳染病研究

秦愛建，E-mail：aijian@yzu．edu．cn