龔燕川，陳影，唐杰，彭衛(wèi)紅，鄧靜

（1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川成都610066；3.四川旅游學(xué)院，四川成都610600）

〈育種與馴化〉

梯棱羊肚菌M83和M101菌株培養(yǎng)特性差異*

龔燕川1，2，陳影2，唐杰2，彭衛(wèi)紅2，鄧靜3**

（1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川成都610066；3.四川旅游學(xué)院，四川成都610600）

以可正常出菇的梯棱羊肚菌M83和不能正常出菇的梯棱羊肚菌M101作為供試菌株，對2種菌株在不同的溫度、pH、光照、碳源、氮源上的菌絲生長速度、長勢及菌核生長情況等進(jìn)行分析和比較。結(jié)果表明，2種菌株菌絲的最適生長溫度為15℃～25℃，但M83菌絲在5℃～30℃能正常生長，而M101菌絲在30℃不能正常生長；2種供試菌株菌絲生長最適pH為7～8，M83的生長速度明顯快于M101；2種菌株菌絲在黑暗條件下的生長速度、長勢均優(yōu)于光暗交替條件；2種菌株可利用多種碳源和氮源，但M83對麥芽糖和可溶性淀粉的利用能力顯著強(qiáng)于M101；2種菌株菌絲生長最適氮源為蛋白胨，對硝態(tài)氮的利用能力均強(qiáng)于對銨態(tài)氮的利用。

梯棱羊肚菌；出菇性能；菌絲；培養(yǎng)特性

羊肚菌（Morchella spp.）是羊肚菌屬物種的總稱，是著名食藥兼用真菌，富含蛋白質(zhì)、多糖、維生素、碳水化合物和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，具有提高免疫力[1]、抗氧化[2]、保護(hù)胃黏膜[3]、降血脂[4]和抗衰老[5]等功效，被廣泛地應(yīng)用于保健品、醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)。

依靠野生采集羊肚菌已經(jīng)無法滿足人們的食藥需求，開展羊肚菌馴化栽培研究已成為各方關(guān)注的熱點(diǎn)。梯棱羊肚菌（Morchella importuna）是當(dāng)前馴化栽培中廣泛使用的種類[6]，人工栽培已取得了重大進(jìn)展，但對其菌絲體培養(yǎng)特性的研究未見報道。為了明確梯棱羊肚菌的培養(yǎng)特性，分析了不同出菇性能的羊肚菌在菌絲體培養(yǎng)階段的差異，以期為羊肚菌菌種生產(chǎn)等提供信息。

1　材料與方法

1.1供試材料

1.1.1供試菌株及來源

經(jīng)過2年的出菇栽培試驗(yàn)驗(yàn)證，選擇具有不同出菇性能的梯棱羊肚菌菌株M83和M101進(jìn)行試驗(yàn)，菌株來源及出菇性能見表1。

表1　供試菌株及來源Tab.1Test strains and sources in this paper

1.1.2培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基Ⅰ：蔗糖20 g、蛋白胨2 g、瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基Ⅱ：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2方法

1.2.1菌種準(zhǔn)備

制備、分裝PDA培養(yǎng)基，121℃下滅菌30 min，制作平板。無菌條件下鉤取供試菌株菌絲塊，接種在平板中央，20℃避光培養(yǎng)3 d～4 d，備用。

1.2.2不同溫度對菌絲生長的影響

用7 mm滅菌打孔器取相同菌齡的供試菌株接種塊，接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，分別置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，每個處理3次重復(fù)。采用十字交叉刻度法，24 h刻度一次，測定菌絲生長速度。同時觀察記錄菌絲長勢和菌核形成、生長情況。菌絲平均生長速度（v，mm·d-1）的計算公式為：

式中：D表示菌落直徑（mm）；d表示培養(yǎng)天數(shù)。

1.2.3不同pH對菌絲生長的影響

用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH分別調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基Ⅰ的pH至5、6、7、8、9、10，制作平板。用7 mm滅菌打孔器取相同菌齡的供試菌株接種塊，接種于不同pH的平板培養(yǎng)基中央，每個處理3次重復(fù)，20℃避光培養(yǎng)。測定菌絲生長速度，觀察記錄菌絲長勢和菌核形成、生長情況。其余同1.2.2。

1.2.4不同光照條件對菌絲生長的影響

用7 mm滅菌打孔器取相同菌齡的供試菌株接種塊，接種于PDA培養(yǎng)基中央，分別置于黑暗條件、12 h黑暗12 h光照（光暗交替）條件，每個處理3次重復(fù)，20℃避光培養(yǎng)。測定菌絲生長速度，觀察記錄菌絲長勢和菌核形成、生長情況。其余同1.2.2。

1.2.5不同碳源對菌絲生長的影響

分別用等量甘露糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油、甘露醇代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基Ⅱ中的葡萄糖，制作平板培養(yǎng)基，用7 mm滅菌打孔器取相同菌齡的供試菌株接種塊，接種于平板培養(yǎng)基中央，每個處理3次重復(fù)，20℃避光培養(yǎng)。測定菌絲生長速度，觀察記錄菌絲長勢和菌核形成、生長情況。其余同1.2.2。

1.2.6不同氮源對菌絲生長的影響

分別用等量的蛋白胨、尿素、硝酸鉀、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、硝酸鈣代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基Ⅱ中的蛋白胨制作平板培養(yǎng)基，用7 mm滅菌打孔器取相同菌齡的供試菌株接種塊接種于培養(yǎng)基中央，每個處理3次重復(fù)，20℃避光培養(yǎng)。測定菌絲生長速度，觀察記錄菌絲長勢和菌核形成、生長情況。其余同1.2.2。

2　結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)溫度對菌絲生長的影響

在PDA培養(yǎng)基上，供試菌株菌絲生長速度隨著溫度升高加快，在25℃時菌絲生長速度最快，之后，隨著溫度的升高，菌絲生長速度變慢，見圖1。

由圖1可見，菌絲長勢與溫度密切相關(guān)，20℃～25℃下，菌絲生長濃密粗壯，分枝較多，長勢較好。不同出菇性能的菌株，菌絲長勢有較大的差異。在30℃下，M101菌絲3 d后停止生長，分泌色素；M83菌絲生長較好，分枝較多，氣生菌絲旺盛，培養(yǎng)到第5天時，菌絲開始分泌色素?？傮w上，M83菌絲長勢強(qiáng)于M101。不同溫度對M83和M101菌絲長勢的影響見表2。

由表2可見，在20℃和25℃下，供試菌株均產(chǎn)生大量集中分布白色菌核。但菌核形狀存在顯著差異，M83菌核顆粒狀，M101菌核點(diǎn)狀，較小。M83在30℃下產(chǎn)生白黃色菌核，零散分布。M101在30℃下未見菌核形成。

2.2培養(yǎng)基pH對菌絲生長的影響

培養(yǎng)基pH值對菌絲生長速度的影響見圖2。

圖1　培養(yǎng)溫度對梯棱羊肚菌菌絲生長速度的影響Fig.1Effect of temperature on the growth rate of M.importuna mycelium

表2　培養(yǎng)溫度對梯棱羊肚菌M83和M101菌絲長勢的影響Tab.2Effect of temperature on the mycelium growth vigor of M83 and M101

圖2　培養(yǎng)基pH對梯棱羊肚菌菌絲生長速度的影響Fig.2Effect of pH on the growth rate of M.importuna mycelium

隨著pH升高，供試菌株菌絲生長速度加快，當(dāng)pH為7時，生長速度達(dá)到最快，之后，隨著pH升高，菌絲生長速度下降。M83生長速度明顯快于M101。不同pH條件對M83和M101菌絲長勢的影響見表3。

表3　培養(yǎng)基pH對梯棱羊肚菌M83和M101菌絲長勢的影響Tab.3Effect of pH on the mycelium growth vigor of M83 and M101

在pH小于6時，菌絲生長稀疏纖細(xì)、分枝少，隨著pH升高，菌絲變得粗壯、分枝較多，當(dāng)pH大于9時，菌絲長勢較差。供試菌株在pH 7～8時，菌絲長勢較好。供試菌株均未見菌核形成。

2.3不同光照條件對菌絲生長的影響

不同光照條件對菌絲生長的影響見圖3。

圖3　光照條件對梯棱羊肚菌菌絲生長速度的影響Fig.3Effect of light condition on the growth rate of M.importuna mycelium

供試菌株在這兩種光照條件下均能生長，生長速度存在較明顯的差異，在黑暗條件下，生長速度比光暗交替時快。同時，M83的菌絲生長速度快于M101。在黑暗條件下，氣生菌絲生長旺盛。

2.4培養(yǎng)基碳源對菌絲生長的影響

培養(yǎng)基不同碳源對菌絲生長速度的影響見圖4。

2種菌株菌絲在7種不同碳源培養(yǎng)基上均可生長。M83在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上生長速度最快，達(dá)到16.51 mm·d-1；在甘油和可溶性淀粉培養(yǎng)基上生長速度最慢。M101在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上生長速度最快，達(dá)到16.36 mm·d-1。研究結(jié)果顯示，不能正常出菇的M101，對麥芽糖和可溶性淀粉的利用能力顯著降低。不同碳源對M83和M101菌絲長勢的影響見表4。

圖4　碳源對梯棱羊肚菌菌絲生長速度的影響Fig.4 Effect of carbon sources on the growth rate of M.importuna mycelium

表4　培養(yǎng)基碳源對梯棱羊肚菌M83和M101菌絲長勢的影響Tab.4Effect of carbon sources on the mycelium growth vigor of M83 and M101

供試菌株在葡萄糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上長勢均好，菌絲致密、粗壯，分枝多。盡管在以甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上生長速度快，但是菌絲較纖細(xì)。供試菌株在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長速度很快，但產(chǎn)生菌核時間較晚，分別在11 d和12 d；在以甘露糖、蔗糖、麥芽糖和可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上，產(chǎn)生大量集中分布的白色菌核。M101能夠在以甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上產(chǎn)生菌核，較其他碳源，菌核形態(tài)大小存在明顯差異，分散于整個菌落中；而M83在該培養(yǎng)基上未產(chǎn)菌核。在以甘油為碳源的培養(yǎng)基上，供試菌株菌絲均生長較慢。

2.5培養(yǎng)基氮源對菌絲生長的影響

不同氮源對菌絲生長速度的影響見圖5。

由圖5可見，供試菌株菌絲可利用多種氮源，在7種不同氮源培養(yǎng)基上都可以生長。供試菌株在以蛋白胨、尿素、硝酸鉀、硝酸鈣為氮源的培養(yǎng)基上菌絲長勢較好，濃密，粗壯。但在以硫酸銨、氯化銨、硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基上，菌絲纖細(xì)、稀疏，菌落邊緣不整齊，3 d后停止生長。M83和M101對不同氮源的利用有一定差異，對硝態(tài)氮的利用優(yōu)于對銨態(tài)氮的利用。不同氮源對M83和M101菌絲長勢的影響見表5。

圖5　氮源對梯棱羊肚菌菌絲生長速度的影響Fig.5Effect of nitrogen sources on the growth rate of M. importuna mycelium

表5　培養(yǎng)基氮源對梯棱羊肚菌M83和M101菌絲長勢的影響Tab.5Effect of nitrogen sources on the mycelium growth vigor of the M83 and M101

供試菌株在以蛋白胨、尿素、硝酸鈣為氮源的培養(yǎng)基上均能產(chǎn)生菌核。M83所產(chǎn)菌核均集中分布，而M101所產(chǎn)菌核僅在尿素培養(yǎng)基上集中分布。

3　討論

溫度試驗(yàn)結(jié)果表明不同出菇性能的供試菌株在菌絲體培養(yǎng)特性方面存在較大差異。M83在溫度5℃～30℃范圍均能生長，15℃～25℃條件下，菌絲長勢較好。不能出菇的M101在30℃時生長明顯弱于M83。

菌株M83、M101最適pH均為7～8，在不同pH值條件下，M83生長速度均明顯快于M101。在pH試驗(yàn)的培養(yǎng)基上未見菌核產(chǎn)生，推測Na+或者Cl-對菌絲以及菌核的生長有一定的影響，有待進(jìn)一步的研究。黑暗條件下，菌絲生長速度更快且氣生菌絲更為旺盛，光暗交替對菌絲的生長有抑制作用，這與董雪[7]和小娜[8]研究結(jié)果基本一致。

供試菌株對碳源和氮源的利用也出現(xiàn)顯著差異。結(jié)果顯示梯棱羊肚菌可利用多種碳源和氮源，在以蔗糖、甘露糖、麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上能較好生長，以蔗糖最佳；對甘油和甘露醇利用較差。菌絲在以蛋白胨、尿素、硝酸鈣培養(yǎng)基上生長較好，對有機(jī)氮源的利用率高于無機(jī)氮源，對硝態(tài)氮的利用優(yōu)于銨態(tài)氮。

菌株出菇性能受多種因素的影響，本項(xiàng)研究結(jié)果顯示，不能正常出菇的M101對麥芽糖和可溶性淀粉的利用顯著低于可正常出菇的M83。對不同碳源和氮源的利用能力在一定程度上反應(yīng)供試菌株體內(nèi)酶的分解能力，M101某些酶活的喪失，可能意味著其基因的突變，進(jìn)而影響其子實(shí)體的形成。菌株出菇能力的關(guān)鍵因素及機(jī)理，有待在后繼工作中進(jìn)一步探討。

[1]Su CA,Xu XY,Liu DY,et al.Isolation and characterization of exopolysaccharide with immunomodulatory activity from fermentation broth of Mochella conica[J].DARU Journal of Pharmaceutical Sciences,2013,21(5):1-6.

[2]Mau JL,Chang CN,Huang SJ,et al.Antioxidant properties of methanolic extracts from Grifola frondosa,Morchella esculenta and Termitomyces albuminosus mycelia[J].Food Chemistry, 2004,87(1):111-118.

[3]羅霞，魏巍，余夢瑤.尖頂羊肚菌對急性酒精性胃黏膜損傷保護(hù)作用研究[J].菌物學(xué)報，2011，30（2）：319-324.

[4]殷偉偉，張松，吳金鳳.尖頂羊肚菌活性提取物降血脂作用的研究[J].菌物學(xué)報，2009，28（6）：873-877.

[5]馬利，李霞，張松.尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對皮膚成纖維細(xì)胞增殖和衰老的影響[J].菌物學(xué)報，2014，33（2）：385-393.

[6]王波，鮮靈.人工栽培羊肚菌的鑒定[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，26（5）：1988-1991.

[7]董雪.黑脈羊肚菌生物學(xué)特性研究[D].北京：首都師范大學(xué)，2004.

[8]和小娜.秦嶺中東段地區(qū)羊肚菌的分類鑒定及生物學(xué)特性研究[D].西安：陜西師范大學(xué)，2012.

Culture Characteristics of Morchella importuna Mycelium with Different Fruiting Performance

GONG Yan-chuan1,2,CHEN Ying2,TANG Jie2,PENG Wei-hong2,DENG Jing3
(1.Institute of Biological Engineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China; 2.Soil and Fertilizer Research Institute,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China; 3.Sichuan Tourism College,Chengdu 610600,China)

The Morchella importuna M83 and M101 were used as tested strains,in which the M83 was able to develop normal fruitbody and the M101 could not.The mycelium growth rate,hyphal growth and sclerotia growth of strains were analyzed and compared at different temperature,pH,light,carbon source and nitrogen source.The results showed that the optimum mycelium growth temperature of the tested strains was 15℃～25℃,the M83 mycelium grew normally at 5℃～30℃,but the M101 grew abnormally at 30℃.The optimum pH for the tested strains was 7～8,and the mycelium growth rate of M83 was much faster than that of M101.Under dark conditions,the growth rate and vigor of the mycelium were better than that of light dark alternate. Many kinds of carbon sources and nitrogen sources were used by the tested strains,but the utilization ability of M83 on the maltose and soluble starch were stronger than that of M101.The optimum nitrogen source of the tested strains was peptone,the utilization ability of nitrate nitrogen was stronger than that of ammonium nitrogen.

Morchella importuna;fruiting performance;mycelium;culture characteristics

S646.9

A

1003-8310（2016）04-0007-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.04.003

四川省微生物資源共享平臺建設(shè)（2016TJPT0002）；四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目（2016JY0060）；四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目（2015JY0163）。

龔燕川（1991-），女，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)榘l(fā)酵代謝調(diào)控。E-mail:gongyanchuan@163.com

**通信作者：鄧靜（1970-），女，博士，教授，主要從事微生物發(fā)酵工藝及產(chǎn)品開發(fā)研究。E-mail:dj3930590@sina.com

2016-05-04