曹雪連，張 衡，姜 昊，吳曾云，曹佳佳，朱玉磊，王升星，常 成，張海萍，馬傳喜

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部黃淮南部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230036)

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分子標(biāo)記PM19-A1對(duì)1 015份小麥抗穗發(fā)芽基因型的篩選及其有效性驗(yàn)證

曹雪連，張 衡，姜 昊，吳曾云，曹佳佳，朱玉磊，王升星，常 成，張海萍，馬傳喜

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部黃淮南部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230036)

為了解與穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因 PM19-A1在我國(guó)小麥品種資源中的分布及其分子標(biāo)記PM19-A1的有效性，并篩選抗穗發(fā)芽等位基因組合，利用標(biāo)記PM19-A1對(duì)1 015份小麥品種資源(包括我國(guó)253份微核心種質(zhì)、603份全國(guó)主要麥區(qū)品種資源以及153份國(guó)外引進(jìn)材料)進(jìn)行檢測(cè)，于2015年測(cè)定其中540份材料的種子萌芽指數(shù)(GI)和田間自然降雨整穗發(fā)芽率(FS)，驗(yàn)證該基因標(biāo)記的有效性；結(jié)合 TaVp-1B的基因型，篩選 PM19-A1/TaVp-1B抗穗發(fā)芽等位基因組合；并以大白皮和六月黃(攜帶 PM19-A1a等位基因類(lèi)型)通過(guò)后熟的種子為材料，進(jìn)行高溫(38.5 ℃)、不同濃度ABA(50 μmol·L-1和125 μmol·L-1)以及GA(1 mmol·L-1)處理，分析該基因的表達(dá)特性。結(jié)果表明， PM19-A1基因存在兩種等位基因類(lèi)型( PM19-A1a和 PM19-A1b)，等位基因類(lèi)型為 PM19-A1a的材料，其平均GI和FS均顯著低于等位基因類(lèi)型為 PM19-A1b的材料，為抗穗發(fā)芽等位類(lèi)型； PM19-A1a在我國(guó)微核心種質(zhì)、全國(guó)主要麥區(qū)品種資源和國(guó)外引進(jìn)材料中的分布頻率分別是17.4%、7.7%和31.8%；篩選出抗穗發(fā)芽等位基因組合 PM19-A1a/TaVp-1Bc；高溫和ABA處理均能誘導(dǎo) PM19-A1基因表達(dá)上調(diào)，GA處理則抑制其表達(dá)上調(diào)；不同抗穗發(fā)芽品種中 PM19-A1基因?qū)BA(P<0.01)以及GA(P<0.05)的敏感性反應(yīng)存在顯著差異。

小麥；收獲前穗發(fā)芽；種子休眠； PM19-A1； TaVp-1B

小麥籽粒臨近收獲時(shí)田間遭遇降雨或雨后長(zhǎng)時(shí)間高濕天氣容易發(fā)生穗發(fā)芽現(xiàn)象[1]。小麥穗發(fā)芽屬于一種世界性自然災(zāi)害，嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)，如美國(guó)、加拿大、澳大利亞等以小麥種植為主的國(guó)家均遭受穗發(fā)芽危害[2]。在我國(guó)，長(zhǎng)江中下游、西南冬麥區(qū)和東北春麥區(qū)是收獲季節(jié)易降雨的地區(qū)，也是穗發(fā)芽危害頻繁地區(qū)，黃淮和北部冬麥區(qū)也時(shí)有發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計(jì)，受穗發(fā)芽危害的麥區(qū)約占全國(guó)小麥總面積的83%[3]。

研究表明，種子休眠性是穗發(fā)芽抗性的主要遺傳因素，其他因素如穗部形態(tài)(穗子疏密和大小、彎曲程度和蠟質(zhì)等)、籽粒性狀(種皮色澤、種皮厚度和籽粒吸水速率等)、以及穎殼內(nèi)發(fā)芽抑制物質(zhì)等對(duì)穗發(fā)芽抗性起修飾作用[4]。植物激素(主要為ABA和GA)和溫度是影響種子休眠形成的主要因素。ABA抑制種子萌芽，誘導(dǎo)種子休眠，GA則打破種子休眠，促進(jìn)萌芽。此外，種子休眠的誘導(dǎo)不僅依賴(lài)于ABA的水平，而且還決定于種子/離體胚對(duì)ABA的敏感性[5]。籽粒發(fā)育期間，尤其是發(fā)育后期的高溫(26 ℃以上)不利于種子深休眠的形成，低溫(15 ℃以下)則有利于種子深休眠的形成[6]。成熟收獲的種子在浸潤(rùn)期間，高溫(35 ℃、4 h)抑制其萌發(fā)，而低溫(15 ℃以下)則可以增加吸漲種子的萌發(fā)能力，提高萌芽率[7]。隨著全球氣溫的升高，使得小麥籽粒發(fā)育中后期的溫度偏高，造成種子休眠/穗發(fā)芽抗性水平下降，加大了小麥?zhǔn)斋@前穗發(fā)芽的潛在風(fēng)險(xiǎn)。鑒定種子休眠性相關(guān)基因，開(kāi)發(fā)功能標(biāo)記，將有助于加快抗穗發(fā)芽小麥新品種的培育進(jìn)程。

目前，已鑒定的與小麥種子休眠/穗發(fā)芽抗性相關(guān)的基因主要有 TaVp-1[8]、 Tamyb10-1[9]、TaMFT[10]、TaSdr[11]、TaDFR[12]和 PM19-A1[13]。其中， PM19-A1基因所在的4AL染色體區(qū)域最初由Mares等[14-16]在澳大利亞白皮抗穗發(fā)芽品種Halberd以及南非白皮抗穗發(fā)芽地方品種AUS1408和SW95-50213中初步定位，隨后被不同學(xué)者共同驗(yàn)證[17-19]，且靠近該區(qū)域的分子標(biāo)記(Xbarc170、DuPw004、Xwmc650和gpw2279)在穗發(fā)芽抗性育種中的有效性也被Hickey等[20]和Singh等[21]所證實(shí)。2015年，Barrero等[13]利用多親本高代自交群體衍生的多重近等基因系，結(jié)合RNA測(cè)序克隆了位于該區(qū)域的抗穗發(fā)芽候選基因 PM19-A1，并開(kāi)發(fā)了功能標(biāo)記，該基因存在兩種等位變異類(lèi)型，即117 bp和99 bp擴(kuò)增片段，前者與種子的強(qiáng)休眠性相關(guān)，后者與種子的弱休眠性相關(guān)。

PM19基因編碼一種質(zhì)膜類(lèi)蛋白，早在2002年，Ranford等[22]在大麥中就克隆了該基因，并證明該基因參與大麥胚的發(fā)育以及胚休眠的形成與維持過(guò)程，即 PM19基因在大麥胚發(fā)育的中后期特異性表達(dá)，在休眠胚中其表達(dá)水平較高，伴隨胚的萌發(fā)，其表達(dá)水平顯著下降；此外，該基因表達(dá)受植物激素ABA、氯化鈉以及山梨醇所誘導(dǎo)。李永春等[23]利用RACE技術(shù)從綜合抗逆性強(qiáng)的小麥品種洛旱2號(hào)中克隆了 TaPM19-1基因，該基因同樣僅在發(fā)育中后期的種子中表達(dá)，在根系和葉片中其表達(dá)也受植物激素 ABA、干旱、高鹽以及高溫所誘導(dǎo)。

相對(duì)于目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記來(lái)說(shuō)，利用基因本身開(kāi)發(fā)的功能標(biāo)記進(jìn)行育種輔助選擇無(wú)疑更準(zhǔn)確高效。目前我國(guó)小麥品種資源中 PM19-A1基因的分布情況，及其與 TaVp-1B不同等位類(lèi)型組合對(duì)穗發(fā)芽抗性的影響還不清楚。本試驗(yàn)利用Barrero等[13]報(bào)道的 PM19-A1基因標(biāo)記，檢測(cè)我國(guó)253份小麥微核心種質(zhì)、全國(guó)主要麥區(qū)608份品種資源以及154份國(guó)外引進(jìn)材料；結(jié)合其中部分供試材料的穗發(fā)芽抗性表型，分析其與 TaVp-1B基因不同等位類(lèi)型組合的分布情況，及其與穗發(fā)芽抗性的關(guān)系；并利用定量RT-PCR技術(shù)分析小麥種子中該基因?qū)τ诩に?ABA和GA)和高溫的敏感性反應(yīng)。本研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步深入理解小麥種子休眠/穗發(fā)芽抗性的分子調(diào)控機(jī)理，同時(shí)可以為小麥抗穗發(fā)芽分子聚合育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及其種植

用于 PM19-A1基因分子檢測(cè)的材料共計(jì)1 015份，包括253份中國(guó)小麥微核心種質(zhì)資源、608份全國(guó)主要麥區(qū)品種資源以及154份國(guó)外引進(jìn)材料。選取上述608份品種資源中親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)且穗發(fā)芽抗性不同的287份材料(Population 1, 簡(jiǎn)稱(chēng)Pop1)以及253份中國(guó)小麥微核心種質(zhì)(Population 2, 簡(jiǎn)稱(chēng)Pop2)用于分析 PM19-A1基因與穗發(fā)芽抗性的關(guān)系以及篩選抗穗發(fā)芽等位基因組合。選取穗發(fā)芽抗性強(qiáng)、等位基因類(lèi)型為 PM19-A1a的小麥地方品種六月黃和大白皮用于分析 PM19-A1基因?qū)τ贏BA、GA和高溫的敏感性反應(yīng)。

608份全國(guó)主要麥區(qū)品種資源材料中，205份來(lái)自黃淮海冬麥區(qū)，185份來(lái)自北方冬麥區(qū)，78份來(lái)自長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)，62份來(lái)自西南冬麥區(qū)，31份來(lái)自西北春麥區(qū)，30份來(lái)自東北春麥區(qū)，15份來(lái)自新疆冬春麥區(qū)，2份來(lái)自北方春麥區(qū)。154份國(guó)外引進(jìn)材料中，15份來(lái)自阿根廷，12份來(lái)自澳大利亞，6份來(lái)自加拿大，41份來(lái)自法國(guó)，10份來(lái)自德國(guó)，4份來(lái)自匈牙利，8份來(lái)自日本，5份來(lái)自墨西哥，18份來(lái)自挪威，9份來(lái)自羅馬尼亞，8份來(lái)自俄羅斯，4份來(lái)自土耳其，11份來(lái)自美國(guó)，2份來(lái)自意大利，1份來(lái)自英國(guó)。608份全國(guó)主要麥區(qū)品種資源中的321份材料以及154份國(guó)外引進(jìn)材料由中國(guó)農(nóng)科院作科所夏先春研究員提供，其余287份材料由本課題組收集。253份小麥微核心種質(zhì)由中國(guó)農(nóng)科院作物所賈繼增研究員提供。

上述Pop1和Pop2試驗(yàn)材料于2014-2015年度種植于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)合肥大楊店試驗(yàn)基地，每份材料種植2行，每行40粒，行長(zhǎng)2 m，行寬20 cm，采用常規(guī)大田管理。

1.2 穗發(fā)芽抗性表型測(cè)定

采用種子萌芽指數(shù)(germination index, GI)以及田間自然降雨整穗發(fā)芽率(field sprouting, FS)來(lái)綜合評(píng)價(jià)小麥穗發(fā)芽抗性。室內(nèi)種子GI測(cè)定參照張海萍等[24]的方法；2015年小麥?zhǔn)斋@期間遭遇陰雨天氣，田間自然降雨整穗發(fā)芽率(FS)測(cè)定參考朱玉磊等[25]的方法。

1.3 PM19-A1基因和 TaVp-1B基因的分子檢測(cè)

PM19-A1基因的PCR擴(kuò)增體系為10 μL，包括2.0 μL模板DNA (50～60 ng·μL-1)、1.0 μL 10×Buffer (含有2.0 mmol·L-1Mg2+)、0.8 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs、0.11 μL 5 U·μL-1TaqDNA聚合酶、10 μmol·L-1引物各0.4 μL和5.29 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。引物序列為：

TaPM19-A1-5F: 5′-GAAACAGCTACCGT GTAAAGC-3′; TaPM19-A1-5R:5′-TGGTGAA GTGGAGTGTAGTGG-3′。

TaVp-1B基因的PCR擴(kuò)增體系為10 μL，包括2.0 μL模板DNA (50～60 ng·μL-1)、1.0 μL 10×Buffer (含有2.0 mmol·L-1Mg2+)、0.8 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs、0.1 μL 5 U·μL-1TaqDNA聚合酶、10 μmol·L-1引物各0.4 μL和5.3 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。引物序列為：

TaVp-1B3-F:5′-TGCTCCTTTCCCAATTG G-3′；TaVp-1B3-R：5′-ACCCTCCTGCAGCTCA TTG-3′。

用于擴(kuò)增 PM19-A1基因和 TaVp-1B基因的引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均采用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 PM19-A1基因的表達(dá)分析

將攜帶 PM19-A1a等位基因類(lèi)型的材料六月黃和大白皮的種子通過(guò)后熟，以水處理為對(duì)照(CK)，同時(shí)進(jìn)行不同濃度ABA(50 μmol·L-1和125 μmol·L-1)以及高溫(38.5 ℃)處理，然后對(duì)125 μmol·L-1ABA處理后仍未萌動(dòng)種子進(jìn)行GA(1 mmol·L-1)處理，分析 PM19-A1基因在不同濃度ABA、高溫以及GA處理后的表達(dá)水平的變化。人工氣候培養(yǎng)箱參數(shù)為20 ℃恒溫，14 h光照，濕度80%(高溫38.5 ℃處理除外)。當(dāng)水處理18 h的所有種子均出現(xiàn)萌動(dòng)(以胚部破裂露白為準(zhǔn))，高溫和125 μmol·L-1ABA處理的所有種子未出現(xiàn)萌動(dòng)，而50 μmol·L-1ABA 處理的種子中大部分出現(xiàn)萌動(dòng)時(shí)進(jìn)行第一次取樣，繼續(xù)對(duì)125 μmol·L-1ABA處理的種子進(jìn)行GA處理，待所有種子出現(xiàn)萌動(dòng)時(shí)進(jìn)行第二次取樣。取樣樣品用液氮速凍后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取采用TRIzol試劑盒，利用NanoVue plus儀器測(cè)定RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于TransGen，其他試劑均購(gòu)于北京全式金公司。QPCR體系為50 μL，包括25 μL 2×GoTaqqPCR Master Mix、2 μL Forward Primer (10 μmol·L-1)、2 μL Reverse Primer (10 μmol·L-1)、2 μL模板cDNA和9 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)。內(nèi)參為GAPDH基因。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量[26]。所用引物序列如下：

Ta-PM19-F:5′-CATGTACTAGTGCACGG ATG-3′, Ta-PM19-R: 5′-CTGCGCTAGTTTC ACTACAC-3′; Ta-GAPDH-1F: 5′-TTAGACT TGCGAAGCCAGCA-3′，Ta-GAPDH-1R:5′-A AATGCCCTTGAGGTTTCCC-3′。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，相關(guān)性分析采用Pearson模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 GI和FS表型統(tǒng)計(jì)及兩者的相關(guān)性

在Pop1中，GI平均值為0.55，變化范圍為0.01～0.98，變異系數(shù)為0.57；FS平均值為0.28，變化范圍為0～0.96，變異系數(shù)為0.29。在Pop2中，GI平均值為0.32，變化范圍為0～0.99，變異系數(shù)為0.32；FS平均值為0.10，變化范圍為0～0.82，變異系數(shù)為0.13。相關(guān)性分析表明，GI和FS在Pop1和Pop2中均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為0.531和0.686(表1)。說(shuō)明種子休眠性是影響整穗發(fā)芽抗性的主要因素，但穗子形態(tài)以及穎殼等種子以外的其他因素對(duì)整穗發(fā)芽抗性的作用也不容忽視，采用GI和FS能夠全面準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)小麥穗發(fā)芽抗性。

表1 GI和FS表型在Pop1和Pop2兩類(lèi)群體中的統(tǒng)計(jì)描述以及兩者相關(guān)性

**：P<0.01.

2.2 PM19-A1基因的分子檢測(cè)及其分布頻率

PM19-A1基因在供試材料中共擴(kuò)增到117 bp和99 bp 兩種片段類(lèi)型，即存在2種等位類(lèi)型，分別命名為 PM19-A1a和 PM19-A1b。在253份小麥微核心種質(zhì)中，44份(17.4%)攜帶 PM19-A1a，209份(82.6%)攜帶 PM19-A1b；608份全國(guó)主要麥區(qū)小麥品種資源中，47份(7.7%)攜帶 PM19-A1a，561份(92.3%)攜帶 PM19-A1b；154份國(guó)外引進(jìn)材料中，49份(31.8%)攜帶 PM19-A1a，105份(68.2%)攜帶 PM19-A1b(表2)。上述結(jié)果表明，相對(duì)國(guó)外材料，與高水平種子休眠相關(guān)的 PM19-A1a類(lèi)型在我國(guó)小麥品種資源中分布頻率相對(duì)較低，尤其在我國(guó)現(xiàn)代品種中更低。

2.3 PM19-A1與 TaVp-1B基因不同等位類(lèi)型組合與穗發(fā)芽抗性的關(guān)系

TaVp-1B基因在Pop1和Pop2群體中共存在4種等位類(lèi)型，分別為 TaVp-1Ba、 TaVp-1Bb、 TaVp-1Bc和 TaVp-1Bd。在Pop1中， PM19-A1與 TaVp-1B共存在5種組合類(lèi)型， PM19-A1b/TaVp-1Bc分布頻率最高， PM19-A1a/TaVp-1Ba分布頻率最低；在Pop2中， PM19-A1與 TaVp-1B共存在8種組合類(lèi)型， PM19-A1b/TaVp-1Ba分布頻率最高， PM19-A1a/TaVp-1Bb分布頻率最低(表2)。

進(jìn)一步對(duì) PM19-A1不同等位類(lèi)型及其與 TaVp-1B 不同等位類(lèi)型組合平均GI和FS進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果(表2)表明， PM19-A1a在Pop1和Pop2中的平均GI(0.39和0.37)和平均FS(0.24和0.08)均顯著低于 PM19-A1b(P<0.05)，說(shuō)明等位基因類(lèi)型 PM19-A1a與抗穗發(fā)芽相關(guān)，驗(yàn)證了Barrero等[13]的結(jié)果； PM19-A1a/TaVp-1Bc在Pop1和Pop2群體中平均GI(0.38和0.28)和平均FS(0.19和0.08)均顯著低于其他組合(P<0.05)，屬于抗穗發(fā)芽等位基因組合類(lèi)型，攜帶該組合的材料見(jiàn)表3；此外， PM19-A1a/TaVp-1Bd平均GI(0.31)和平均FS(0.03)均表現(xiàn)較低，因其僅存在于Pop2中，且分布頻率較低，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

表2 Pop1和Pop2群體中 PM19-A1及其與 TaVp-1B基因不同等位類(lèi)型組合的描述統(tǒng)計(jì)以及差異顯著性分析

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示同一群體中不同類(lèi)型材料間差異顯著(P<0.05)。

Different letters following dates mean significant difference among different types of materials in a population at 0.05 level.

表3 攜帶 PM19-A1a/TaVp-1Bc抗穗發(fā)芽等位類(lèi)型組合的品種名稱(chēng)、GI和FS表型值

2.4 PM19-A1基因的表達(dá)特性

利用定量RT-PCR分析 PM19-A1基因?qū)τ诩に谹BA和GA以及高溫的敏感性反應(yīng)，結(jié)果顯示，以水處理為對(duì)照，高溫(38.5 ℃)處理大白皮和六月黃浸潤(rùn)種子， PM19-A1基因的表達(dá)水平均明顯升高；經(jīng)50 μmol·L-1和125 μmol·L-1ABA處理后，大白皮中 PM19-A1基因的表達(dá)水平明顯提高，而六月黃中的表達(dá)水平變化不明顯?？傮w上， PM19-A1基因經(jīng)高濃度ABA處理后表達(dá)水平明顯較低濃度ABA處理提高。繼續(xù)對(duì)高濃度ABA處理后未萌動(dòng)的種子用GA(1 mmol·L-1)處理，大白皮中 PM19-A1基因的表達(dá)水平明顯降低，而六月黃中變化不明顯(圖1)。上述結(jié)果表明，高溫和ABA均能誘導(dǎo) PM19-A1基因表達(dá)上調(diào)，而GA抑制其表達(dá)，導(dǎo)致表達(dá)下調(diào)，不同抗性品種中該基因?qū)BA(P<0.01)以及GA(P<0.05)的敏感性反應(yīng)存在顯著差異，但對(duì)高溫的敏感性反應(yīng)差異不顯著。

*和**分別表示兩品種間差異在0.05和0.01水平上顯著。

* and ** represent significant difference between Liuyuehuang and Dapaipi at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

圖1 大白皮和六月黃后熟種子浸潤(rùn)期間經(jīng)ABA、GA和高溫處理后 PM19-A1基因的表達(dá)變化

Fig.1 Expression changes of PM19-A1 gene treated with ABA, GA and high temperature during seeds incubation of Dabaipi and Liuyuehuang

3 討 論

小麥4AL染色體上的種子休眠主效QTL被不同學(xué)者重復(fù)鑒定，臨近分子標(biāo)記在穗發(fā)芽抗性育種輔助選擇中的有效性也被進(jìn)一步驗(yàn)證[20-21]。Barrero等[13]克隆出該區(qū)段的候選基因 PM19-A1/A2，認(rèn)為117 bp擴(kuò)增片段(對(duì)應(yīng) PM19-A1a等位類(lèi)型)與抗穗發(fā)芽相關(guān)，99 bp擴(kuò)增片段(對(duì)應(yīng) PM19-A1b等位類(lèi)型)與感穗發(fā)芽相關(guān)。本文利用該基因標(biāo)記檢測(cè)了我國(guó)微核心種質(zhì)以及全國(guó)主要麥區(qū)的小麥品種資源，并結(jié)合GI和FS表型數(shù)據(jù)，進(jìn)一步驗(yàn)證了 PM19-A1a等位類(lèi)型與抗穗發(fā)芽的關(guān)系，但其在我國(guó)小麥品種資源中的分布頻率較低，尤其在現(xiàn)代品種中分布更低，這也可能是近年來(lái)我國(guó)小麥生產(chǎn)上穗發(fā)芽抗性偏低的原因之一。

TaVp-1B基因是參與調(diào)控小麥種子休眠形成的重要轉(zhuǎn)錄因子，存在多種等位變異類(lèi)型，其中 TaVp-1Ba屬于感穗發(fā)芽類(lèi)型， TaVp-1Bb和 TaVp-1Bc屬于抗穗發(fā)芽類(lèi)型， TaVp-1Bd與穗發(fā)芽抗性的關(guān)系還不清楚[27-28]。本文利用兩類(lèi)群體分析了 PM19-A1和 TaVp-1B基因不同組合類(lèi)型與穗發(fā)芽抗性的關(guān)系，篩選出抗穗發(fā)芽等位基因組合類(lèi)型 PM19-A1a/TaVp-1Bc，且該組合中的兩種等位基因先前已分別被報(bào)道為抗穗發(fā)芽類(lèi)型，更提高了本文篩選的抗穗發(fā)芽等位基因組合的可靠性。然而， PM19-A1a/TaVp-1Bb同樣屬于兩種抗穗發(fā)芽等位基因的組合，但其平均GI和平均FS均較高，說(shuō)明簡(jiǎn)單的抗穗發(fā)芽等位基因的聚合可能并不一定能得到理想中的優(yōu)異性狀，基因間的互作及其與環(huán)境的互作對(duì)于性狀的表現(xiàn)影響較大。此外， PM19-A1a/TaVp-1Bd組合的平均GI和平均FS均表現(xiàn)較低，可能屬于抗穗發(fā)芽類(lèi)型，然而該組合分布頻率較低，且 TaVp-1Bd與穗發(fā)芽抗性的關(guān)系先前未有相關(guān)報(bào)道，所以還需要更多材料和多年數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證。

據(jù)資料報(bào)道，植物激素ABA和GA以及溫度對(duì)于種子休眠性的影響涉及到相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平上的變化。如Nakamura等[29]將攜帶3AS上抗穗發(fā)芽基因TaMFT的深休眠小麥品種Norin61(N61)在種子發(fā)育期間分別置于不同溫度條件下(13 ℃和25 ℃)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，13 ℃時(shí)TaMFT基因的表達(dá)量比25 ℃高約4倍，N61的休眠性顯著增強(qiáng)，種子發(fā)芽率幾乎為0；將TaMFT基因?qū)氩怀墒斓碾x體胚瞬時(shí)表達(dá)可抑制其早熟發(fā)芽，說(shuō)明種子發(fā)育期間的低溫通過(guò)誘導(dǎo)TaMFT基因的表達(dá)來(lái)最終增強(qiáng)種子休眠水平。Lei等[30]對(duì)抗穗發(fā)芽品種2174進(jìn)行種子萌發(fā)期間低溫(4 ℃)、常溫(25 ℃)以及高溫(37 ℃)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高溫下TaMFT基因表達(dá)水平較常溫下顯著提高，而低溫下表達(dá)水平下降，說(shuō)明種子萌發(fā)期間的高溫誘導(dǎo)TaMFT基因的表達(dá)，低溫抑制其表達(dá)，這種趨勢(shì)與高溫誘導(dǎo)種子休眠、低溫促進(jìn)種子萌芽的趨勢(shì)相吻合。Barrero等[13]分析了 PM19-A1基因在種子發(fā)育期間(花后15、25、35和45 d)的表達(dá)特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伴隨籽粒成熟以及休眠的獲得， PM19-A1基因的表達(dá)水平增加；種子發(fā)育期間的高溫抑制 PM19-A1基因表達(dá)，導(dǎo)致種子休眠水平下降；利用100 μmol·L-1ABA處理后，發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)受ABA誘導(dǎo)。本文利用兩個(gè)攜帶 PM19-A1a基因的載體材料大白皮和六月黃的后熟種子，分析了該基因在種子浸潤(rùn)期間經(jīng)高溫以及不同濃度的ABA和GA處理后的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高溫和ABA同樣誘導(dǎo)該基因上調(diào)表達(dá)，而GA則抑制其表達(dá)上調(diào)，高濃度ABA較低濃度ABA效果更明顯；且不同抗性材料中 PM19-A1a基因?qū)τ贏BA以及GA的敏感性反應(yīng)存在顯著差異，大白皮中 PM19-A1a基因?qū)BA以及GA的敏感性顯著強(qiáng)于六月黃，但對(duì)高溫的敏感性反應(yīng)差異不顯著。該結(jié)果不僅驗(yàn)證了 PM19-A1a基因是種子休眠的正調(diào)控因子這一觀(guān)點(diǎn)；同時(shí)也可以看出，同屬于編碼質(zhì)膜蛋白類(lèi)的抗穗發(fā)芽相關(guān)基因TaMFT與 PM19-A1對(duì)于植物激素(ABA和GA)和溫度的反應(yīng)特性較相似，說(shuō)明溫度以及ABA對(duì)于種子休眠性的影響可能具有部分相似的調(diào)控機(jī)理。

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Detection and Validation of Molecular Marker PM19-A1 Associated With Pre-harvest Sprouting Resistance in 1 015 Wheat Varieties

CAO Xuelian, ZHANG Heng, JIANG Hao, WU Zengyun, CAO Jiajia, ZHU Yulei,WANG Shengxing, CHANG Cheng, ZHANG Haiping, MA Chuanxi

(College of Agronomy, Anhui Agricultural University/Key Laboratory of Wheat Biology and Genetic Improvement on Southern Yellow & Huai River Valley,Ministry of Agriculture,Hefei,Anhui 230036, China)

To investigate the distribution of PM19-A1 gene associated with pre-harvest sprouting resistance in wheat germplasm resources and select excellent allele combination conferring pre-harvest sprouting resistance,1 015 wheat varieties, including 253 Chinese mini-core collections, 608 wheat varieties from major wheat regions, and 154 foreign varieties, were detected by using molecular marker PM19-A1.Seed germination index (GI) and field sprouting (FS) were tested in 540 of the 1 015 wheat varieties to validate the effectiveness of molecular marker PM19-A1 in 2015.Combined with TaVp-1B genotypes, the excellent allele combination associated with PHS resistance was selected. To investigate sensitive response of PM19-A1 gene to plant hormone ABA,GA,and high temperature, after-ripened seeds collected from wheat landraces Dahuangpi and Liuyuehuang carrying PM19-A1a allele were treated with high temperature (38.5 ℃), ABA (50 μmol·L-1and 125 μmol·L-1), and GA (1 mmol·L-1). The results showed that PM19-A1 gene contains two allelic variations ( PM19-A1a and PM19-A1b), and the average GI and FS of the varieties carrying PM19-A1a allele, associated with PHS resistance, were significantly lower than those of the varieties carrying PM19-A1b (P<0.05). The distribution frequency of PM19-A1a was 17.4%,7.7% and 31.8% in Chinese mini-core collections, wheat varieties from major wheat regions, and foreign varieties, respectively. The allelic variation combination PM19-A1a/TaVp-1Bc was significantly associated with PHS resistance. The expression level of PM19-A1 gene was significantly up-regulated by ABA and high temperature, but down-regulated by GA. The sensitive response of PM19-A1 gene to ABA (P<0.01) and GA (P<0.05) was significant in diverse wheat varieties with different levels of PHS resistance.

Wheat; Pre-harvest sprouting; Seed dormancy; PM19-A1; TaVp-1B

時(shí)間：2016-10-08

2016-03-20

2016-09-18

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(CARS-3-1)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科技專(zhuān)項(xiàng)(201203033-04)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31401372)；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1408085MC60)；安徽省小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(AHCYTX-02)

E-mail：294514864@qq.com

張海萍(E-mail: zhhp20@163.com)

S512.1；S332.2

A

1009-1041(2016)10-1283-08

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