謝春清，佟國軍，葛文中

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院，大慶163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院）

總狀毛霉對17α-羥基孕甾-4-烯-3，20-二肟的生物轉(zhuǎn)化

謝春清1，佟國軍2，葛文中1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院，大慶163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院）

為了獲得具有較強生物學活性或結(jié)構(gòu)新穎的羥基甾體肟衍生物，利用總狀毛霉對合成的17α-羥基孕甾-4-烯-3，20-二肟進行轉(zhuǎn)化研究。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)柱層析分離純化后鑒定為7α，17α-二羥基-20-肟-孕甾-4-烯-3-酮（3）和11α，17α-二羥基-20-肟-孕甾-4-烯-3-酮（4）。目前微生物轉(zhuǎn)化甾體研究領域?qū)τ阽摅w肟的轉(zhuǎn)化研究少見報道，研究結(jié)果為甾體肟衍生物的發(fā)展奠定了基礎。

生物轉(zhuǎn)化；合成；甾體肟；羥基化；總狀毛霉

隨著甾體藥物的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)在甾體母核上引入雜原子后有更廣泛的生理活性［1］。甾體酮肟類化合物除了具有抗增殖、抗著床、抗早孕等活性外，還具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌等活性［2-3］。Krstic N M等［4-5］合成的膽甾-6-酮肟對子宮癌（HeLa）細胞和慢性骨髓白血?。↘-562）細胞具有較好的抑制作用。

甾體生物轉(zhuǎn)化研究中，細菌、放線菌和真菌等對甾體進行的生物轉(zhuǎn)化均有報道［6］?？偁蠲箍梢苑置诘鞍酌?，用于腐乳的生產(chǎn)，在工業(yè)生產(chǎn)上具有重要的應用價值［7］。Faramarzi M A等［8］利用總狀毛霉對雄甾-4-烯-3，17-二酮進行微生物轉(zhuǎn)化，并采用波譜學方法對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進行鑒定，生物轉(zhuǎn)化主要發(fā)生6β-、7α-、7β-、11α-、4α-羥基化以及17-羰基還原反應?？偁蠲箤︾摅w化合物具有較好的羥基化能力，但目前沒有發(fā)現(xiàn)利用總狀毛霉對甾體酮肟類化合物進行生物轉(zhuǎn)化的報道。

研究利用總狀毛霉對化學合成的17α-OH-孕甾-4-烯-3，20-二肟進行轉(zhuǎn)化，是對含肟甾體研究的一個新探索，將為系統(tǒng)研究甾體微生物轉(zhuǎn)化和藥物開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

總狀毛霉（Mucor racemosus CICC 3161），購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）。

斜面培養(yǎng)基：水1 000 mL，土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)液：水1 000 mL，蛋白胨12 g，葡萄糖30 g，磷酸二氫鉀1.3 g，酵母膏1.0 g，用1 mol·L-1的鹽酸溶液調(diào)pH至4.5。

1.2 底物

利用甾體原料17α-羥基黃體酮（1）與鹽酸羥胺反應（乙酸鈉做催化劑）合成17α-OH-孕甾-4-烯-3，20-二肟化合物。將0.75 g17α-羥基黃體酮溶于75 mL的95%的乙醇中，置于100 mL的圓底燒瓶中，在磁力攪拌器上攪拌加熱至55℃，加入1.20 g的乙酸鈉和0.52 g的鹽酸羥胺，一鍋法反應8 h，TLC監(jiān)測反應進程。反應完全后加入蒸餾水100 mL，充分攪拌，靜置冷卻，待白色物質(zhì)完全析出后，進行抽濾，真空干燥得到粗品。

將粗品用石油醚：乙酸乙酯=2.5∶1作淋洗劑進行柱層析分離，甲醇重結(jié)晶得到產(chǎn)物17α-OH-孕甾-4-烯-3，20-二肟（2），化合物2收率為45.2%。合成路線如圖1所示。

圖1 甾體二肟的合成Fig.1Synthesis of steroidal dioximes

1.3 微生物轉(zhuǎn)化及產(chǎn)物提取

在超凈工作臺中，接種總狀毛霉菌株到已滅菌的裝有120 mL發(fā)酵液的500 mL錐形瓶中。28℃，180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)40 h后，每瓶加入溶有17α-羥基孕甾-4-烯-3，20-二肟底物的95%乙醇2 mL，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 d后終止發(fā)酵。

過濾發(fā)酵液，用乙酸乙酯分別萃取發(fā)酵液和菌絲體各5次，合并有機層。50℃減壓濃縮，旋至一定體積。依次用飽和NaHCO3溶液、飽和NaCl溶液洗3次后，再用蒸餾水洗1次，加無水Na2SO4干燥后，將有機層減壓蒸干。置于50℃真空干燥箱中干燥，得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物粗品?？偁蠲箤?7α-羥基孕甾-4-烯-3，20-二肟的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 總狀毛霉對17α-羥基孕甾-4-烯-3，20-二肟的生物轉(zhuǎn)化Fig.2Biotransformation of 17α-hydroxy-pregane-4-ene-3，20-dioxime by mucor racemosus

1.4 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化

轉(zhuǎn)化產(chǎn)物先采用石油醚：二氯甲烷：乙酸乙酯= 1∶1∶2洗脫分離，用丙酮結(jié)晶純化后，得到產(chǎn)（3），收率12.1%。進一步用石油醚：二氯甲烷：乙酸乙酯=1∶1∶2.5為淋洗劑洗脫，分離得到產(chǎn)物用丙酮結(jié)晶純化后得到產(chǎn)（4）。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

2.1.1 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物3和4經(jīng)波譜學手段鑒定后結(jié)構(gòu)分別為：（1）7α，17α-二羥基-20-肟-孕甾-4-烯-3-酮（3），收率12.1%。IR（KBr）v·cm-1：3 420，2 960，1 735，1 640，927.1HNMRδ（ppm）：0.56（3H，s，C18-CH3），1.58（3H，s，C19-CH3），1.98（3H，s，C21-CH3），2.18（2H，d，C6-CH2），3.59（s，7α-H），5.61（1H，s，C4-CH）；13CNMRδ（ppm）：196.9（C－3），170.9（C－5），156.8（C－20），124.9（C－4），84.9（C－17），67.4（C－7），52.6（C－9），46.9（C－14），42.5（C－13），41.4（C－6），40.2（C－10），39.1（C－8），35.1（C－1），33.4（C－2），33.4（C－12），32.6（C－16），21.1（C－15），21.0（C－11），17.7（C－19），15.0（C－18），12.3（C－21）；MS m·z-1：345［M＋Na］＋。

（2）11α，17α-二羥基-20-肟-孕甾-4-烯-3-酮（4），收率11.9%。IR（KBr）v·cm-1：3 430（OH），2 935，1 710（3C=O），1 630，1 600，930；1HNMRδ（ppm）：1.24（3H，s，C19-CH3），1.76/0.94（2H，d，C7-CH2），2.36（2H，d，C6-CH2），5.61（1H，s，C4-H），1.74（3H，s，C21-CH3），3.77（s，11α-H）；13CNMRδ（ppm）：198.7（C－3），171.8（C－5），157.7（C－20），123.5（C－4），84（C－17），67.8（C－11），58.3（C－9），48.6（C－14），46.9（C－13），42.6（C－12），38.8（C－10），37.0（C－1），34.6（C－8），33.8（C－2），33.0（C－6），32.4（C－16），31.6（C－7），22.9（C－15），17.9（C－19），16.2（C－18），11.0（C－21）；MS m·z-1：345［M＋Na］＋。

2.2 討論

2.2.1 甾體二肟的化學合成

甾體二肟要通過對反應溫度、反應時間以及反應物之間摩爾比的嚴格控制來合成的。實驗發(fā)現(xiàn)：經(jīng)TLC檢測，反應溫度太高（高于80℃），副產(chǎn)物的種類會增多，造成產(chǎn)物分離困難，產(chǎn)率降低；反應溫度太低（低于45℃）時，反應需要長時間的進行，而且反應不完全。實驗結(jié)果確定反應溫度在65℃最佳。

以17α-羥基黃體酮為底物，反應時間應該控制在12 h以上，3位、17位的兩個酮基都發(fā)生肟化反應，反應不足12 h，產(chǎn)物是單肟（兩個酮基選擇性的發(fā)生肟化）和二肟甾體的混合物。反應物之間的摩爾比對反應起到關鍵作用，當n（NH2OH·HCl）：n（底物）=2∶1時，由于NH2OH·HCl不能被完全利用，所以有部分底物反應不完全，有甾體單肟生成，n（NH2OH·HCl）：n（底物）=3∶1底物中的兩個酮基都能被肟化。

在此肟化過程中，反應環(huán)境要求是弱堿性，催化劑對反應影響較大，一般以NaHCO3、Na2CO3、吡啶或乙酸鈉作催化劑。以NaHCO3或Na2CO3為催化劑時，因CO32-和HCO3-不夠穩(wěn)定，在反應中，其量不能很好的控制，而且后處理操作繁雜。吡啶能與水互溶，呈堿性，但吡啶易燃，而且惡臭，有強烈的刺激性，能麻痹中樞神經(jīng)系統(tǒng)。乙酸鈉用量容易控制，反應效果好，后處理簡單，實驗采用乙酸鈉做催化劑。

2.2.2 甾體二肟的生物轉(zhuǎn)化

利用總狀毛霉對17α-羥基孕甾-4-烯-3，20-二肟進行生物轉(zhuǎn)化研究。研究結(jié)果表明，底物主要發(fā)生7α-羥基化、11α-羥基化反應，同時伴有C-3位肟基的水解反應。

在17α-羥基孕甾-4-烯-3，20-二肟（2）進行生物轉(zhuǎn)化過程中，經(jīng)TLC檢測，在加入底物9 h后有新物質(zhì)的出現(xiàn)，該物質(zhì)極性介于17α-羥基孕甾-4-烯-3，20-二肟與17α-羥基孕甾-4-烯-3，20-二酮之間，在后續(xù)的發(fā)酵過程中，在9～18 h時，含量有所增加，在18 h后明顯的下降直至發(fā)酵結(jié)束消失。在發(fā)酵至18 h時，化合物3出現(xiàn)，在27 h后有化合物4出現(xiàn)，到發(fā)酵進行到第5 d時，化合物3和4含量不再明顯增加。

化合物2的生物轉(zhuǎn)化歷程可能為：化合物2經(jīng)總狀毛霉轉(zhuǎn)化先發(fā)生3-肟基的水解反應，接著進行7α-羥基化反應生成化合物3，最后3-肟基的水解產(chǎn)物發(fā)生11α-羥基化反應得到化合物4。

葛文中等［9］利用該總狀毛霉菌株對4-烯-3-酮類甾體衍生物進行生物轉(zhuǎn)化，4-雄烯二酮的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是14α-羥基-雄甾-4-烯-3，17-二酮、14α，17β-二羥基雄甾-4-烯-3-酮和6 α，17 β-二羥基雄甾-4-烯-3-酮。黃體酮生物轉(zhuǎn)化得到的產(chǎn)物是14 α-羥基-4-孕甾烯-3，20-二酮和7 α，14 α-二羥基-4-孕甾烯-3，20-二酮；顯示總狀毛霉對4-烯-3-酮類甾體生物轉(zhuǎn)化主要是14 α-羥基化［10-11］，此外還發(fā)生6 β、7 α、7 β及11 α-羥基化。研究中，總狀毛霉對17 α-羥基孕甾-4-烯-3，20-二肟底物生物轉(zhuǎn)化發(fā)生的羥基化反應是7 α-羥基化，還伴隨有11 α-羥基化反應?？赡苁且驗?7 α-羥基孕甾-4-烯-3，20-二肟中3-酮、20-酮基團改變?yōu)闃O性較大的肟基，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，對各原子的影響發(fā)生改變，對總狀毛霉中酶的誘導發(fā)生變化，因此，生物轉(zhuǎn)化的方式也不同，轉(zhuǎn)化過程中主要發(fā)生了7 α-羥基化，伴隨有11 α-羥基化，沒有14 α-羥基化反應發(fā)生，說明17 α-羥基孕甾-4-烯-3，20-二肟底物主要受總狀毛霉產(chǎn)生的7 α-羥基化酶，以及少量11 α-羥基化酶作用。在此生物轉(zhuǎn)化過程中，發(fā)生的水解反應是3-肟基水解反應，其中3-肟基可能受底物中4-烯基團的影響，相比20-肟基更容易水解。在生物轉(zhuǎn)化過程，20-肟基沒有發(fā)生水解，可能與甾體肟的結(jié)構(gòu)有關，17 α-羥基可能與20-肟基生成氫鍵，構(gòu)成六元環(huán)，增加了穩(wěn)定性，使得20-肟基不易發(fā)生水解。

7α-羥基-甾體具有重要的生理活性，研究發(fā)現(xiàn)在肝臟中7α-OH-DHEA的抗氧化作用優(yōu)于DHEA［12］，DHEA的7-羥基衍生物，已被證實對治療癌癥和阿爾茨海默病有一定療效，同時還具能增強機體免疫、增加抗糖皮質(zhì)激素和促進減肥的功效［13］。Faramarzi M A等［14］利用Neurospora crassa轉(zhuǎn)化得到的化合物7α-羥基-雄甾-4-烯-3，17-二酮可作為利尿劑。

11α-羥基是皮質(zhì)激素發(fā)揮抗炎作用及糖代謝作用的必需官能團，C-11位羥基甾體具有實際應用價值［15］。甾體的11α-羥基化對于甾體藥物的合成及結(jié)構(gòu)改造具有重要意義，通過11α-羥基化后甾體可以引入高生理活性基團，從而大大增加療效，減少副作用［16］。

3 結(jié)論

研究通過乙酸鈉做催化劑合成甾體二肟，利用總狀毛霉對合成的17α-OH-孕甾-4-烯-3，20-二肟轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物7α，17α-二羥基-20-肟-孕甾-4-烯-3-酮（3）和11α，17α-二羥基-20-肟-孕甾-4-烯-3-酮（4），表現(xiàn)出總狀毛霉特異羥基化活性。研究結(jié)果為甾體肟衍生物的發(fā)展奠定了基礎。同時通過使用化學合成與生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合的方式為甾體肟的獲得提供新的思路。

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Biotransformation of 17α-hydroxy-pregane-4-ene-3，20-dioxime by Mucor racemosus

Xie Chunqing1，Tong Guojun2，Ge Wenzhong1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University）

In order to get strong biological activity or novel structure of oxime-steroids，the biotransformation of 17α-hydroxypregane-4-ene-3，20-dioxime by mucor racemosus was studied.The transformation products were purified with column chromatography and determined as 7α，17α-dihydroxy-20-oxime-4-en-3-one（3）and 11α，17α-dihydroxy-20-oxime-4-en-3-one（4）.The transformation of oxime-steroids rarely occured in microbial transformations of steroid，based on the best of our knowledge，the results lay a foundation for rich diversities of oxime-steroids.

biotransformation；synthesize；oxime-steroids；hydroxylation；mucor racemosus

Q939.5

A

1002-2090（2016）04-0075-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.04.017

2015-10-24

黑龍江省教育廳項目（12521384）。

謝春清，女，黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院2013級碩士研究生。

葛文中，男，教授，碩士研究生導師，E-mail：wenzhongg@126.com。