王俊娟，王德龍，陰祖軍，王 帥，樊偉麗，陸許可，穆 敏，郭麗雪，葉武威，喻樹迅

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部棉花遺傳改良重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，河南安陽 455000）

陸地棉萌發(fā)至幼苗期抗冷性的鑒定

王俊娟，王德龍，陰祖軍，王 帥，樊偉麗，陸許可，穆 敏，郭麗雪，葉武威，喻樹迅

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部棉花遺傳改良重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，河南安陽 455000）

【目的】低溫脅迫是影響棉花正常生長的重要因子之一，通過對(duì)棉花種質(zhì)進(jìn)行合理的抗冷性鑒定，可以為棉花的抗冷機(jī)制研究提供重要的先決條件，進(jìn)而為棉花抗冷品種的選育提供一定的理論參考?！痉椒ā坷?個(gè)抗冷性不同的陸地棉品種（系），設(shè)置0、4、10和15℃不同溫度處理7 d，然后在正常條件（28℃，光照/黑暗，14 h/10 h）恢復(fù)生長7 d，篩選適合棉花萌發(fā)期進(jìn)行抗冷性鑒定的低溫條件；然后對(duì)4個(gè)品種（系）進(jìn)行0℃低溫處理1、2、3、4、5、6和7 d，恢復(fù)正常生長7 d，篩選萌發(fā)期抗冷性鑒定0℃低溫處理的天數(shù)。對(duì)于芽期的抗冷性鑒定，選用抗冷性差異顯著的2個(gè)陸地棉材料進(jìn)行4℃低溫處理0、1、2、3、4、5、6和7 d，篩選適用于芽期抗冷鑒定的低溫處理的天數(shù)。將47個(gè)陸地棉材料（子葉期）進(jìn)行4℃處理24 h，恢復(fù)正常生長7 d后調(diào)查冷害指數(shù)，鑒定棉花子葉期的抗冷性。采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒測定芽期和子葉期低溫脅迫后的生化指標(biāo)?！窘Y(jié)果】通過對(duì)棉花不同時(shí)期，包括萌發(fā)期、芽期和子葉期進(jìn)行不同低溫脅迫條件的篩選，最終初步建立了適合棉花不同時(shí)期的抗冷性鑒定標(biāo)準(zhǔn)。0℃處理4 d，恢復(fù)正常生長7 d的相對(duì)子葉平展率可以作為萌發(fā)期的抗冷鑒定指標(biāo)；4℃處理5 d，恢復(fù)正常生長的7 d的子葉平展率可以作為芽期的抗冷鑒定指標(biāo)；4℃處理24 h，恢復(fù)正常生長的7 d的抗冷指數(shù)可以作為子葉期的抗冷鑒定指標(biāo)?？估洳牧显?067芽的SOD酶活和POD酶活均在低溫處理前期呈上調(diào)趨勢，之后下降至趨于平穩(wěn)，而冷敏感材料衡棉3號(hào)芽的兩種酶在低溫處理前期迅速下降，然后上調(diào)后趨于平穩(wěn)；2個(gè)材料芽的CAT酶活性在低溫處理早期均先上升后下降，在冷處理后期抗冷材料豫2067的CAT酶活一直高于冷敏感材料衡棉3號(hào)；2個(gè)材料的可溶性蛋白含量在冷處理早期比較接近，在冷處理后期抗冷材料豫2067的可溶性蛋白含量一直高于冷敏感材料衡棉3號(hào)。4℃低溫處理子葉期棉苗24 h后，抗冷材料豫2067子葉的SOD酶活力、POD酶活力、CAT酶活力均下降，而冷敏感材料衡棉3號(hào)的3種酶活力均上升，抗冷材料子葉中可溶性蛋白上升，冷敏感材料中的可溶性蛋白下降。【結(jié)論】棉花不同的生育時(shí)期應(yīng)有相應(yīng)的抗冷性鑒定標(biāo)準(zhǔn)，不同材料和不同生育時(shí)期的耐冷性鑒定標(biāo)準(zhǔn)具有差異性。推測棉花芽期抗冷性與酶活力有關(guān)。子葉期抗冷性與3種抗氧化酶活性差異不顯著，可能與葉片中可溶性蛋白含量有關(guān)。

棉花；生育時(shí)期；抗冷性；鑒定方法；生化特性

0 引言

【研究意義】低溫冷害是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害之一。低溫冷害可使作物生育延遲，造成產(chǎn)量減少、品質(zhì)降低[1]。重要作物如水稻、玉米、大豆、棉花和番茄等，對(duì)冷脅迫均比較敏感，而且冷適應(yīng)能力差[2]。低溫冷害是威脅棉花的重要災(zāi)害之一，尤其對(duì)在早春季節(jié)播種期和苗期的棉花危害更為嚴(yán)重[3]。棉花是喜溫?zé)嶙魑?，低溫使棉花生育期延遲、落花落蕾，品質(zhì)和產(chǎn)量嚴(yán)重下降。隨著人口的日益增加和氣候條件的不斷惡化，糧棉爭地的矛盾越來越激烈，在保障國家糧食安全的前提下，培育棉花抗冷性品種，將棉花種植向新疆內(nèi)蒙等寒涼地帶轉(zhuǎn)移是緩解糧棉爭地矛盾的有效途徑。對(duì)不同生育時(shí)期的耐低溫能力進(jìn)行鑒定，制定出一套關(guān)于棉花抗冷性的綜合評(píng)價(jià)體系，篩選優(yōu)異的棉花抗冷種質(zhì)資源，有利于推進(jìn)棉花抗冷育種進(jìn)程?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】除了處于休眠期的干種子外，起源于熱帶、亞熱帶的冷敏感植物生長發(fā)育的所有階段均易受到冷脅迫的傷害[4]。目前，在水稻、玉米、大豆以及蔬菜等植物中進(jìn)行了大量的耐低溫研究，并且制定出相應(yīng)的抗冷性鑒定方法。不同作物間、同一作物的不同生育時(shí)期抗冷性評(píng)價(jià)指標(biāo)具有多樣性。BERTIN等[5]利用6個(gè)材料篩選水稻萌發(fā)期和苗期的抗冷鑒定指標(biāo)，指出10℃低溫是最有效的抗冷鑒定溫度。在玉米的耐寒性鑒定中，將低溫與常溫下各性狀測定值的比值作為耐寒性強(qiáng)弱的評(píng)價(jià)指標(biāo)[6]。李育軍等[7]指出，在6℃人工氣候箱內(nèi)，大豆低溫萌發(fā)指數(shù)和田間出苗指數(shù)呈正相關(guān)，室內(nèi)萌發(fā)耐低溫的大豆品種，在田間出苗也表現(xiàn)較強(qiáng)的耐低溫性能。苗永美等[8]研究表明，黃瓜17℃相對(duì)發(fā)芽勢、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)胚根長和相對(duì)活力指數(shù)與萌芽期耐冷性關(guān)系顯著，冷害指數(shù)與恢復(fù)后成活率與苗期抗冷性相關(guān)，并將黃瓜材料耐冷性分為3個(gè)等級(jí)。小豆芽期、苗期耐冷性鑒定方法研究結(jié)果表明，三葉期低溫5—8℃脅迫7 d后能夠生長正常的幼苗所占百分比可以作為小豆苗期耐冷性鑒定指標(biāo)，而且小豆發(fā)芽期與三葉期耐冷性存在差異[9]。辣椒在4℃處理?xiàng)l件下的幼苗（4葉1心期）冷害指數(shù)和15℃條件下的發(fā)芽指數(shù)可以作為評(píng)價(jià)辣椒品種的耐低溫能力[10]。在棉花的耐低溫鑒定中，武輝等[11]通過測定低溫脅迫（5℃、12 h）及恢復(fù)處理（25℃、24 h）下棉花幼苗葉片初始熒光（Fo1）、最大光化學(xué)效率（Fv/Fm1）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、可溶性糖含量（SS）、丙二醛含量（MDA）和相對(duì)電導(dǎo)率（REC）等6個(gè)鑒定指標(biāo)，進(jìn)行棉花品種耐寒性強(qiáng)弱的快速鑒定和預(yù)測。【本研究切入點(diǎn)】陸地棉是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物，起源于適應(yīng)亞熱帶極端溫度變化的野生多年生植物[12]，然而，現(xiàn)代栽培種是在適宜的溫度條件下針對(duì)產(chǎn)量和纖維品質(zhì)目標(biāo)經(jīng)過人工選擇下培育出來的，其抗逆性的遺傳多樣性無意中變得越來越窄[13]，研究表明，最適合棉花生長的溫度是28℃左右[14]，低溫對(duì)棉花生長的影響遠(yuǎn)大于其他作物[15]。因此，篩選出具有抗冷性的棉花種質(zhì)資源材料是目前棉花育種中的主要任務(wù)之一。棉花耐低溫研究起步比較晚，目前仍停留在低溫對(duì)棉花的影響和危害方面[16-18]以及如何進(jìn)行抗寒鍛煉來提高棉花的抗冷性[19-20]；對(duì)棉花抗冷性鑒定的研究主要關(guān)注某一個(gè)時(shí)期的抗冷性[21]，棉花苗期的抗冷性鑒定指標(biāo)主要限制在生理生化、光合特性等方面[11,22]。對(duì)棉花不同生育時(shí)期進(jìn)行抗冷性鑒定缺少系統(tǒng)性、綜合性研究，生產(chǎn)上更是缺少抗冷性的棉花品種?！緮M解決的關(guān)鍵問題】針對(duì)棉花生育期長、抗逆性狀復(fù)雜，以及資源鑒定數(shù)量多和規(guī)模大、且材料來源于不同生態(tài)區(qū)、變異類型豐富的特點(diǎn)，本研究通過對(duì)棉花不同生育時(shí)期進(jìn)行低溫脅迫，尋求適合萌發(fā)期、芽期、子葉期的抗冷鑒定指標(biāo)，建立相應(yīng)的抗冷評(píng)價(jià)體系，目的是篩選優(yōu)良的抗冷種質(zhì)資源，為棉花抗冷育種和抗冷機(jī)制的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

陸地棉萌發(fā)期是指棉籽吸脹后開始萌發(fā)至芽長達(dá)種子長度的1/2處這段時(shí)間。其抗冷鑒定所用材料選取4個(gè)陸地棉花品種：豫2067、sGK958、GK50、衡棉3號(hào)，驗(yàn)證萌發(fā)期抗冷鑒定方法選用13份陸地棉材料：豫2067、GZ1、中棉所44、冀616、冀228、sGK958、GK50、邯242、衡棉3號(hào)、中棉所50、新研96-48、魯棉研16和中404A。

陸地棉芽期是指棉花種子萌發(fā)后至出苗這段時(shí)間，其抗冷性鑒定指標(biāo)篩選所用材料：抗冷性較強(qiáng)的魯棉研16和冷敏感材料中404A抗。驗(yàn)證芽期抗冷鑒定方法選用11份陸地棉材料：冀616、魯棉研16、中404A、中棉所44、衡棉3號(hào)、sGK958、豫2067、邯242、GZ1、冀228和GK50。

陸地棉子葉期是指種子萌發(fā)出土后從子葉平展到第一片真葉長出這段時(shí)間，其抗冷性鑒定指標(biāo)的篩選所用材料為47份陸地棉花品種（系）（表1），分別來源于美國和中國的華北、華中、山東等地，來源廣泛，遺傳變異豐富。

試驗(yàn)所用材料種子均來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，所選材料的田間農(nóng)藝性狀等綜合性狀優(yōu)異，抗病、抗蟲，產(chǎn)量能保證后續(xù)室內(nèi)試驗(yàn)的順利進(jìn)行。試驗(yàn)于2015年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)棉花研究所完成。

1.2 陸地棉萌發(fā)期的抗冷鑒定

1.2.1 不同處理溫度的設(shè)置 棉花種子于28℃吸脹12 h后在0℃、4℃、10℃和15℃不同溫度條件下處理7 d，0℃和4℃低溫條件的獲得是冰箱處理，10℃和15℃的溫度條件由培養(yǎng)箱獲得，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100粒種子，對(duì)照（CK）處理為種子吸脹12 h后直接種于恒溫滅菌沙土中（28℃、光照14 h/黑暗10 h），每個(gè)重復(fù)100粒種子。低溫脅迫的種子在28℃、光照14 h/黑暗10 h恒溫恢復(fù)生長7 d后調(diào)查其出苗情況，并直接調(diào)查對(duì)照生長7 d的出苗情況，計(jì)算子葉平展率（%）=子葉平展數(shù)/總種子數(shù)×100。

1.2.2 0℃低溫處理天數(shù)的確定 將棉花種子置于含雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，28℃吸脹12 h后，將種子直接放入冰箱中分別進(jìn)行0℃處理0、1、2、3、4、5、6和7 d，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100粒種子，然后種植在恒溫滅菌沙土（28℃、光照14 h/黑暗10 h）恢復(fù)發(fā)芽7 d，調(diào)查其出苗情況，計(jì)算其子葉平展率（%）。

1.2.3 棉花種質(zhì)資源萌發(fā)期抗冷性評(píng)價(jià) 將13份陸地棉材料種子于28℃吸脹12 h后直接放入冰箱進(jìn)行低溫處理（0℃）4 d，未經(jīng)低溫處理的設(shè)為對(duì)照（CK），每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100粒種子，然后種植在恒溫滅菌沙土（28℃、光照14 h/黑暗10 h）恢復(fù)培養(yǎng)發(fā)芽7 d，調(diào)查其出苗情況，計(jì)算其相對(duì)子葉平展率（%）=低溫處理后子葉平展率/CK的子葉平展率×100。

1.3 陸地棉芽期的抗冷性鑒定

1.3.1 棉花芽期抗冷性鑒定方法的確定 挑選魯棉研16和中404A飽滿一致的種子，用雙層濕濾紙于28℃左右恒溫保濕催芽，待芽長到1 cm左右時(shí)，挑選一致、發(fā)育良好的芽置入雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，保濕進(jìn)行4℃低溫處理，處理時(shí)間分別為0（CK）、1、2、3、4、5、6和7 d。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒。將低溫處理過的芽分別種植在高溫滅菌含水量為23%的沙子里，并置于培養(yǎng)箱（28℃、光照14 h/黑暗10 h）中恢復(fù)生長，7 d后計(jì)算其子葉平展率（%）=子葉平展數(shù)/總芽數(shù)×100。

1.3.2 棉花種質(zhì)資源芽期抗冷性評(píng)價(jià) 選用11份棉花材料在28℃恒溫下進(jìn)行催芽，待芽長到1 cm左右時(shí)每個(gè)材料選取生長一致的種子150粒，分3個(gè)重復(fù)置入雙層濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行4℃低溫處理，低溫處理0 d（CK）和5 d后，將對(duì)照和低溫處理過的種子種植在沙土中（高溫滅菌且含水量為23%左右）進(jìn)行恢復(fù)生長（28℃、光照14 h/黑暗10 h），7 d后調(diào)查其子葉平展率，并計(jì)算相對(duì)子葉平展率。

1.4 陸地棉子葉期的抗冷性鑒定

1.4.1 子葉期棉花苗的培育 將高溫滅菌的沙子（含水量為23%）均勻平鋪于長19.5 cm×寬14 cm ×深5 cm的有機(jī)發(fā)芽盒中，沙子的厚度約為2 cm，將50粒棉花種子均勻平鋪于上面，并加蓋同樣濕度和厚度的沙子，加蓋保濕，置于28℃、光照14 h /黑暗10 h培養(yǎng)箱中進(jìn)行萌發(fā)。7 d后將子葉未平展、弱苗及畸形苗拔除，留下均勻的、健壯的苗25—30棵繼續(xù)生長2 d后用于后續(xù)試驗(yàn)研究。每個(gè)品種設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4.2 子葉期低溫處理方法及調(diào)查方法 將1.4.1中的苗澆水后加蓋保濕。置于4℃、光照14 h/黑暗10 h培養(yǎng)箱中處理24 h，然后轉(zhuǎn)入28℃、光照14 h/黑暗10 h的培養(yǎng)箱中恢復(fù)生長7 d，并調(diào)查子葉受傷害面積，根據(jù)莖的受傷害程度，分為爛莖、斷莖和莖完好，再針對(duì)莖完好的單株調(diào)查子葉脫落情況，調(diào)查未脫落子葉的受傷害面積，記錄爛斑面積占該片葉面積比例為X，記錄總爛斑面積占總?cè)~面積比例為Y（當(dāng)只有一片子葉未脫落時(shí)，Y= X；當(dāng)子葉完好時(shí)視為X=0），劃分直觀、詳細(xì)、可操作性強(qiáng)。根據(jù)冷害級(jí)別調(diào)查出每一個(gè)品種（系）的冷害指數(shù)，冷害指數(shù)和抗冷指數(shù)計(jì)算方法如下：

冷害指數(shù)/%=∑（級(jí)別×該級(jí)個(gè)數(shù)）/（8×總個(gè)數(shù)）×100；

抗冷指數(shù)/%=100-冷害指數(shù)。

1.4.3 陸地棉芽期和子葉期的生化指標(biāo)測定方法

選取抗冷性差異顯著的2個(gè)陸地棉材料，按1.3.1的方法進(jìn)行催芽和4℃低溫處理，分別選取處理不同時(shí)間的芽全長，取鮮重0.1 g左右，液氮速凍后-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫?個(gè)重復(fù)。按1.4.1和1.4.2的方法進(jìn)行子葉期棉苗的培育及低溫處理，分別對(duì)低溫處理前（CK）和4℃低溫處理24 h后的子葉進(jìn)行取樣，取鮮重0.10 g左右，液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆茫?個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[23]測定可溶性蛋白。采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、過氧化物酶（peroxidase，POD）活性、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性，具體操作步驟按使用說明書進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Stata 11.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 陸地棉萌發(fā)期抗冷性鑒定

2.1.1 萌發(fā)期抗冷性鑒定溫度的確定 由圖1可知，15℃及以下低溫處理7 d， 28℃恢復(fù)生長7 d后的子葉平展率平均值均低于對(duì)照（28℃）處理，且隨著溫度的降低子葉平展率呈下降趨勢，表明15℃及以下低溫處理對(duì)棉花種子萌發(fā)出苗均造成傷害，溫度越低，傷害越嚴(yán)重。0℃低溫處理7 d后，4個(gè)材料間的子葉平展率差異達(dá)到極顯著，且0℃條件容易獲得，所以0℃低溫處理可以作為棉花萌發(fā)期抗冷性鑒定的合理溫度條件。

2.1.2 0℃低溫處理天數(shù)的確定 由圖1可以看出，0℃低溫處理7 d后，4個(gè)棉花品種雖然差異極顯著，但最高的出苗率也只有約28.00%，最低的還不到10.00%，平均子葉平展率為15.62%，說明0℃低溫處理7 d的時(shí)間太長，在該處理?xiàng)l件下，一些耐低溫能力中等的材料不容易被鑒定出來，所以應(yīng)找到0℃低溫處理合適的天數(shù)。

圖1 萌發(fā)期不同溫度處理后子葉平展率Fig. 1 The percentage of cotyledon unfolding after different temperature treatments at germination stage

由圖2可以看出，隨著0℃低溫處理天數(shù)的增加，4個(gè)棉花品種在恢復(fù)正常生長7 d后的子葉平展率呈下降趨勢，說明低溫處理的時(shí)間越長，對(duì)棉花萌發(fā)的影響越大。處理4 d時(shí)，4個(gè)材料的子葉平展率差異達(dá)到極顯著，所以0℃處理4 d可以作為陸地棉萌發(fā)期抗冷性鑒定的指標(biāo)。

2.1.3 棉花種質(zhì)資源萌發(fā)期抗冷性評(píng)價(jià) 為進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的適合萌發(fā)期抗冷性鑒定的溫度條件，同時(shí)也為了篩選萌發(fā)期抗冷性強(qiáng)的種質(zhì)資源，挑選綜合性狀良好的13個(gè)陸地棉品種進(jìn)行萌發(fā)期抗冷性鑒定（圖3）。

13個(gè)棉花新材料在萌發(fā)期抗冷性差異達(dá)到極顯著。說明棉花萌發(fā)期經(jīng)0℃低溫處理4 d后恢復(fù)生長7 d后的子葉平展率作為棉花萌發(fā)期抗冷性鑒定指標(biāo)是可行的。根據(jù)研究結(jié)果可以把萌發(fā)期期抗冷性標(biāo)準(zhǔn)定為：子葉相對(duì)平展率為0—29.90%為冷敏感；30.00%—49.90%時(shí)為不抗冷；50.00%—74.90%為耐冷；75.00%—89.90%為抗冷；90.00%—100.00%為高抗冷。由圖3可以看出，13個(gè)陸地棉材中，萌發(fā)期期達(dá)到抗冷水平的棉花品種（系）有1個(gè)（冀616），占7.69%；萌發(fā)期耐冷的棉花品種（系）有7個(gè)，分別為魯棉研16、中404A、中棉所44、中棉所50、衡棉3號(hào)、sGK958、新研96-48，占53.85%，說明超過50%的棉花材料在萌發(fā)期的抗冷水平均達(dá)到中等水平。

圖2 萌發(fā)期0℃溫度處理不同天數(shù)后子葉平展率Fig. 2 The percentage of cotyledon unfolding after 0℃temperature treatment at germination period

圖3 棉花種質(zhì)資源萌發(fā)期抗冷性評(píng)價(jià)Fig. 3 The evaluation of chilling resistance on cotton germplasm resources at germination stage

2.2 陸地棉芽期抗冷性鑒定

2.2.1 陸地棉芽期抗冷性鑒定方法的確定 人工模擬早春低溫天氣對(duì)陸地棉芽期進(jìn)行4℃低溫冷處理，低溫脅迫1—4 d時(shí)，抗冷品種魯棉研16和冷敏感品種中404A的子葉平展率與對(duì)照相比沒有明顯變化，2個(gè)材料間差異不顯著。低溫處理5 d后，子葉平展率開始下降，隨著處理時(shí)間的延長，下降幅度變大，但抗冷品種下降速率比冷敏感品種下降慢。低溫處理5 d時(shí)，2個(gè)品種子葉平展率差別最大，達(dá)到差異極顯著水平；冷處理7 d時(shí)，抗冷品種魯棉研16的子葉平展率比對(duì)照下降了90.60%，而冷敏感品種中404A則下降了98.70%，2個(gè)品種（系）受到的傷害程度相近，均已經(jīng)遭到嚴(yán)重傷害。因此，棉花芽期4℃低溫冷處理5 d后恢復(fù)正常生長7 d的子葉平展率可以作為鑒定條件來鑒定抗冷品種和冷敏感品種。

棉花芽期經(jīng)過4℃低溫處理5 d后，對(duì)棉花的生長發(fā)育具有明顯的影響。與對(duì)照相比，棉芽在低溫處理以后恢復(fù)7 d正常生長后葉色變淺，失綠，有些子葉出現(xiàn)有黃斑，且子葉平展緩慢或不平展，也有子葉出苗即腐爛現(xiàn)象；莖變粗，變脆，易斷，芽尖即胚根部分受傷，重新生出側(cè)根，所以根系發(fā)育緩慢，容易產(chǎn)生倒根，不能成苗，側(cè)根發(fā)生能力強(qiáng)的材料，相對(duì)應(yīng)的子葉平展比較高，所以耐低溫能力比較強(qiáng)。

2.2.2 陸地棉種質(zhì)資源芽期抗冷性評(píng)價(jià) 利用Stata11.0對(duì)11個(gè)棉花材料（4℃冷處理5 d后恢復(fù)7 d正常生長）的相對(duì)子葉平展率進(jìn)行分析和觀察（圖4），結(jié)果表明，11個(gè)棉花材料芽期的抗冷性差異達(dá)到了顯著。因此，棉花芽經(jīng)4℃低溫處理5 d后恢復(fù)生長7 d的子葉平展率作為棉花芽期抗冷性的鑒定指標(biāo)是可行的。將棉花芽期抗冷性的鑒定標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為：相對(duì)子葉平展率0—29.90%為冷敏感；30.00%—49.90%為不抗冷；50.00%—74.90%為耐冷；75.00%—89.90%為抗冷；90.00%—100.00%為高抗冷。11份陸地棉材中，芽期耐冷的棉花材料有4份，分別為豫2067、GK50、魯棉研16和中棉所44，占總材料的36.36%；不抗冷的材料有5份，占45.45%；冷敏感材料有2份，占18.18%。芽期沒有篩選到高抗冷和抗冷的材料。

2.3 陸地棉子葉期抗冷性鑒定

2.3.1 陸地棉子葉期低溫處理后葉片冷害級(jí)別劃分由圖5可以看出，4℃低溫處理24 h后，不同材料間的冷害差異顯著。由子葉受傷害的面積可將子葉期冷害劃分為8個(gè)級(jí)別（表2）。根據(jù)抗冷指數(shù)，將陸地棉子葉期的抗冷性劃分為5個(gè)等級(jí)：抗冷指數(shù)為0—29.90%時(shí)為冷敏感；30.00%—49.90%為不抗冷；50.00%—74.90%為耐冷；75.00%—89.90%為抗冷；90.00%—100.00%為高抗冷。

圖4 棉花種質(zhì)資源芽期抗冷性評(píng)價(jià)Fig. 4 The evaluation of chilling resistance on cotton germplasm resources at budding stage

圖5 陸地棉子葉期低溫處理后葉片冷害級(jí)別圖示Fig. 5 The diagram of chilling injury level after low temperature treatment at cotyledon stage

表1 棉花種質(zhì)資源子葉期抗冷性評(píng)價(jià)Table 1 The evaluation of chilling resistance on cotton germplasm resources at cotyledon stage

表2 陸地棉子葉期葉片冷害級(jí)別Table 2 The level of chilling injury at cotyledon stage

2.3.2 棉花種質(zhì)資源子葉期抗冷性評(píng)價(jià) 由表1可以看出，47份陸地棉材料的子葉期抗冷性差異顯著，抗冷指數(shù)由14.29%—86.35%不等，平均抗冷指數(shù)為51.60%。47份陸地棉種質(zhì)資源材料中，子葉期抗冷的材料有7份，分別為邯鄲109、豫2067、創(chuàng)棉22、冀雜3268F6、中棉所44、中404A抗-13和光籽2，占總鑒定材料的12.77%；耐冷的有15份，占31.91%，不抗冷或冷敏感的有25份，占53.19%，沒有高抗冷的材料。因此，用4℃低溫處理24 h鑒定陸地棉子葉期抗冷性是可行的。在北方高緯度長期種植篩選馴化過程中，陸地棉中有部分材料已經(jīng)擁有了一定的抗冷性（12.77%），但是對(duì)于子葉期的棉花來說，有高于50%的材料還是不抗冷或冷敏感（53.19%），培育出高抗冷材料還需要長期的努力。

2.4 不同生育時(shí)期陸地棉抗冷差異

不同棉花材料在不同生育時(shí)期的抗冷性表現(xiàn)存在差異性（表3）。魯棉研16、中棉所44在3個(gè)時(shí)期抗冷相對(duì)一致，均表現(xiàn)出耐冷或抗冷，其萌發(fā)期相對(duì)子葉平展率74.81%和64.22%，芽期子葉平展率60.24%和51.52%，而子葉期的抗冷指數(shù)為67.86%和85.27%；邯242、GZ1、冀228在萌發(fā)期、芽期和子葉期均表現(xiàn)出不抗冷，說明魯棉研16、中棉所44、邯242、GZ1、冀228在不同生育時(shí)期的抗冷性是一致的；中404A和衡棉3號(hào)在萌發(fā)期均表現(xiàn)耐冷，在芽期和子葉期卻不抗冷或冷敏感；豫2067在萌發(fā)期不抗冷，而在芽期和子葉期分別為耐冷和抗冷。sGK958是在萌發(fā)期和子葉期均耐冷，芽期不抗冷；GK50則相反，在萌發(fā)期和子葉期分別表現(xiàn)為冷敏感和不抗冷，在芽期卻表現(xiàn)為耐冷，說明同一材料在不同時(shí)期的抗冷性存在差異。

2.5 低溫脅迫對(duì)陸地棉芽期抗氧化酶活性的影響

由圖6-A可知，隨著4℃低溫處理時(shí)間的延長，與對(duì)照相比，抗冷材料豫2067芽的SOD酶活性呈略微上升趨勢，至4 d時(shí)達(dá)到最高，然后下降，至處理5 d時(shí)下降到最低后趨于平穩(wěn)狀態(tài)；而冷敏感材料衡棉3號(hào)的芽在低溫處理1 d時(shí)開始下降，2 d時(shí)下降到最低，隨后3 d時(shí)又迅速上升后趨于平穩(wěn)。

隨著4℃低溫處理時(shí)間的延長，與對(duì)照相比，抗冷材料豫2067芽的POD酶活性迅速上升，在冷處理1和3 d時(shí)達(dá)到最大值，在冷處理4 d時(shí)又迅速下降到最低，然后平穩(wěn)緩慢上升；而冷敏感材料衡棉3號(hào)的芽在低溫處理1 d時(shí)開始下降，3 d時(shí)下降到最低，隨后4 d時(shí)上升，6 d時(shí)達(dá)到最高值，低溫冷處理7 d時(shí)又開始下降?？傊?，抗冷材料先于冷敏感材料達(dá)到最高值，后于冷敏感材料達(dá)到最低值（圖6-B）。

隨著4℃低溫處理時(shí)間的延長，與對(duì)照相比，抗冷材料豫2067和冷敏感材料芽的CAT酶活性均先上升后下降，其中，豫2067在冷處理2 d時(shí)上升到最大，3 d時(shí)又迅速下降到最低，衡棉3號(hào)在冷處理1 d時(shí)上升到最大，然后迅速下降，冷處理4 d時(shí)下降到最小，然后2個(gè)材料的CAT酶活又開始上升，抗冷材料豫2067在冷處理后期芽的CAT酶活一直高于冷敏感材料衡棉3號(hào)，至7 d時(shí)兩者酶活又趨于接近狀態(tài)（圖6-C）。

圖6 低溫脅迫對(duì)陸地棉芽期抗氧化酶活性的影響Fig. 6 Effects of low temperature stress on the activity of antioxidant enzymes at the budding stage of upland cotton

2.6 低溫脅迫對(duì)陸地棉芽可溶性蛋白含量的影響

在低溫處理的早期，陸地棉芽的可溶性蛋白比對(duì)照略微下降（圖7），冷處理3 d時(shí)下降到最小，其中，冷敏感材料衡棉3號(hào)比抗冷材料豫2067下降速度快，2個(gè)材料芽的可溶性蛋白在冷處理后期又呈上升趨勢，其中，抗冷材料豫2067比冷敏感材料衡棉3號(hào)上升速度快，且于冷處理5 d時(shí)達(dá)到最大，而衡棉3號(hào)在冷處理4 d時(shí)可溶性蛋白達(dá)到最大，冷處理7 d時(shí)2個(gè)材料又趨于一致。在冷處理后期，抗冷材料的可溶性蛋白含量均高于冷敏感材料。

首先要合理配置審計(jì)模擬實(shí)訓(xùn)課程的課時(shí)，要對(duì)現(xiàn)有開設(shè)的幾門審計(jì)理論課程重復(fù)的內(nèi)容進(jìn)行歸并和調(diào)整，從而相應(yīng)的增加審計(jì)模擬實(shí)訓(xùn)的課時(shí)，理想的審計(jì)實(shí)訓(xùn)課時(shí)應(yīng)該占據(jù)審計(jì)總教學(xué)課時(shí)的半壁江山，這是因?yàn)閷徲?jì)是一門理論性和實(shí)踐性都很強(qiáng)的學(xué)科，重視理論聯(lián)系實(shí)踐，實(shí)行理實(shí)一體化的教學(xué)模式，不但能激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)熱情，并且能夠使學(xué)生在實(shí)踐中加深對(duì)理論的理解，同時(shí)有利于培養(yǎng)學(xué)生的職業(yè)能力和職業(yè)素養(yǎng)；另一方面審計(jì)模擬實(shí)訓(xùn)教學(xué)面廣量大，系統(tǒng)性和綜合性強(qiáng)，只有充足的課時(shí)才能保質(zhì)保量地完成審計(jì)實(shí)訓(xùn)的任務(wù)，實(shí)現(xiàn)審計(jì)模擬實(shí)訓(xùn)目標(biāo)。

表3 棉花萌發(fā)期與子葉期抗冷性比較Table 3 The comparison of cotton chilling resistance among germination stage, budding stage and cotyledon stage

圖7 低溫脅迫對(duì)陸地棉芽可溶性蛋白含量的影響Fig. 7 Effects of low temperature stress on the soluble protein content at the budding stage of upland cotton

2.7 低溫脅迫對(duì)陸地棉子葉抗氧化酶活性和可溶性蛋白的影響

由表4可以看出，陸地棉子葉期的子葉經(jīng)過4℃低溫處理24 h后，與對(duì)照相比，抗冷材料豫2067的 SOD酶活、POD酶活、CAT酶活均下降，而冷敏感材料衡棉3號(hào)的3種酶活均上升；而抗冷材料豫2067子葉的可溶性蛋白含量升高，冷敏感材料衡棉3號(hào)子葉的可溶性蛋白含量下降11.56%。

表4 低溫脅迫對(duì)陸地棉子葉抗氧化酶活性和可溶性蛋白的影響Table 4 Effects of low temperature stress on the activity of antioxidant enzymes and the soluble protein content of the cotyledon of upland cotton

3 討論

低溫冷害是棉花不同生育時(shí)期經(jīng)常發(fā)生的自然災(zāi)害，每一次低溫冷害都會(huì)造成不同程度的棉花減產(chǎn)及品質(zhì)降低。選用抗冷品種是減輕低溫冷害最經(jīng)濟(jì)有效的措施。對(duì)棉花種質(zhì)資源進(jìn)行有效的抗冷鑒定、篩選與利用是抗冷育種的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)針對(duì)棉花不同生育時(shí)期對(duì)低溫反應(yīng)的差異，提出了不同的抗冷鑒定方法和評(píng)價(jià)指標(biāo)，有利于對(duì)棉花進(jìn)行系統(tǒng)的抗冷鑒定。

3.1 棉花不同生育時(shí)期抗冷性鑒定和抗冷指標(biāo)的篩選

植物的抗冷性是植物對(duì)低溫環(huán)境的適應(yīng)能力，包括植物對(duì)低溫逆境的耐受能力，和逆境解除后恢復(fù)生長的能力。本研究表明，棉花種子的萌發(fā)能力隨著溫度的降低而下降，0℃處理4 d，28℃條件下恢復(fù)正常生長7 d的相對(duì)子葉平展率可以作為萌發(fā)期的抗冷鑒定指標(biāo)。與菠菜[24]、辣椒[10]、玉米[25]萌發(fā)期抗冷鑒定采用發(fā)芽指數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)不同，在棉花的萌發(fā)期和芽期的抗冷鑒定中，不采用萌發(fā)指數(shù)或出苗率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，是因?yàn)樵谠囼?yàn)的過程中發(fā)現(xiàn)，有的棉苗雖然萌發(fā)出土，卻遲遲不能子葉平展，剝開種皮后看到，其子葉大多已枯爛，不能成苗，可能是由于子葉在低溫處理過程中受到了嚴(yán)重傷害，雖能出苗，但子葉不能平展，不能繼續(xù)進(jìn)行光合作用，不能長大成苗，所以本研究以恢復(fù)正常溫度后的子葉平展率作為萌發(fā)期和芽期抗冷性評(píng)價(jià)指標(biāo)。

前人在農(nóng)作物的苗期抗冷鑒定研究中，大多將低溫處理后的死苗率作為作物耐冷性鑒定指標(biāo)，如水稻[26]。而在棉花苗期抗冷鑒定中發(fā)現(xiàn)，棉花在子葉期受到4℃低溫處理24 h后，雖然有的棉花材料能看到明顯的傷害，但是很多材料看不到明顯傷害，且材料間差異不明顯，只有等到恢復(fù)生長后才能看到材料間受傷害的差異，所以用低溫處理后恢復(fù)正常生長7 d后的抗冷指數(shù)作為鑒定指標(biāo)來區(qū)分抗冷性有差異的材料是可行的。不同材料間棉苗受到低溫傷害程度不同，極少一部分會(huì)出現(xiàn)死苗會(huì)現(xiàn)象，其他大部分只是受傷害程度不同，所以用死苗率來評(píng)價(jià)棉花苗期的抗冷性不容易區(qū)分不同材料的抗冷性。本試驗(yàn)采用苗期子葉受低溫傷害面積計(jì)算出冷害指數(shù)，再換算成抗冷指數(shù)，分級(jí)詳細(xì)，直觀明白，容易判斷，易于操作，容易區(qū)分不同抗冷級(jí)別的材料。

3.2 棉花不同生育期抗冷性存在差異性

不同棉花材料在不同的生育時(shí)期抗冷性有的一致，有的不一致，說明棉花種質(zhì)材料抗冷性具有多樣性，具有豐富的遺傳基礎(chǔ)。

3.3 低溫脅迫后棉花不同生育時(shí)期的生化反應(yīng)

低溫脅迫對(duì)植物的傷害與細(xì)胞內(nèi)氧化系統(tǒng)的傷害有關(guān)[29-31]，另一方面，高等植物通過形成包括SOD、POD、CAT等抗氧化酶等清除活性氧系統(tǒng)來抵抗低溫的脅迫[32]。在受低溫脅迫的前期，陸地棉芽期抗冷材料的SOD酶活和POD酶活高于冷敏感材料的酶活；在低溫脅迫的后期，陸地棉芽期抗冷材料的CAT酶活和可溶性蛋白含量高于冷敏感材料。說明抗冷性強(qiáng)的棉花芽期在受低溫持續(xù)脅迫的過程中，不同的抗氧化酶在清除棉花體內(nèi)活性氧的過程中相互協(xié)調(diào)、交替起作用；在受低溫脅迫的后期，抗冷性強(qiáng)的棉花材料通過積累比較多的可溶性蛋白來抵御低溫脅迫。

4℃低溫處理24 h后的抗冷材料豫2067子葉中SOD酶活力、POD酶活力、CAT酶活力低于對(duì)照，可溶性蛋白含量卻高于對(duì)照，冷敏感材料的3種抗氧化酶活和可溶性蛋白含量卻相反，因此，推測棉花子葉期抗冷能力與葉片的抗氧化酶活性關(guān)系不大，可能與葉片的可溶性蛋白含量有關(guān)系。這與GUO等[33]在水稻品種的抗冷能力與抗氧化酶活性的研究結(jié)果不同，據(jù)GUO等報(bào)道，水稻的抗冷性與水稻面對(duì)低溫脅迫抗氧化能力密切相關(guān)。本研究結(jié)果與在黃瓜中的研究結(jié)果相似，據(jù)苗永美等[8]報(bào)道，黃瓜耐冷性與超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）過氧化氫酶（CAT）等沒有相關(guān)性。據(jù)報(bào)道，可溶性蛋白含量的高低可用來評(píng)價(jià)植物的抗冷能力[34]，與本研究中抗冷性棉花材料苗期受低溫脅迫后可溶性蛋白的含量升高且高于冷敏感材料的結(jié)果相一致。說明棉花的抗冷性是一個(gè)復(fù)雜的性狀，將從分子水平進(jìn)一步探討棉花的抗冷機(jī)制。

4 結(jié)論

棉花不同的生育時(shí)期應(yīng)有相應(yīng)的抗冷性鑒定標(biāo)準(zhǔn)。0℃處理4 d，28℃條件下恢復(fù)正常生長7 d的相對(duì)子葉平展率可以作為萌發(fā)期的抗冷鑒定指標(biāo)；4℃處理5 d，28℃條件下恢復(fù)正常生長7 d的相對(duì)子葉平展率可以作為芽期的抗冷鑒定指標(biāo)；4℃處理24 h，28℃條件下恢復(fù)正常生長7 d的抗冷指數(shù)可以作為子葉期的抗冷鑒定指標(biāo)?？估湫詮?qiáng)的棉花芽期在受低溫持續(xù)脅迫的過程中，不同的抗氧化酶在清除棉花體內(nèi)活性氧的過程中相互協(xié)調(diào)、交替起作用，可溶性蛋白含量的高低與棉花苗期抗冷能力有一定相關(guān)性。

[1] 潘鐵夫, 方展森, 趙洪凱, 盧慶善. 農(nóng)作物低溫冷害及其防御. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1983. PAN T F, FANG Z S, ZHAO H K, LU Q S. Crop Chilling Damage and Its Defense. Beijing: China Agriculture Press, 1983. (in Chinese)

[2] CHINNUSAMY V, ZHU J H, ZHU J K. Cold stress regulation of gene expression in plants. Trends in Plant Science, 2007, 12(10): 444-451.

[3] 孫忠富. 霜凍災(zāi)害與發(fā)育技術(shù). 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2001. SUN Z F. Frost Disaster and Its Development and Technologies. Beijing: China Agriculture Press, 2001. (in Chinese)

[4] SALTVEIT M E, MORRIS L L. Overview on chilling injury of horticultural crops// Wang C Y. Chilling Injury of Horticultural Crops. Florida: CRC Press, 1990: 3-15.

[5] BERTIN P, KINET J M , BOUHARMONT J. Evaluation of chilling sensitivity in different rice varieties. Relationship between screening procedures applied during germination and vegetative growth. Euphytica, 1996, 89: 201-210.

[6] HODGES D M, HAMILTON R L, CHAREST C A. Chilling resistant test for inbred maize lines. Canadian Journal of Plant Seience, 1994, 74: 687-691.

[7] 李育軍, 常汝鎮(zhèn), 趙玉田, 孫劍英. 大豆室內(nèi)耐冷篩選及其在田間的應(yīng)用研究. 大豆科學(xué), 1992, 11(l): 49-57. LI Y J, CHANG R Z, ZHAO Y T, SUN J Y. The screening of cold tolerance of soybean in ndoor and its application in the field. Soybean Science, 1992, 11(l): 49-57. (in Chinese)

[8] 苗永美, 寧宇, 曹玉杰, 沈佳, 龐欣, 崔利, 程春燕, 陳勁楓. 黃瓜萌芽期和苗期耐冷性評(píng)價(jià). 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2013, 24(7): 1914-1922. MIAO Y M, NING Y, CAO Y J, SHEN J, PANG X, CUI L, CHENG C Y, CHEN J F. Evaluation of cucumber s chilling tolerance at germination and seedling stages. Chinese Journal of Applied Ecology, 2013, 24(7): 1914-1922. (in Chinese)

[9] 濮紹京, 金文林, 史亞俊, 趙波, 萬平. 人工環(huán)境鑒定小豆芽苗期耐冷性研究. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2008, 9(1): 41-45. PU S J, JIN W L, SHI Y J, ZHAO B, WAN P. Identification for cold tolerance of adzuki bean at germination and seedling stage in artificial environment. Journal of Plant Genetic Resources, 2008, 9(1): 41-45. (in Chinese)

[10] 任旭琴, 曹碚生, 繆旻珉, 楊曉蘭. 辣椒不同生育期耐低溫性鑒定及相關(guān)分析. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 37(1): 141-144. REN X Q, CAO P S, MIAO M M, YANG X L. Identification and analysis on chilling tolerance of pepper (Capsicum annuum L.) varieties at different development stages. Journal of Anhui AgriculturalUniversity, 2010, 37(1): 141-144. (in Chinese)

[11] 武輝, 侯麗麗, 周艷飛, 范志超, 石俊毅, 阿麗艷·肉孜, 張巨松.不同棉花基因型幼苗耐寒性分析及其鑒定指標(biāo)篩選. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(9): 1703-1713. WU H, HOU L L, ZHOU Y F, FAN Z C, SHI J Y, A L Y ·ROUZI, ZHANG J S. Analysis of chilling-tolerance and determination of chilling-tolerance evaluation indicators in cotton of different genotypes. Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(9): 1703-1713. (in Chinese)

[12] KOHEL R J. Influence of certain morphological characters on yield. Cotton Growth Review, 1974, 51: 281-292.

[13] ROSENOW D T, QUISENBERRY J E, WENDT C W, CLARK L E. Drought tolerant sorghum and cotton germplasm. Agricultural Water Management, 1983, 7(1/3): 207-222.

[14] LAUTERBACH B, KRIEG D R, JIVIDEN G. Fatty acid composition of lipid fractions in germinating cotton as affected by temperature. Proceedings Beltwide Cotton Conference, 1999, 1: 564-565.

[15] SAWAN Z M, HANNA L I, GAD EL KARIM G A, MCCUISTION W L. Relationships between climatic factors and flower and boll production in Egyptian cotton (Gossypium barbadense). Journal of Arid Environments, 2002, 52(4): 499-516.

[16] ANJUM Z I, KHATOON A. Chilling effect on germination and seedling vigour of some cultivated species of Gossypium. Asian Journal of Plant Sciences, 2003, 2(3): 297-299.

[17] ZHAO J Q, LI S, JIANG T F, LIU Z, ZHANG W W, JIAN G L, QI F G. Chilling stress-the key predisposing factor for causing alternaria alternata infection and leading to cotton (Gossypium hirsutum L.) leaf senescence. PLoS ONE, 2012, 7(4): e36126.

[18] 鄒陳, 陳冬花, 吉春容, 楊舉芳, 尹育紅, 李新建. 障礙型冷害對(duì)石河子棉區(qū)花鈴期棉花生長的影響研究. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2012, 28(12): 54-59. ZOU C, CHEN D H, JI C R, YANG J F, YIN Y H, LI X J. Experiments and studies about effect of obstacle cold disaster on cotton during the flowering and boll stages in the cotton region of Shihezi. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2012, 28(12): 54-59. (in Chinese)

[19] 范月仙, 王鵬, 李生泉. 臨界生長溫度鍛煉對(duì)棉苗抗冷性的影響.棉花學(xué)報(bào), 2011, 23(1): 90-93. FAN Y X, WANG P, LI S Q. The effect of critical growth temperature exercise on cotton seedling cold resistance. Cotton Science, 2011, 23(1): 90-93. (in Chinese)

[20] 楊美森, 王雅芳, 干秀霞, 羅宏海, 張亞黎, 張旺鋒. 外源一氧化氮對(duì)冷害脅迫下棉花幼苗生長、抗氧化系統(tǒng)和光合特性的影響. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(15): 3058-3067. YANG M S, WANG Y F, GAN X X, LUO H H, ZHANG Y L, ZHANG W F. Effects of exogenous nitric oxide on growth, antioxidant system and photosynthetic characteristics in seedling of cotton cultivar under chilling injury stress. Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(15): 3058-3067. (in Chinese)

[21] 王俊娟, 葉武威, 趙云雷, 樊保香, 宋麗艷, 張麗娜. 棉花芽期抗冷性鑒定方法及抗冷性機(jī)理的研究. 棉花學(xué)報(bào), 2008, 20(6): 477-479. WANG J J, YE W W, ZHAO Y L, FAN B X, SONG L Y, ZHANG L N. Studies on identification way and mechanism of chilling resistance at bud bursting period in cotton. Cotton Science, 2008, 20(6): 477-479. (in Chinese)

[22] 李志博, 華顯偉, 魏亦農(nóng), 曹連莆. 葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)O-J-I-P參數(shù)在棉花幼苗耐冷性評(píng)價(jià)上的應(yīng)用, 棉花學(xué)報(bào), 2010, 22(2): 132-137. LI Z B, HUA X W, WEI Y N, CAO L P. Cold tolerance evaluation of cotton seedling using some parameters of chlorophyll a fluorescence kenitics O-J-I-P. Cotton Science, 2010, 22(2): 132-137. (in Chinese)

[23] 李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù). 北京: 高等教育出版社, 2000: 148-219. LI H S. Plant Physiology and Biochemistry Experimental Principles and Techniques. Beijing: Higher Education Press, 2000: 148-219. (in Chinese )

[24] 張南. 菠菜種質(zhì)資源遺傳多樣性及耐寒性鑒定 [D]. 哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007. ZHANG N. Study on the genetic diversity and the low temperature tolerance of spinach germplasm [D]. Harbin: Northeast Agricultural University, 2007. (in Chinese)

[25] 扈光輝. 玉米種質(zhì)耐冷性鑒定及農(nóng)藝性狀遺傳分析 [D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2006. HU G H. Cold tolerance identification and genetic analysis of agronomic trait in maize germplasm [D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2006. (in Chinese)

[26] 張艷梅, 王敬國, 劉化龍, 鄒德堂. 東北粳稻不同生育期耐冷性分析. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 43(4): 43-48. ZHANG Y M, WANG J G, LIU H L, ZOU D T. Analysis of japonica rice cold tolerance at different growing periods in Northeast area. Journal of Northeast Agricultural University, 2012, 43(4): 43-48. (in Chinese )

[27] 游俊梅, 阮仁超, 陳惠查, 楊玉順, 金桃葉. 稻種資源耐冷性鑒定與評(píng)價(jià)指標(biāo)分析. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2000, 28(3): 34-36. YOU J M, RUAN R C, CHEN H C, YANG Y S, JIN T Y. Analysis and evaluation on cold tolerance for rice germplasm resources.Guizhou Agricultural Sciences, 2000, 28(3): 34-36. (in Chinese )

[28] 金銘路, 楊春剛, 余騰瓊, 郭桂珍, 湯翠鳳, 張俊國, 阿新祥, 曹桂蘭, 徐福榮, 劉憲虎, 戴陸園, 張三元, 韓龍植. 中國水稻微核心種質(zhì)不同生育時(shí)期耐冷性鑒定及其相關(guān)分析. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2009, 10(4): 540-546. JIN M L, YANG C G, YU T Q, GUO G Z, TANG C F, ZHANG J G, A X X, CAO G L, XU F R, LIU X H, DAI L Y, ZHANG S Y, HAN L Z. Evaluation of cold tolerance at different growing period for mini core collection of rice (Oryza stiva L.) in China. Journal of Plant Genetic Resources, 2009, 10(4): 540-546. (in Chinese)

[29] OMRAN R G. Peroxide levels and the activities of catalase peroxidase, and indoleacetic acid oxidase during and after chilling cucumber seedlings. Plant Physiology, 1980, 65: 407-408.

[30] PRASAD T K, ANDERSON M D, MARTIN B A, STEWART C R. Evidence for chilling-induced oxidative stress in maize seedlings and a regulatory role for hydrogen peroxide. The Plant Cell, 1994, 6: 65-74.

[31] GECHEV T, WILLEKENS H, VAN MONTAGU M, INZé D, VAN CAMP W, TONEVA V, MINKOV I. Different responses of tobacco antioxidant enzymes to light and chilling stress. Journal of Plant Physiology, 2003, 160: 509-515.

[32] BOWLER C, VAN MONTAGU M, INZE D. Superoxide dismutase and stress tolerance. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,1992, 43: 83-116.

[33] GUO Z, OU W, LU S, ZHONG Q. Differential responses of antioxidative system to chilling and drought in four rice cultivars differing in sensitivity. Plant Physiology and Biochemistry, 2006, 44: 828-836.

[34] 馬迪, 岳樺. 大葉鐵線蓮對(duì)低溫脅迫的響應(yīng). 北方園藝, 2010(6): 112-114. MA D, YUE H. Response on physiology and biochemistry of clematis heracleifolia under low temperature stress. Northern Horticulture, 2010(6): 112-114. (in Chinese)

（責(zé)任編輯 李莉）

Identification of the Chilling Resistance from Germination Stage to Seedling Stage in Upland Cotton

WANG Jun-juan, WANG De-long, YIN Zu-jun, WANG Shuai, FAN Wei-li, LU Xu-ke, MU Min, GUO Li-xue, YE Wu-wei, YU Shu-xun
(Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology/Key Laboratory for Cotton Genetic Improvement, Ministry of Agriculture, Anyang 455000, Henan)

【Objective】 Low-temperature is one of the main factors affecting the normal growth and development of cottonplants. Identification of chilling resistance of cotton is the prior condition for the mechanism of cold resistance, which also can provide certain theoretical

for cold resistance breeding. 【Method】 The temperature conditions for cotton cold resistance identification were screened at germination stage following 7 d recovery at normal conditions (28℃, day/night, 14 h/10 h) after 7 d treatment at different low temperatures of 0℃, 4℃, 10℃, 15℃ with 4 upland cotton varieties (lines) with different cold resistance levels. Screening of days of cold resistance identification for 0℃ low-temperature treatment at germination stage was performed by 7 d recovery after the respective treatments of 1, 2, 3, 4, 5, 6, and 7 d under 0℃ low temperature. Two upland cotton varieties (lines) with different cold resistance levels was treated for 1, 2, 3, 4, 5, 6, and 7 d under 4℃ low temperature and recovered 7 d in order to evaluate cold resistance of cotton at budding stage. Evaluation of cold resistance of cotton at cotyledon stage was carried out at 4℃for 24 h and normal growth was recovered for 7 d with 47 cotton varieties. The biochemical indexes of bud and cotyledon under low temperature were measured at budding and cotyledon stages with the reagent kit developed by Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. 【Result】 The study established the standards of identification of cold-resistance by screening the stress conditions at different growth periods, including germination stage, budding stage and cotyledon stage. The relative cotyledons unfolding rate under normal condition growth for 7 d after 0℃ treatment for 4 d can be served as a cold resistance identification index of germination stage. The relative cotyledons unfolding rate under normal condition growth for 7 d after 4℃ treatment for 5 d can be used as chilling resistance identification index of the budding stage. Chilling resistance index under normal condition growth for 7 d after 4℃ treatment for 24 h can be used for evaluating the chilling resistance of cotton at cotyledon stage. The activities of SOD and POD in the bud of cold-resistant variety Yu2067 were increased at the early stage of low-temperature treatment and then decreased to a steady, while the activities of two enzymes in the bud of chilling-sensitive cotton line Hengmian No.3 decreased at first and then increased to steady. The activity of CAT in the bud of two varieties all showed a uptrend at first and then downtrend, but the activity of CAT in Yu2067 was always higher than that in Hengmian No.3 at later stage of low-temperature treatment. Besides, the soluble protein contents in the bud of two varieties were similar at first, but the content in Yu2067 started to be higher than that in Hengmian No.3 at later stage of low-temperature treatment. After the treatment of 4℃ for 24 h at cotyledon stage, the activities of SOD, POD and CAT were all showed a down-trend in Yu2067 while they all went up in Hengmian3. But the soluble protein content in Yu2067 went up while declined in Hengmian No.3. 【Conclusion】 Specific identification ways are needed at different growth stages correspondingly. The standards of identification of cold-resistance levels at different stages are different. Different materials have different cold resistance at different growth stages. Based on the variation trends of enzyme activity of three enzymes, it was speculated that the cold-resistance of cotton at budding stage had relation with antioxidant enzymes activity, while the cold-resistance of cotton at cotyledon stage had little relation with three antioxidant enzyme activities, but may be closely with the soluble protein content.

Gossypium hirsutum L.; growth stages; cold resistance; identification ways; biochemical characteristics

2016-02-18；接受日期：2016-04-11

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-18-02A）

聯(lián)系方式：王俊娟，Tel：15093920872；E-mail：wjj2004liyuan@sina.com。通信作者喻樹迅，Tel：0372-2562201；E-mail：ysx195311@163.com