韓海玲, 金順子, 苗 壯, 陳 平, 王占峰, 謝志剛

(1. 吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 衛(wèi)生部放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)春 130021;2. 北華大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)三科, 吉林 132011;3. 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)外二科, 長(zhǎng)春 130033;4. 中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所, 高分子物理與化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)春 130022)

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嗜神經(jīng)病毒衍生肽RVG29介導(dǎo)的靶向納米載藥膠束的合成及抗腫瘤活性

韓海玲1,2, 金順子1, 苗 壯3, 陳 平3, 王占峰3, 謝志剛4

(1. 吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 衛(wèi)生部放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)春 130021;2. 北華大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)三科, 吉林 132011;3. 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)外二科, 長(zhǎng)春 130033;4. 中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所, 高分子物理與化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)春 130022)

將羧基化的水溶性葡聚糖(Dex)與紫杉醇(PTX)化學(xué)偶聯(lián), 制得載藥納米膠束M(PTX), 再將M(PTX)與嗜神經(jīng)性病毒衍生肽(RVG29)化學(xué)偶聯(lián), 得到RVG29靶向的載藥納米膠束M(RVG,PTX). 采用核磁共振氫譜(1H NMR)測(cè)定了Dex-PTX及RVG-Dex-PTX鍵合物的分子量, 并對(duì)2種膠束進(jìn)行了表征, 考察了2種膠束對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果及細(xì)胞凋亡情況, 觀察了C6細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記M(RVG,PTX)和M(PTX)的攝取情況. 結(jié)果表明, 羧基化葡聚糖-紫杉醇鍵合物的分子量約為16500, 紫杉醇的質(zhì)量約為葡聚糖的20%, RVG29的質(zhì)量約為葡聚糖的10%. 2種膠束的粒徑在45～60 nm之間; M(RVG,PTX)膠束對(duì)C6細(xì)胞的抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性, 細(xì)胞抑制率隨著作用時(shí)間和藥物濃度增加而增加, 且M(RVG,PTX)膠束對(duì)C6細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于M(PTX)膠束. 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 與M(PTX)相比, C6細(xì)胞攝取了更多的M(RVG,PTX)膠束. 如果先用游離的RVG29處理C6細(xì)胞, 再進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn), 則M(RVG,PTX)膠束對(duì)C6細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及被C6細(xì)胞攝取的比率顯著降低, 與 M(PTX)相當(dāng). 表明靶向載藥膠束M(RVG,PTX)中的RVG29保留了游離RVG29的活性, 對(duì)C6細(xì)胞依然具有靶向效應(yīng), 從而介導(dǎo)了M(RVG,PTX)被C6細(xì)胞的攝取, 增強(qiáng)了對(duì)C6細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用. 由于M(RVG,PTX)膠束只使用水溶性葡聚糖作載體, 不涉及疏水高分子鏈段, 不需要分別制備載藥高分子和靶向高分子然后再共組裝, 因而制備過(guò)程比較簡(jiǎn)單, 同時(shí)具有載藥和靶向功能.

嗜神經(jīng)性病毒衍生肽; 腦膠質(zhì)瘤; 腫瘤靶向; 紫杉醇; 納米載藥膠束

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見(jiàn)惡性腫瘤, 發(fā)病率約占顱內(nèi)腫瘤的40%. 高復(fù)發(fā)率和高惡性度導(dǎo)致患者5年存活率極低. 目前治療方法有手術(shù)、 放射和化學(xué)治療, 對(duì)Ⅲ-Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤主要采用化學(xué)治療[1～3]. 但由于血腦屏障和腫瘤的耐藥性, 現(xiàn)有腦膠質(zhì)瘤化療藥物品種有限, 療效欠佳, 對(duì)延長(zhǎng)患者存活期幾乎無(wú)貢獻(xiàn)[4]. 隨著納米技術(shù)的發(fā)展, 納米藥物在癌癥治療中顯示出巨大的潛力和優(yōu)越性. 其中, 腫瘤靶向給藥體系將藥物選擇性地送到病變部位或病變細(xì)胞, 可以提高藥物的生物利用度, 降低毒副作用, 因而備受關(guān)注[5]. 紫杉醇(PTX)是多種腫瘤的一線化療藥物, 但其水溶性差, 臨床劑型難以通過(guò)血腦屏障, 對(duì)腦膠質(zhì)瘤幾乎無(wú)效[6]. Jing等[7～11]設(shè)計(jì)了多種納米給藥系統(tǒng), 將PTX鍵合在兩親性嵌段共聚物分子鏈上再自組裝成納米膠束. 與傳統(tǒng)的物理包裹不同, 這種鍵合型納米膠束可有效地增溶難溶性藥物, 避免初期暴釋, 延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間, 提高生物利用度. 通過(guò)載藥高分子和靶向高分子的共組裝, 可以制得具有靶向功能的載藥納米膠束, 將藥物選擇性地送到病變部位或病變細(xì)胞, 進(jìn)一步提高藥物的生物利用度, 降低毒副作用. 但此類(lèi)制劑使用兩親性嵌段共聚物作為基本載體, 合成難度較高, 新藥審批的難度也比較大[12,13].

狂犬病病毒是自然界存在的嗜神經(jīng)病毒, 其衣殼中包含有嗜神經(jīng)性蛋白質(zhì)(RVG), 能被神經(jīng)細(xì)胞表面的尼古丁乙酰膽堿受體(nAchR)特異性地識(shí)別. 在RVG作用下, 狂犬病病毒很容易越過(guò)血腦屏障, 侵襲腦組織和神經(jīng)中樞, 引發(fā)狂犬病. 研究發(fā)現(xiàn), RVG中的29個(gè)氨基酸序列嗜神經(jīng)性病毒衍生肽(RVG29)[13～15](YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)同樣可被nAchR特異性地識(shí)別. Liu等[16]和Gong等[17]將RVG29鍵合到聚酰胺-胺樹(shù)狀聚合物(PAMAM)和聚亞乙胺(PEI)上, 用以擔(dān)載和輸送核酸類(lèi)藥物, 具有一定的腦靶向效果. 經(jīng)RVG29修飾的PAMAM和PEI能夠通過(guò)血腦屏障(BBB)模型, 但對(duì)細(xì)胞毒類(lèi)抗癌藥物的腦靶向輸送鮮有報(bào)道.

葡聚糖可以在肝、 脾、 腎和消化道被葡聚糖酶降解, 毒性極低, 用葡聚糖修飾的高分子膠束在體內(nèi)具有類(lèi)似聚乙二醇(PEG)的“隱形”效果. 載藥葡聚糖納米顆?？蓽p少肝臟對(duì)藥物的清除, 提高在高度血管化的癌變組織中的藥物濃度[18,19]. 本文首先將葡聚糖羧基化, 然后將羧基化的葡聚糖與紫杉醇(PTX)化學(xué)偶聯(lián), 制得載藥納米膠束M(PTX), 將M(PTX)與RVG29化學(xué)偶聯(lián), 得到RVG29靶向的載藥納米膠束M(RVG,PTX), 考察腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞對(duì)M(PTX)和M(RVG,PTX)的攝取能力和2種膠束對(duì)C6細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制能力, 通過(guò)比較M(PTX)和M(RVG,PTX)被細(xì)胞攝取和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力研究RVG29的引入對(duì)細(xì)胞攝取及細(xì)胞凋亡的貢獻(xiàn), 判斷M(RVG,PTX)膠束越過(guò)BBB, 實(shí)現(xiàn)腦靶向的可能性.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、 4-二甲氨基吡啶(DMAP)、 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)和狂犬病病毒衍生肽(RVG29), 上海吉諾生物技術(shù)有限公司; 葡聚糖(Dex, 分子量10000), 上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 紫杉醇(PTX), 西安寶賽生物科技有限公司; 二氯甲烷(DCM)和三乙胺(TEA), 分析純, 北京化工廠, 使用前用氫化鈣干燥后蒸餾; 乙腈, 色譜純, 上海復(fù)旦化學(xué)試劑有限公司; 二次蒸餾水, 用SZ-93型自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)制備; 磷酸鹽緩沖溶液(PBS), 濃度為0.01 mol/L (pH =7.4); 醋酸纖維素材質(zhì)的透析袋, 截留分子量3500; 鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(C6細(xì)胞), 吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室; 培養(yǎng)基: DMEM(美國(guó)Sigma公司)+10%(體積比)熱滅活小牛血清+青霉素100 U/mL+鏈霉素100 μg/mL, pH=7.2～7.3, 過(guò)濾消毒; 小牛血清, 杭州四季青生物材料有限公司; 青霉素和鏈霉素, 華北制藥廠; 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT), 上海阿拉丁試劑公司.

德國(guó)Varian公司Unity-400型或300型核磁共振儀(1H NMR), 溶劑為DMSO-d6, 以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo); 美國(guó)Perkin Elmer公司LS-55型熒光光譜儀; 德國(guó)Leica公司TCS SP2型共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM); 英國(guó)Malvern 公司Nano ZS90型激光粒度儀; 日本JEOL公司JEM-1011型透射電子顯微鏡(TEM); 美國(guó)Wyatt Technology公司DAWN EOS型動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS); 美國(guó)BD Bioscience公司FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(FCM).

1.2 M(PTX)和M(RVG,PTX)的制備及表征

M(PTX), RVG-Dex-PTX及M(RVG,PTX)的制備過(guò)程如Scheme 1所示.

Scheme 1 Synthesis routs of M(PTX), RVG-Dex-PTX and M(RVG,PTX)

參照文獻(xiàn)[20]方法, 將葡聚糖與丁二酸酐反應(yīng), 制備羧基化葡聚糖; 將65 mg羧基化葡聚糖和20 mg紫杉醇溶解在10 mL DMF中, 再加入8 mg DCC和5 mg DMAP, 室溫下反應(yīng)24 h, 過(guò)濾后用乙醇沉淀, 得到62 mg 葡聚糖-紫杉醇鍵合物(Dex-PTX); 將20 mg Dex-PTX溶于5 mL DMF中, 然后加入10 mL二次蒸餾水, 攪拌2 h后透析24 h以除去有機(jī)溶劑, 得到Dex-PTX的納米膠束M(PTX).

在50 mg M(PTX)納米膠束溶液(10 mL)中加入23 mg EDC和26 mg sulfo-NHS, 室溫?cái)嚢? h后, 加入5 mg RVG29, 繼續(xù)攪拌24 h, 透析除去未反應(yīng)的RVG29, 獲得RVG29靶向膠束M(RVG,PTX), 凍干備用. 構(gòu)成該膠束的聚合物即為RVG-Dex-PTX.

1.3 羧基化葡聚糖的生物相容性檢測(cè)

將消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6細(xì)胞制成2×105Cell/mL的懸液, 接種于96孔培養(yǎng)板, 每孔100 μL細(xì)胞懸液(2×104Cell), 并加入200 μL羧基化葡聚糖的DMEM溶液, 濃度分別為20, 40, 80, 160, 320 μg/mL, 培養(yǎng)1～5 d, 以DMEM培養(yǎng)液作為對(duì)照, 采用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)各組的細(xì)胞數(shù), 考察載體材料的生物相容性.

1.4 載藥膠束對(duì)腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的抑制作用

1.4.1 MTT實(shí)驗(yàn) 將消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6細(xì)胞制成2×105Cell/mL的細(xì)胞懸浮液, 接種于96孔培養(yǎng)板上, 每孔100 μL懸浮液(2×104Cell), 貼壁生長(zhǎng)24 h后, 加入200 μL M(RVG,PTX)膠束或M(PTX)膠束溶液(其紫杉醇含量分別為40, 20, 10, 5.0 μg/mL), 分別培養(yǎng)24, 48和72 h, 以DMEM培養(yǎng)液為對(duì)照, 采用MTT法檢測(cè). 細(xì)胞抑制率(CI)由公式CI(%)=(AControl-AExp.)/AControl×100%[AControl和AExp.分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組MTT反應(yīng)產(chǎn)物甲瓚(Formazan)溶液在570 nm的吸光度]計(jì)算.

1.4.2 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將消化C6細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中, 細(xì)胞密度5×105Cell/mL, 于37 ℃培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液, 分別加入PTX濃度為0, 20和40 μg/mL的M(PTX)或M(RVG,PTX)膠束溶液, 計(jì)時(shí). 在24和48 h分別收集各組細(xì)胞, 加入0.5 mL冰冷的70%乙醇溶液中, 于-20 ℃冰箱保存. 將單細(xì)胞懸液以1000 r/min離心10 min, 棄去固定液, 用冷PBS緩沖液漂洗2次(1000 r/min, 5 min), 調(diào)整細(xì)胞為1×109Cell/L, 加入5 μL Annexin V, 195 μL PBS緩沖液及20 μL PI, 室溫避光孵育20 min, 用FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率. 每個(gè)劑量組檢測(cè)3個(gè)平行樣, 取平均值.

1.5 C6細(xì)胞對(duì)M(PTX)和M(RVG,PTX)的攝取

1.5.1 CLSM檢測(cè) 通過(guò)DCC縮合方法制備Cy5標(biāo)記的葡聚糖(Cy5-Dex). 取50 mg分子量為10000的葡聚糖和21 mg Cy5溶解于20 mL DMF, 加入 25 mg DCC和8 mg DMAP, 室溫?cái)嚢?4 h后過(guò)濾, 用50 mL乙醇沉淀得到Cy5-Dex. 將Cy5-Dex和Dex-PTX及RVG-Dex-PTX共組裝, 制備熒光標(biāo)記的納米膠束M(Cy5,PTX)和M(Cy5,RVG,PTX). 考慮到2種膠束熒光量子效率可能有差別, 首先用熒光光度計(jì)測(cè)定不同濃度Cy5-Dex的2種膠束溶液的熒光強(qiáng)度, 根據(jù)熒光強(qiáng)度的具體數(shù)值, 適度稀釋較強(qiáng)熒光溶液, 確保2種溶液熒光強(qiáng)度在讀數(shù)誤差范圍內(nèi), 然后用于細(xì)胞的攝取.

用1% PBS緩沖液沖洗預(yù)先培養(yǎng)在NEST玻底培養(yǎng)皿(上海耐思科學(xué)有限公司)上的C6細(xì)胞3次, 加入等體積相同熒光強(qiáng)度的M(Cy5,PTX)和M(Cy5, RVG,PTX)膠束溶液, 于37 ℃避光孵育1～2 h, 用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞, 加入3.7%多聚甲醛固定細(xì)胞12 min, 用PBS緩沖液沖洗, 滴加50 μL PBS/甘油混合溶液(體積比1∶1), 蓋上專(zhuān)用蓋玻片, 進(jìn)行CLSM觀察.

1.5.2 FCM檢測(cè) 將1 mL 密度為1×106Cell/mL的細(xì)胞懸液種植在6孔板中, 以DMEM為培養(yǎng)基, 于37 ℃無(wú)菌培養(yǎng), 觀察到細(xì)胞均勻貼壁生長(zhǎng)后, 加入等體積等熒光強(qiáng)度的M(Cy5,PTX)和M(Cy5, RVG, PTX)膠束溶液, 反應(yīng)1～2 h后倒掉培養(yǎng)基, 加入1 mL胰蛋白酶, 孵育1 min左右, 在顯微鏡下觀察細(xì)胞由貼壁狀態(tài)變?yōu)閼腋顟B(tài). 收集細(xì)胞懸液, 以1000 r/min的速度離心5 min, 棄去上清液, 離心管底部細(xì)胞重新用新鮮的0 ℃ PBS緩沖液吹打懸浮. 重復(fù)3次后, 取3 mL 細(xì)胞懸液, 用200目尼龍布過(guò)濾后, 用流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)進(jìn)行測(cè)試, 記錄10000個(gè)細(xì)胞的熒光信號(hào), 計(jì)算平均值.

1.6 RVG封閉

在以上細(xì)胞攝取和生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)中, 為了證明RVG納米膠束是通過(guò)RVG受體介導(dǎo)的途徑進(jìn)入細(xì)胞, 專(zhuān)門(mén)設(shè)立一個(gè)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組, 在孵育介質(zhì)中加入游離RVG29, 使其濃度為40 μg/mL, 孵育30 min后再加入M(RVG,PTX)或M(Cy5, RVG,PTX)膠束溶液, 其它條件與正常M(RVG,PTX)或M(Cy5,RVG,PTX)組相同. 這一過(guò)程稱(chēng)為“RVG封閉(RVG-shielding)”, 相應(yīng)樣品稱(chēng)為“RVG-shielded M(RVG,PTX)”或“RVG-shielded M(Cy5,RVG,PTX)”.

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表述為“平均值(X)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)”. 采用t-檢驗(yàn)方法分析各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的統(tǒng)計(jì)偏差,p< 0.05 視為實(shí)驗(yàn)偏差有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合物和納米膠束的表征

Fig.1 TEM image of M(RVG,PTX) Inset: size distribution determined by DLS.

羧基化的葡聚糖是葡聚糖與丁二酸酐的反應(yīng)產(chǎn)物, 通過(guò)1H NMR計(jì)算得到葡聚糖的羧基化率約為50%, 即平均每個(gè)葡聚糖鏈上有31個(gè)羧基. 按1H NMR峰面積計(jì)算出Dex-PTX分子量為16500, 紫杉醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為葡聚糖的20%, 即每個(gè)葡聚糖分子鏈上約鍵合4個(gè)PTX; RVG-Dex-PTX分子量為19800, 即每個(gè)分子鏈上平均鍵合1個(gè)RVG29分子(分子量約3370). 圖1為M(RVG,PTX)的TEM照片. 可以看出, 膠束基本呈球形. 用DLS方法(圖1插圖)測(cè)得的膠束直徑, M(PTX)為(50.9±3.0) nm, M(RVG,PTX)為(60.8±4.0) nm. 由于紫杉醇是鍵合在Dex側(cè)鏈上, 并且高度疏水, 因而紫杉醇的疏水聚集是形成納米顆粒的驅(qū)動(dòng)力. 紫杉醇及與其鍵合的葡聚糖鏈段處于顆粒的內(nèi)部, 未鍵合紫杉醇的葡聚糖分子鏈連同游離的丁二酸羧基構(gòu)成顆粒的外層, 因而整個(gè)聚集體呈雙層膠束形態(tài), 使紫杉醇得到有效保護(hù), 在膠束中的含量高達(dá)20%, M(PTX)膠束在水中的溶解性很好. M(PTX)膠束的臨界膠束濃度(cmc)為0.4 mg/L, 說(shuō)明M(PTX)膠束在水和體液中有較好的穩(wěn)定性. M(RVG,PTX)膠束的cmc值為0.43 mg/L. 由于RVG29是在Dex-PTX膠束形成后連接上去的, 處于M(RVG,PTX)膠束的外層, 既增加M(RVG,PTX)膠束的溶解性, 又保證RVG29靶向多肽與C6細(xì)胞表面受體的充分接觸和作用, 實(shí)現(xiàn)膠束的靶向功能. 利用葡聚糖的水溶性和紫杉醇的疏水性, 既實(shí)現(xiàn)了紫杉醇的高效擔(dān)載, 又實(shí)現(xiàn)了靶向多肽RVG29的有效鍵合, 從而省去了常規(guī)雙親高分子所要求的疏水鏈段, 也避免了分別制備載藥高分子和靶向高分子, 再進(jìn)行共組裝的過(guò)程.

采用臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行C6細(xì)胞在加有羧基化葡聚糖的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24～120 h后的細(xì)胞計(jì)數(shù), 結(jié)果如表1所示. 在所考察的載體濃度和培養(yǎng)時(shí)間范圍內(nèi), 載體材料對(duì)C6細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用, 表明載體材料具有很好的生物相容性. 載體制備過(guò)程也沒(méi)有引入細(xì)胞毒性.

Table 1 Cell counting of C6 glioma treated with carboxylated dextran

2.2 載藥膠束對(duì)C6細(xì)胞增殖的抑制作用

圖2給出了M(PTX)和M(RVG,PTX)膠束溶液對(duì)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果. 隨膠束用量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng), 對(duì)C6細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率明顯增加. 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理, 各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間有顯著性差異(p<0.05). 由于葡聚糖和RVG29對(duì)C6細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用, 所以M(PTX)和M(RVG,PTX)對(duì)C6細(xì)胞的抑制作用來(lái)自膠束中所鍵合的紫杉醇. 在細(xì)胞培養(yǎng)條件下, 載藥納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞, 在細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境下, 連接紫杉醇的酯鍵發(fā)生水解, 紫杉醇分子從高分子鏈上解離下來(lái), 變成游離的紫杉醇而發(fā)揮抑制作用.

Fig.2 Cell inhibition of C6 glioma by M(PTX), M(RVG,PTX) and RVG-shielded M(RVG,PTX),determined by MTT assay as a function of PTX concentration Incubation time/h: (A) 24, (B) 48, (C) 72.

靶向載藥膠束M(RVG,PTX)的腫瘤細(xì)胞抑制率明顯高于非靶向載藥膠束M(PTX), 在每個(gè)PTX濃度值和每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都可觀察到這種差別. 當(dāng)PTX濃度為5 μg/mL時(shí), 在24, 48和72 h時(shí), M(PTX)組的C6細(xì)胞抑制率分別為(32±1.8)%, (44±1.8)%和(50±1.8)%, 而M(RVG,PTX)組的C6細(xì)胞抑制率分別為(43±2.8)%, (58±3.1)%和(62±3.1)%, 差別顯著(p<0.05).

為進(jìn)一步證實(shí)腫瘤細(xì)胞抑制率的增加是通過(guò)RVG29的靶向作用實(shí)現(xiàn)的, 采用游離RVG29多肽預(yù)先封閉相關(guān)受體, 再給予靶向載藥膠束M(RVG,PTX), 結(jié)果如圖2中“RVG-shielded”組所示. 可見(jiàn)封閉后M(RVG,PTX)的細(xì)胞抑制率與M(PTX)膠束組的抑制率無(wú)明顯差別. 當(dāng)PTX濃度為5 μg/mL時(shí), 24, 48和72 h時(shí)M(RVG,PTX)組的C6細(xì)胞抑制率分別為(43±2.8)%, (58±3.1)%和(62±3.1)%, 而RVG-shielded組的C6細(xì)胞抑制率分別為(34±2.6)%, (43±2.2)%, (52±2.2)%, 均明顯低于靶向載藥膠束組, 與未經(jīng)封閉的M(PTX)組相當(dāng)[(32±1.8)%, (44±1.8)%和(50±1.8)%]. 說(shuō)明游離RVG29與C6細(xì)胞上受體的結(jié)合能力強(qiáng)于鍵合后的RVG29, 而且在不封閉條件下M(RVG,PTX)的抑制效果是與RVG29的存在分不開(kāi)的, RVG29與細(xì)胞表面受體作用所介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)納米膠束的攝取, 提高了細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度, 增強(qiáng)了抑制效果.

2.3 細(xì)胞凋亡率

表2給出了用流式細(xì)胞儀檢測(cè)的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡率數(shù)據(jù). 細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞程序化死亡, 腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中伴隨著細(xì)胞凋亡異常(凋亡減弱). 因此, 通過(guò)不同途徑誘導(dǎo)及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞凋亡是抑制腫瘤生長(zhǎng)的有效途徑. 膜磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)是早期細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要標(biāo)志, 而PS與AnnexinV染料有很高的親和力. PI染料分子不能通過(guò)完好的細(xì)胞膜卻能夠通過(guò)破裂的細(xì)胞膜. 因而進(jìn)行Annexin V和PI雙染可區(qū)分正常細(xì)胞、 早期凋亡細(xì)胞、 晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞[21,22]. 本文用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同膠束處理的C6細(xì)胞, 測(cè)定Annexin V和PI雙陽(yáng)性的細(xì)胞比率, 即晚期細(xì)胞凋亡率. 與對(duì)照組[(1.15±0.2)%]相比, 用藥組的凋亡比率有明顯提高, 從M(PTX)組的(43.7±0.7)%到M(RVG,PTX)組的(58.9±0.7)%(PTX濃度20 μg/mL, 48 h), 具有顯著性差異(p<0.01). 同時(shí)這種誘導(dǎo)凋亡作用隨著藥物作用時(shí)間(從24 h到48 h)的增加而增加, 差異也有顯著性(p<0.05). RVG29靶向膠束M(RVG,PTX)的凋亡率高于單純載藥膠束M(PTX), 甚至20 μg/mL M(RVG,PTX)組的細(xì)胞凋亡率高于40 μg/mL的M(PTX). 經(jīng)過(guò)RVG29封閉后的M(RVG,PTX)組細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果與單純膠束M(PTX)組相似, 無(wú)明顯差異, 證實(shí)M(RVG,PTX)膠束對(duì)C6細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用是通過(guò)RVG靶向作用實(shí)現(xiàn)的.

Table 2 Effect of micelle treatment on apoptosis rate

2.4 CLSM及FCM檢測(cè)細(xì)胞攝取

圖3是M(Cy5,PTX), M(Cy5,RVG,PTX)和RVG29封閉后再用M(Cy5,RVG,PTX)處理的C6細(xì)胞的CLSM顯微照片. 藍(lán)色部分是用Hoechst33342染色的細(xì)胞核, 紅色熒光來(lái)自染料標(biāo)記的納米顆粒. 由圖3(A)和(B)可見(jiàn), 紅色熒光來(lái)自細(xì)胞漿部位, 說(shuō)明M(Cy5,RVG,PTX)和M(Cy5,PTX)膠束已經(jīng)被C6細(xì)胞吸收且多聚集于細(xì)胞漿中. 為了證實(shí)細(xì)胞對(duì)靶向膠束的攝入作用是通過(guò)RVG29介導(dǎo)的, 對(duì)一組細(xì)胞先進(jìn)行RVG29封閉, 30 min后給予靶向膠束M(Cy5,RVG,PTX), 結(jié)果表明, 細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度低于正常靶向膠束組, 而與單純載藥膠束組相似.

Fig.3 CLSM images of C6 cells after incubation for 2 h in the presence of M(Cy5, RVG,PTX)(A),M(Cy5,PTX)(B) and RVG-shielded M(Cy5,RVG,PTX)(C) micelles

由FCM檢測(cè)細(xì)胞的Cy5熒光強(qiáng)度的結(jié)果可見(jiàn), 靶向膠束組的熒光強(qiáng)度明顯高于非靶向膠束組[(70.0±4.7)對(duì)(46.7±2.6), 1 h, 見(jiàn)表3], 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05), 并且在使用RVG29預(yù)先封閉后, 靶向膠束組的效果明顯降低, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

用CLSM和FCM方法檢測(cè)細(xì)胞攝取的結(jié)果能夠互相印證, 說(shuō)明經(jīng)RVG29修飾的膠束由于RVG受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用, 比較容易被C6細(xì)胞內(nèi)吞, 這也是靶向載藥膠束M(RVG,PTX)比非靶向載藥膠束M(PTX)有更強(qiáng)的C6細(xì)胞抑制能力的原因.

Table 3 Flow cytometry detection of cellular uptake by C6 cells

3 結(jié) 論

將羧基化后的葡聚糖與紫杉醇化學(xué)偶聯(lián), 制備了載藥納米膠束M(PTX), 進(jìn)而將M(PTX)與RVG29化學(xué)偶聯(lián), 制備了RVG29靶向的載藥納米膠束M(RVG,PTX), 實(shí)現(xiàn)了在同一個(gè)載體高分子鏈上既鍵合藥物分子, 又鍵合靶向分子. 與通常的基于雙親高分子的靶向載藥膠束相比, 本文方法充分利用了葡聚糖的生物相容性、 水溶性和可反應(yīng)性以及紫杉醇的疏水性, 避免了分別合成載藥高分子和靶向高分子然后進(jìn)行共組裝的麻煩, 不需要使用專(zhuān)門(mén)的疏水聚合物鏈段, 就能使紫杉醇的含量達(dá)到20%, 且膠束的水溶性和凍干后的復(fù)溶性都很好, 因而具有實(shí)際應(yīng)用的潛力. 體外MTT, CLSM和FCM實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 靶向載藥膠束M(RVG,PTX)對(duì)C6細(xì)胞增殖的抑制能力強(qiáng)于載藥膠束M(PTX). 這種抑制作用主要表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞的凋亡, 這種增強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞凋亡與M(RVG,PTX)膠束表面的RVG29相關(guān). RVG29經(jīng)過(guò)與葡聚糖鍵合和膠束化后依然保持對(duì)C6細(xì)胞的靶向性, 即與C6細(xì)胞表面RVG受體的特異性識(shí)別和結(jié)合能力. M(RVG,PTX)正是通過(guò)RVG29的靶向作用提高了藥物的攝入效率, 增強(qiáng)了對(duì)腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的抑制作用, 具有良好的應(yīng)用前景.

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(Ed.: W, Z)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.20904002), the Program for New Century Excellent Talents in University of Ministry of Education of China(No.NCET-10-0171), the Young Scholars Programs of Science and Technology Commission Foundation of Jilin Province, China(No. 20130522020JH), the Programs of Educational Commission of Jilin Province of China During the 12th Five-Year Plan Period(No.2013107027) and the High-Technology Research and Development Programs of Jilin Province of China(No.JF2012C005-2).

Synthesis and Antitumor Activity of Targeting and Nano Drug-Carrying Micelles Mediated by Rabies-virus-derived Peptide RVG29?

HAN Hailing1,2, JIN Shunzi1, MIAO Zhuang3, CHEN Ping3,WANG Zhanfeng3*, XIE Zhigang4

(1.MinistryofHealthKeyLaboratoryofRadiobiology,SchoolofPublicHealth,JilinUniversity,Changchun130021,China;2.DepartmentofCardiac,AffiliatedHospitalofBeihuaUniversity,Jilin132011,China;3.DepartmentofNeurosurgery,ChinaJapanUnionHospital,JilinUniversity,Changchun130033,China;4.StateKeyLabofPolymerPhysicsandChemistry,ChangchunInstituteofAppliedChemistry,Changchun130022,China)

Starting with water soluble dextran(Dex), paclitaxel(PTX)-carrying micelles M(PTX) and Rabies-virus-derived peptide(RVG29)-targeted and PTX-carrying micelles M(RVG,PTX) were prepared, by carboxylation of dextran and subsequently by conjugating PTX and RVG29 onto the carboxylated dextran. The products were characterized with nuclear magnetic resonance(1H NMR) spectroscopy, transmission electron microscopy(TEM), and dynamic light scattering(DLS). The uptakes of the micelles by C6cells and the inhibition rates of C6cell growth by the micelles were measured by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT) assay, by confocal laser scanning microscopy(CLSM), and by flow cytometry(FCM). The results showed that molecular weight of Dex-PTX was about 16500 and that of RVG-Dex-PTX was about 19800. Micelles M(PTX) and M(RVG, PTX) assumed a shape of spheres with a diameter of 45—60 nm. The mass ratio of Dex, PTX and RVG29 was about 100∶20∶10. M(RVG, PTX) exhibited higher cell growth inhibition rate against C6cells than M(PTX) and C6cells took in more M(RVG,PTX) than M(PTX) under the same experimental conditions. When C6cells were treated with free RVG29 prior to cellular experiments, the inhibition rate against C6cells and the uptake by C6cells of M(RVG,PTX) were significantly decreased and came to a level of M(PTX). This implied that the enhanced inhibition of C6cell growth by M(RVG,PTX) and the enhanced uptake of M(RVG,PTX) by C6cells were mediated by RVG29, and the RVG29 species after conjugation with Dex reserved the targeting ability of RVG29 itself to a reasonable extent. Furthermore, in the preparation of M(RVG, PTX) micelles, only Dex was used as a carrier polymer, no hydrophobic polymer segments were involvd and there was no need of preparing drug-carrying copolymers and targeting copolymers, separately, and then doing co-assembling of them. In short, the manufacturing of M(RVG,PTX) micelles is relatively simple but they have the functions of drug-carrying and C6-cell targeting, therefore, their practical application is expected.

Rabies-virus-derived peptide; Glioma; Tumor targeting; Paclitaxel; Nano drug-carrying micelle

10.7503/cjcu20150941

2015-12-09.

日期: 2016-03-04.

國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 20904002)、 教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào): NCET-10-0171)、 吉林省科技廳青年項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào): 20130522020JH)、 吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)科研支持計(jì)劃(批準(zhǔn)號(hào)2013107027)、 吉林省教育廳十二五重大課題(批準(zhǔn)號(hào): 2013107027)和吉林省高技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào): JF2012C005-2)資助.

O629; R730

A

聯(lián)系人簡(jiǎn)介: 王占峰, 男, 博士, 副主任醫(yī)師, 主要從事腦腫瘤和腦血管病的納米藥物治療和基礎(chǔ)研究.

E-mail: 1206hhl@sina.com