樊輕亞，張宏輝，王萬好

(1.信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，河南 信陽 464000；2.河南同源制藥有限公司，河南 信陽 464000)

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樹脂法分離純化倒提壺生物堿的研究

樊輕亞1*，張宏輝1，王萬好2

(1.信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，河南 信陽 464000；2.河南同源制藥有限公司，河南 信陽 464000)

采用陽離子交換樹脂和大孔吸附樹脂聯(lián)用的方法，將倒提壺生物堿提取液依次經(jīng)過陽離子交換樹脂和兩次大孔吸附樹脂，對其中的天芥菜堿和毛果天芥菜堿進行分離純化。結(jié)果表明，倒提壺生物堿溶液采用陽離子交換樹脂經(jīng)過水洗和NaCl洗脫與大孔吸附樹脂兩次經(jīng)乙醚和50%乙醇洗脫后，毛果天芥菜堿與天芥菜堿的純度分別從0.73%和2.2%提高至81.6%和79.2%，提取量分別由4.6 mg/g和10.7 mg/g提高至50.6 mg/g和92.7 mg/g。該文所建立的分離純化方法具有成本低、污染小、周期短、操作簡便和分離純化效率高等特點，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

陽離子交換樹脂；大孔吸附樹脂；倒提壺生物堿；天芥菜堿；毛果天芥菜堿；分離；純化

倒提壺(CynoglossumamabileStapfetDrumm)是紫草科琉璃草屬植物，分布于不丹及中國的西藏、云南、貴州、四川等地。倒提壺全草入藥，其味苦、性涼，有清熱利濕，散瘀止血、止咳、鎮(zhèn)痛之功效。倒提壺可內(nèi)服或外用，常用以治療瘧疾、肝炎、痢疾、咳嗽、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、尿道炎等癥[1-3]。生物堿為本屬植物的主要成分，具有廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、抗菌、抑制微生物等。劉清華等[4]對天芥菜堿和毛果天芥菜堿的藥理活性作了大量研究。

20世紀70年代末，樹脂吸附逐漸用于天然藥物有效成分的提取分離，由于其物理化學(xué)穩(wěn)定性高，吸附選擇性獨特，再生簡便，使用周期長，宜于構(gòu)成閉路循環(huán)，節(jié)省費用等諸多優(yōu)點，在中藥有效成分的提取分離方面迅速得到廣泛運用，并成功地用于生物堿、黃酮、皂苷等多類成分的提取純化[5-17]。

圖1 天芥菜堿(A)和毛果天芥菜堿(B)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of heliotrine(A) and lasiocarpine(B)

本文采用大孔吸附樹脂分離純化倒提壺提取液中的生物堿成分，通過比較不同類型樹脂的性質(zhì)，研究了pH值、上樣液濃度、洗脫劑類型對分離純化的影響，并采用高效液相色譜(HPLC)法對天芥菜堿和毛果天芥菜堿(結(jié)構(gòu)式見圖1)含量進行分析，研究了樹脂的吸附和解吸附性能，獲得了適合天芥菜堿和毛果天芥菜堿的分離純化工藝。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

DFY-200搖擺式高速中藥粉碎機(溫嶺市大德中藥機械有限公司)；B-260型恒溫水浴(上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司)；SHZD(A)型循環(huán)水真空泵(天津華鑫儀器廠)；AY-120電子天平(日本Shimaduz公司)；CR3i緊湊型離心機(德國Thermo Scientific公司)；Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。

天芥菜堿、毛果天芥菜堿對照品(純度98.5%，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司)；鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、乙酸、甲醇、氯仿、乙醚、氨水(分析純，鄭州德眾化學(xué)試劑廠)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Merck 公司)；倒提壺(安徽亳州市藥材有限公司)經(jīng)信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院中藥鑒定學(xué)教研室吳長忠老師鑒定為倒提壺(CynoglossumamabileStapfetDrumm) 全草；001×732陽離子交換樹脂(蚌埠市遼源新材料有限公司)；BS-65，BS-30，CAD-45，D101大孔吸附樹脂(蚌埠市遼源新材料有限公司)；HPD-400樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；實驗用水為去離子水。

1.2 實驗方法

1.2.1 樹脂的預(yù)處理 陽離子交換樹脂于水中浸泡24 h后取出，置于2 mol/L HCl溶液中浸泡4 h，然后用水洗滌至中性，用2 mol/L NaOH浸泡4 h，再用水洗滌至中性，浸泡于2 mol/L HCl溶液中備用，臨用前用水洗滌至中性即可。

大孔吸附樹脂用無水乙醇浸泡24 h使其充分溶脹后取出，用無水乙醇洗去其中的添加劑，直至不產(chǎn)生白色渾濁為止，再浸泡于無水乙醇中備用，臨用前用水洗滌至無醇味即可。

1.2.2 上樣液的制備 將處理好的樹脂徐徐加入層析柱中，同時打開活塞，使樹脂在溶劑的流動作用下沉降并堆積成樹脂床后，用水洗去原來的溶劑，然后將水放出直至液面與樹脂床床面相平，關(guān)閉活塞。對于陽離子交換樹脂，流出液應(yīng)沖洗至中性，對于大孔吸附樹脂，流出液無醇味即可。

干燥后的倒提壺藥材進行粉碎，過篩得100目藥材粉末。稱取藥材粉末60 g于500 mL圓底燒瓶中，加入360 mL 0.3%的HCl溶液，在90 ℃下回流提取1.5 h，過濾，收集濾液。重復(fù)3次，合并3次濾液，混合均勻即得提取液。將提取液在3 500 r/min下離心5 min，取上清液為上樣液。上樣液在低溫下貯藏，備用。

1.2.3 樣品的分離純化 ①陽離子交換樹脂洗脫：取處理好的001×732陽離子交換樹脂20 mL進行濕法裝柱，上樣液放至室溫，用2 mol/L HCl溶液調(diào)至pH 2.0后進行上樣，上樣量為100 mL，流速控制為2 mL/min，用100 mL 水洗去非離子性成分，再用520 mL的1 mol/L NaCl溶液以相同流速進行洗脫，收集洗脫液，備用。

樣品檢測：取5 mL NaCl洗脫液，用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)至pH 10.0，揮干后加10 mL甲醇，超聲處理后過濾，濾渣加10 mL甲醇，超聲后過濾，合并濾液，揮干，甲醇定容至5 mL，進行HPLC分析。

②第一次大孔吸附樹脂洗脫：取處理好的BS-65大孔吸附樹脂80 mL進行濕法裝柱，陽離子交換樹脂的洗脫液用2 mol/L NaOH堿化至pH 10.0后以2 mL/min的流速進行上樣，采用160 mL pH 9.0的堿水洗去水溶性雜質(zhì)后，在相同流速下用100 mL的乙醚洗脫得到天芥菜堿，改用200 mL的50%乙醇水溶液洗脫即得毛果天芥菜堿。各自揮干，定容，進行HPLC分析。

③第二次大孔吸附樹脂洗脫：取乙醚洗脫液水浴揮干，用50 mL水溶解，調(diào)至pH 10.0后，用100 mL pH 9.0的堿水洗去水溶性雜質(zhì)，通過80 mL的大孔吸附樹脂BS-65，用100 mL乙醚以2 mL/min的流速洗脫，收集洗脫液，得天芥菜堿溶液。揮干，定容，進行HPLC分析。

取50%乙醇水溶液洗脫液水浴揮干，用50 mL水溶解，調(diào)至pH 10.0后，以100 mL pH 9.0的堿水洗去水溶性雜質(zhì)，通過80 mL的大孔吸附樹脂BS-65，用200 mL 50%乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，得毛果天芥菜堿溶液。揮干，定容，進行HPLC分析。

1.2.4 色譜分析條件 ①HPLC分析[16-17]：將上述處理液用0.45 μm濾膜過濾，按以下色譜條件測定：色譜柱Phenomenex Luna C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)，流動相二元梯度洗脫：乙腈(A)，含0.1%三乙胺的水溶液(B)，流速：1.0 mL/min，檢測波長：220 nm，柱溫：室溫，進樣量：20 μL，梯度洗脫條件：0～10 min，15%～30%A；10～40 min，30%～50%A。

②TLC分析：取適量天芥菜堿和毛果天芥菜堿，溶于甲醇后，制成天芥菜堿和毛果天芥菜堿的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混標(biāo)液與待測樣品按以下色譜條件分析：固定相：2%NaOH硅膠G薄層板；展開劑：氯仿-甲醇-濃氨水(4.5∶0.6∶0.3)；顯色劑：碘化鉍鉀。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔吸附樹脂純化條件的考察

2.1.1 大孔吸附樹脂的選擇 選擇AB-8，BS-65，BS-30，HPD-400和CAD-40 5種樹脂按照實驗方法進行靜態(tài)吸附和解吸附試驗，考察了不同樹脂對天芥菜堿和毛果天芥菜堿的吸附量、吸附率、解吸率和回收率。

精密稱取上述樹脂各約2.0 g，置于150 mL帶塞錐形瓶中，精密加入濃度分別為1 042.8 μg/mL和1 006.0 μg/mL的天芥菜堿和毛果天芥菜堿原料藥溶液100 mL，置于恒溫振蕩器中，在100 r/min，30 ℃條件下靜態(tài)吸附3 h；過濾樹脂，收集吸附后的溶液待測，然后用水洗吸附后樹脂，濾干后置于150 mL干凈的帶塞錐形瓶中，精密加入100 mL 95%乙醇，置于恒溫振蕩器中，在100 r/min，30 ℃條件下靜態(tài)解吸附3 h，過濾樹脂，收集洗脫液待測。

表1 不同樹脂對天芥菜堿及毛果天芥菜堿的吸附和解吸附情況

采用靜態(tài)吸附實驗，通過表1結(jié)果對比，發(fā)現(xiàn)BS-65大孔吸附樹脂對天芥菜堿和毛果天芥菜堿的吸附量和回收率均明顯優(yōu)于其他型號的樹脂。大孔吸附樹脂可以有效地吸附具有不同化學(xué)性質(zhì)的各種類型化合物，其吸附性能主要取決于吸附劑的表面性質(zhì),即樹脂的極性(功能基)和空間結(jié)構(gòu)(孔徑、比表面積、孔容)，表1中只有AB-8和BS-65是非極性樹脂，其在極性溶劑(加水)中吸附非極性物質(zhì),并且BS-65的比表面積比AB-8大，BS-65適合分離純化生物堿成分，因此選擇BS-65對天芥菜堿和毛果天芥菜堿進行分離。

2.1.2 pH值對樹脂吸附量的影響 稱取BS-65大孔吸附樹脂0.5 g于100 mL帶塞三角燒瓶中，分別加入pH 5.0，7.0，9.0，10.0，11.0的上樣液25 mL，置于搖床中，在30 ℃，100 r/min下振蕩12 h，取上清液，分別測定吸附前后溶液中天芥菜堿和毛果天芥菜堿的濃度，并計算其靜態(tài)飽和吸附量。結(jié)果顯示，兩生物堿的吸附量均隨pH值的升高而逐漸增大，這是因為隨著pH值的增大，天芥菜堿和毛果天芥菜堿主要以分子形式存在于溶液中，增強了其與BS-65大孔吸附樹脂的吸附作用力，有利于兩種生物堿在BS-65樹脂上的吸附。但當(dāng)pH≥10時趨于平衡，吸附量基本不變化。因此，本實驗在利用BS-65樹脂對天芥菜堿和毛果天芥菜堿進行分離時，選擇上樣液的pH值為10.0。

2.1.3 洗脫劑的選擇 考察了石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、無水乙醇、50%乙醇水溶液7種洗脫劑的洗脫效果。結(jié)果顯示，石油醚的洗脫液中無天芥菜堿或毛果天芥菜堿，可能是因為石油醚的極性過低，對天芥菜堿和毛果天芥菜堿的洗脫不利；丙酮、正丁醇和乙酸乙酯洗脫液中雖均含有天芥菜堿和毛果天芥菜堿，但分離效果不理想；在無水乙醇洗脫液和50%乙醇洗脫液中，均含有較高濃度的毛果天芥菜堿，但無水乙醇洗脫液中還含有較多雜質(zhì)。乙醚洗脫液中也含有天芥菜堿和毛果天芥菜堿，但天芥菜堿的含量明顯減少。從結(jié)構(gòu)上看，天芥菜堿和毛果天芥菜堿均屬于吡咯里西啶生物堿。天芥菜堿母核結(jié)構(gòu)上含有兩個羥基，毛果天芥菜堿母核結(jié)構(gòu)上含有的兩個羥基已形成酯基，故天芥菜堿的極性大于毛果天芥菜堿，50%的乙醇水溶液由于極性較大，故主要洗脫天芥菜堿，乙醚極性較小，主要洗脫毛果天芥菜堿。綜合考慮，選擇乙醚和50%乙醇水溶液分別對毛果天芥菜堿和天芥菜堿進行洗脫。

2.1.4 洗脫劑用量的考察 對洗脫劑用量進行TLC跟蹤，用400 mL pH 9.0的堿水洗去雜質(zhì)成分后以乙醚對毛果天芥菜堿進行洗脫，結(jié)合TLC檢測結(jié)果顯示，當(dāng)毛果天芥菜堿洗脫完全后改用50%乙醇水溶液對天芥菜堿進行洗脫，直至TLC顯示天芥菜堿洗脫完全。用HPLC對上述洗脫液進行分析，結(jié)果表明，分別使用100 mL乙醚和200 mL 50%乙醇水溶液進行洗脫可獲得毛果天芥菜堿和天芥菜堿。

2.2 分離純化效果的比較

對上樣液通過以下4種不同的方式進行分離純化：僅用BS-65大孔吸附樹脂，僅用001×732陽離子交換樹脂，001×732陽離子交換樹脂與一次BS-65大孔吸附樹脂聯(lián)用，001×732陽離子交換樹脂與兩次BS-65大孔吸附樹脂聯(lián)用，結(jié)果見表2，洗脫液色譜圖見圖2。

表2 各種分離純化天芥菜堿和毛果天芥菜堿方法的結(jié)果比較

由表2可知，毛果天芥菜堿與天芥菜堿的純度分別由0.73%和2.2%提高至81.6%和79.2%；其純度分別提高了111倍和36倍，提取率分別由4.6 mg/g和 10.7 mg/g提高至50.6 mg/g和92.7 mg/g。

對上樣液(圖2A)、通過陽離子交換樹脂和一次大孔吸附樹脂的乙醚洗脫液(圖2B)、通過陽離子交換樹脂和兩次大孔吸附樹脂的乙醚洗脫液(圖2C)、通過陽離子交換樹脂和一次大孔吸附樹脂的50%乙醇水溶液洗脫液(圖2D)以及通過陽離子交換樹脂和兩次大孔吸附樹脂的50%乙醇水溶液洗脫液(圖2E)進行HPLC色譜分析，結(jié)果見圖2。

根據(jù)圖2B和圖2C可知，經(jīng)過兩次大孔吸附樹脂之后，天芥菜堿基本被洗去，可分離出毛果天芥菜堿，由圖2D和圖2E可知，經(jīng)過兩次大孔吸附樹脂之后，毛果天芥菜堿基本被洗去，可完全分離出天芥菜堿。由此可知，上樣液經(jīng)過001×732陽離子交換樹脂與兩次BS-65大孔吸附樹脂聯(lián)用進行分離純化，使用乙醚和50%乙醇水溶液洗脫可將毛果天芥菜堿和天芥菜堿完全分離，提純效果最佳。

3 結(jié) 論

本文采用陽離子交換樹脂和大孔吸附樹脂聯(lián)用的方法，對倒提壺中的生物堿進行分離純化，可以完全分離出天芥菜堿和毛果天芥菜堿。本方法具有成本低、污染小、周期短、操作簡單、分離純化效率高等特點，適合進行工業(yè)化生產(chǎn)。

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Research on Separation and Purification of Alkaloids inCynoglossum amabile Stapf et Drumm with Resin

FAN Qing-ya1*,ZHANG Hong-hui1，WANG Wan-hao2

(1.College of Pharmacy,Vocational and Technical College School of Xinyang,Xinyang 464000,China；2.Henan Pharmaceutical Tong-yuan Ltd.,Xinyang 464000,China)

A novel method was established to separate and purify alkaloids fromCynoglossumamabileStapfetDrummwith cation exchange resin(CER) coupled with macroporous adsorption resin(MAR) based on dynamic tests.The result indicated that the alkaloids extracted were eluted with water and NaCl through CER and twice with ether and 50%ethanol through MAR,then the purities of heliotrine and lasiocarpine were up to 81.6%and 79.2% from 0.73%and 2.2%,respectively.Extraction yields were up to 50.6 mg/g and 92.7 mg/g from 4.6 mg/g and 10.7 mg/g,respectively.The method has the advantages of low cost,low pollution,short cycle，high efficiency and simple operation,and is suitable for popularization in industry production.

cation exchange resin；macroporous adsorption resin；CynoglossumamabileStapfetDrummalkaloid；heliotrine；lasiocarpine；separation；purification

2016-03-23；

2016-04-13

信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級科研項目(14QN07)

實驗技術(shù)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.021

O657.72；TQ460.72

A

1004-4957(2016)10-1338-05

*通訊作者：樊輕亞，碩士，講師，研究方向：藥物提取分離及分析,Tel：0376-6281969，E-mail：fqy2006hn@163.com