史　功，李先哲，李　瑾，胡　強(qiáng)，劉　洋，殷國棟，馬魯霞，李夢(mèng)文，王　鑫

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

臍血源間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)SCID小鼠燙傷創(chuàng)面修復(fù)的促進(jìn)作用

史功，李先哲，李瑾，胡強(qiáng)，劉洋，殷國棟，馬魯霞，李夢(mèng)文，王鑫＊

目的探討異體間充質(zhì)干細(xì)胞局部移植對(duì)促進(jìn)小鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面組織修復(fù)的作用，為臨床皮膚損傷后功能性修復(fù)提供新的治療方法。方法利用之前所分離純化的胎兒臍血源間充質(zhì)干細(xì)胞株（FUCB－MSCs），體外擴(kuò)增行流式細(xì)胞儀檢測間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物陽性表達(dá)情況；應(yīng)用免疫缺陷SCID小鼠建立了深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面動(dòng)物模型；將FUCB－MSCs（2×106）注射移植到患處創(chuàng)面下，設(shè)置空白對(duì)照，分別于移植后7、14和21 d通過觀察比較、常規(guī)組織學(xué)、免疫組化動(dòng)態(tài)觀察創(chuàng)面愈合效果。結(jié)果移植7 d開始，各組創(chuàng)面逐漸縮小，移植14 d后，大部分創(chuàng)面開始愈合，各組創(chuàng)面的愈合時(shí)間分別為（15．3±1．5）、（19．3±2．1）和（24．4±3．6）d，差異有顯著性意義（P＜0．05）。結(jié)論FUCB－MSCs異體移植在一定程度上可以促進(jìn)深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合，局部（患處）移植效果優(yōu)于尾靜脈移植。這些初步結(jié)果為細(xì)胞治療從實(shí)驗(yàn)室模擬向臨床皮膚損傷修復(fù)提供了理論依據(jù)。

間充質(zhì)干細(xì)胞；移植；組織修復(fù)；血管化

隨著對(duì)皮膚受創(chuàng)修復(fù)質(zhì)量要求的不斷提高，如何使受創(chuàng)組織達(dá)到解剖重建與功能修復(fù)直至完美的程度已成為當(dāng)今組織修復(fù)研究中需要解決的重要問題［1］。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞因采集方便，低免疫原性，倫理道德受限程度小以及易于擴(kuò)增培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)倍受國內(nèi)外研究者青睞［2－4］。為此，筆者將臍血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞FUCB－MSCs移植于小鼠皮膚創(chuàng)面以觀察它對(duì)提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量的作用和影響。

1　材料與方法

1.1主要儀器和材料臍血取自筆者所在院產(chǎn)科，征得知情同意后收集并報(bào)筆者所在醫(yī)院倫理委員會(huì)備案，臍血僅限用于該院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行基礎(chǔ)研究。分離液等購自碧云天，培養(yǎng)液DMEM等購自GIBCO BRL；抗體購自BD公司；免疫組化抗體及試劑購自DAKO公司。流式細(xì)胞儀 BD FACS，Olympus倒置相差顯微鏡等，系屬濱州醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室；SCID小鼠，雄性，6～8周齡，購自上海斯萊克，SPF環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1FUCB-MSCs細(xì)胞株的建立和培養(yǎng)臍血標(biāo)本以等量的PBS緩沖液混勻，緩慢滴入到等量的淋巴細(xì)胞分離液（1．073 kg/L），650 g離心15 min。抽取白膜層細(xì)胞，以等量的PBS緩沖液洗滌離心，基礎(chǔ)培養(yǎng)液 （DMEM/F12，10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和鏈霉素、2 mmol/L L－谷氨酰胺）重懸，接種至100 mm培養(yǎng)皿，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，第3天首次半量換液，棄去未貼壁細(xì)胞，以后換液1次/3～4 d。倒置相差顯微鏡下觀察。細(xì)胞達(dá)80%融合后，用0．25%胰酶（含0．02%EDTA）的胰酶消化，按1∶2～1∶3傳代，續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.2.2FUCB-MSCs細(xì)胞表面抗原CD29和CD90陽性表達(dá)分析對(duì)第9代FUCB－MSCs表面特異性抗原進(jìn)行檢測。胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液。含2%牛血清白蛋白的PBS緩沖液沖洗細(xì)胞，室溫下分別與CD29－PE、CD90－PE單克隆抗體避光孵育15 min。PBS緩沖液沖洗細(xì)胞，離心，棄上清。加入含1%多聚甲醛的PBS緩沖液0．3 ml，使用同型對(duì)照單克隆抗體確定背景標(biāo)記，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面抗原。

1.2.3免疫缺陷SCID小鼠燙傷模型建立實(shí)驗(yàn)前1 d小鼠背部皮膚去毛，采用恒溫恒壓電燙儀于其背部造成直徑1．5 cm的深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面。創(chuàng)面隨機(jī)分為空白對(duì)照組、FUCB－MSCs局部移植治療組和尾靜脈移植治療組?？瞻讓?duì)照組不加處理。

1.2.4創(chuàng)面面積測量燙傷后7、14、21 d用透明膜覆蓋創(chuàng)面并沿創(chuàng)緣畫膜，剪膜，置分度值為0．1 mg的天平稱重?fù)Q算成面積。

1.2.5免疫組織化學(xué) （血管化觀察）所有組織標(biāo)本均常規(guī)經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為0．10的中性甲醛溶液固定，逐級(jí)乙醇脫水，石蠟包埋。將存檔蠟塊用LEISA石蠟切片機(jī)做4 μm連續(xù)切片，行免疫組織化學(xué)染色，設(shè)置空間對(duì)照。采用免疫組織化學(xué)LSAB法，參照試劑盒說明書操作。

2　結(jié)　果

2.1FUCB-MSCs的分離培養(yǎng)擴(kuò)增FUCB－MSCs細(xì)胞經(jīng)過24 h體外培養(yǎng)后有少量貼壁細(xì)胞，在3 d內(nèi)呈相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，之后細(xì)胞生長速度加快，并呈克隆樣生長，7 d左右達(dá)到細(xì)胞融合，細(xì)胞形態(tài)呈比較均一的梭形。見圖1。

圖1　臍血來源間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定結(jié)果（100×）

2.2流式檢測標(biāo)志物陽性表達(dá)FUCB－MSCs表面抗原檢測結(jié)果見圖2，可見造血細(xì)胞表型CD34和CD45均呈陰性表達(dá)，CD29和CD90均呈陽性表達(dá)，陽性率平均在50%～70%。

圖2　流式檢測FUCB-MSCs的CD29、CD90陽性表達(dá)率

2.3創(chuàng)面面積和愈合時(shí)間對(duì)比所有實(shí)驗(yàn)SCID小鼠實(shí)驗(yàn)前后均存活，生命狀態(tài)正常，沒有術(shù)后感染、化膿、體液滲出等不良反應(yīng)。燙傷移植后5 d開始，創(chuàng)面逐漸縮小，形成新生表皮。移植后第14天，大部分創(chuàng)面愈合。各組創(chuàng)面的愈合時(shí)間分別為（15．3± 1．5）、（19．3±2．1）和（24．4±3．6）d，差異有顯著性意義（P＜0．05）。MSC局部移植治療組創(chuàng)面愈合早于尾靜脈移植組和空白對(duì)照組，提示局部（患處）移植有更好的治療效果。各組創(chuàng)面面積比較見圖3。

圖3　各組創(chuàng)面面積比較

2.4免疫組織化學(xué) （血管化）結(jié)果提示再上皮化的新生表皮在FUCB－MSCs局部（患處）移植治療組較其余組厚。FUCB－MSCs局部移植治療組肉芽組織中血管密度較大，為+++，提示毛細(xì)血管大量增生，尾靜脈移植治療組別僅為++。見圖4。

圖4　各組免疫組織化學(xué)（血管化）結(jié)果觀察

3　討論

目前，臨床上運(yùn)用各種手段對(duì)大面積深度燒傷創(chuàng)面進(jìn)行覆蓋，其結(jié)果是消滅了創(chuàng)面，挽救了患者生命。但不足之處是普遍存在愈合后的表皮薄，不耐摩擦，易起水泡以及無毛發(fā)和排汗功能等缺陷，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。由于臍血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞取材方便，倫理道德受限程度小，操作過程也相對(duì)簡單，被視為不錯(cuò)的細(xì)胞移植治療的種子材料［5-7］。

筆者在前期間充質(zhì)干細(xì)胞的研究基礎(chǔ)上，通過患處創(chuàng)面移植FUCB-MSCs發(fā)現(xiàn)其可以促進(jìn)皮膚損傷修復(fù)并提高愈合質(zhì)量，主要表現(xiàn)在經(jīng)FUCBMSCs治療后創(chuàng)面肉芽組織中血管密度大，治療組形成的新生表皮較厚，分層明顯，這些結(jié)果均與良好的修復(fù)質(zhì)量密切相關(guān)。尾靜脈移植治療組效果沒有達(dá)到理想的促進(jìn)創(chuàng)面愈合效果，可能與本實(shí)驗(yàn)只是在傷后24 h一次性給予治療，劑量較少的因素有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)初步結(jié)果提示在一定條件下采用臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植可提高損傷皮膚修復(fù)速度和質(zhì)量，但未進(jìn)行其修復(fù)分子機(jī)制的研究，我們估計(jì)其修復(fù)效果可能與創(chuàng)傷的刺激以及局部創(chuàng)面的微環(huán)境中含有多種因子有關(guān)［8-10］，這些因子多具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞趨化以及誘導(dǎo)定向分化的作用，筆者將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)這方面進(jìn)行深入研究。

志謝感謝第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部仵敏娟博士以及復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)院張國平老師對(duì)本實(shí)驗(yàn)的試劑惠贈(zèng)和技術(shù)指導(dǎo)。

［1］Stute N，Holtz K，Bubenheim M，et al.Autologous serum for isolation and expansion of human mesenchymal stem cells for clinical use［J］.Exp Hemato1，2004，32（12）：1212-1225.

［2］Deans RJ，Moseley AB.Mesenchymal stem cells：biololgy and potential clinical uses［J］.Exp Haematol，2000，28（8）：875-884.

［3］Goodwin HS，Bicknese AR，Hien SN，et al.Multilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord blood：expression of bone，fat，and neural markers［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2001，7（6）：581-588.

［4］Lee OK，Kuo KT，Chen WM，et al.Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood［J］.Blood，2004，103（15）：1669-1675.

［5］Wu M，Yang L，Liu S，et al.Defferentiation potential of human embryonic mesenchymal stem cells for skin-related tissue［J］. In Br J Dermatol，2006，155（3）：282-291.

［6］Romanov YA，Svintsitskaya VA，Smirnov VN.Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells：candidate MSC-like cells from umbilical cord［J］.Stem Cells，2003，21（1）：105-110.

［7］莫翠萍，王家傳，周光前.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷的神經(jīng)分化研究［J］.中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志：電子版，2015，5（3）：255-263.

［8］Jensen UB，Yan X，Triel C，et al.A distinct population of clonogenic and multipotent murine follicular keratinocytes residing in the upper isthmus［J］.In J Cell Sci，2008，21（6）：609-617.

［9］陳燕玲，王燕，賁曉明，等.表皮生長因子對(duì)外周血間充質(zhì)干細(xì)胞原代克隆形成的影響及其傳代后多向分化潛能［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13（17）：1891-1895.

［10］Mecklenburg L，Paus R，Halata Z，et al.FOXN1 is critical for onycholemmal terminal differentiation in nude（Foxn1）mice［J］. J Invest Dermatol，2004，123（9）：1001-1011.

［2016－04－15收稿，2016－05－13修回］

［本文編輯：韓仲琪］

The promotion role of transplantation of human mesenchymal stem cells derived from fetal umbilicalcord blood on the repair of scald wound in SCID mice

SHI Gong①，LI Xian－zhe，LI Jin，et al．①Dept．ofBlood Transfusion，No．107 Hospital of Chinese PLA，Yantai，Shandong 264002，China

ObjectiveTo investigate the promotion effect of transplantation of allogeneic mesenchymal stem cells on the repair of deep II－degree scald wound in SCID mice，so as to provide a new treatment way for functional repair after skin injury．MethodsBased on FUCB－MSC，which was isolated from fetal umbilical cord blood then purified into one kind of mesenchymal stem cell strains，after being cultured and amplified in vitro its expression of CD29 and CD90 was detected by flow cytometry；and alsoⅡ－degree scald wound animal model was established by using immunodeficient SCID mice；FUCB－MSCs（2×106cells）transplantation to the wounds with subcutaneous injection was taken，meanwhile the blank and control group was set up，the healing effect was analyzedthroughdynamicobservation，histologicalandimmunohistochemicalexaminationat7，14，21days respectively after scald－injury．ResultsThe wound at 7 days was gradually reduced，and the wound healing started at 14 days after the transplantation．The wound healing time was（15．3±1．5），（19．3±2．1）and（24．4±3．6）days respectively，there was a significant difference between all gorups（P＜0．05）．ConclusionFUCB－MSCs allotransplantation can promote the wound repair of deepⅡ－degree scald in a certain extent．The effect of FUCB－MSCs transplantation in the subcutaneous injection group is better than that of the tail vein group and the blank group is the slowest．These results provide a further theoretical basis for the cell biological therapy from lab．to ward．

Mesenchymal stem cell；Transplantation；Tissue repair；Angiogenesis

Q254

A

10．14172/j．issn1671－4008．2016．11．019

264002山東煙臺(tái)，解放軍107醫(yī)院輸血科（史功，李先哲，劉洋，殷國棟，馬魯霞，李夢(mèng)文，王鑫），皮膚科（李瑾），燒傷科（胡強(qiáng)），中心實(shí)驗(yàn)室（王鑫）

王鑫，Email：wang3j@gmail．com