王靚靚，白會新

(1.大慶市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，黑龍江 大慶 163311；大慶市畜牧技術推廣站，黑龍江 大慶 163311)

豬流行性腹瀉病毒繁殖條件的研究

王靚靚1，白會新2*

(1.大慶市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，黑龍江 大慶 163311；大慶市畜牧技術推廣站，黑龍江 大慶 163311)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV) 引起的一種嚴重的病毒性傳染病。該病可導致哺乳仔豬發(fā)生嚴重的腹瀉、嘔吐、脫水，并且致死率極高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的危害。實驗為了提高PEDV的繁殖滴度，對PEDV的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化并連續(xù)體外傳代培養(yǎng)，分別從改變胰酶濃度、吸附時間和培養(yǎng)方式三個方面進行了PEDV的傳代培養(yǎng)，最終提高了病毒的滴度（TCID50），從而降低了該病毒的致病性。

豬流行性腹瀉病毒；疫苗；培養(yǎng)特性

PEDV是一種有包膜的單鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科，冠狀病毒屬，該病毒引起的臨床癥狀一般表現為嚴重的水樣腹瀉，病豬在腹瀉3～4 d后，會因嚴重脫水而死亡。PEDV經口傳染仔豬，在腹瀉的早期階段，它富集在小腸內的組織內容物中。隨著PEDV在許多國家的暴發(fā)，國內外很多學者始終致力于研究PEDV的培養(yǎng)條件［1］，提高病毒的滴度［2］，為PEDV的疫苗研制提供重要的物質基礎。但是，由于其復雜的培養(yǎng)條件，病毒在細胞中繁殖滴度等問題仍是急需解決的難題之一。為了解決此問題，本實驗通過改變胰酶濃度、吸附時間和培養(yǎng)條件等方面對PEDV HLJBX株進行培養(yǎng)，確立了PEDV的最佳培養(yǎng)條件，從而提高了病毒的滴度，為下一步疫苗開發(fā)奠定了一定的基礎。

1??毒株、細胞系和引物

本實驗在東北農業(yè)大學動物醫(yī)學院預防與獸醫(yī)學實驗室進行，PEDV HLJBX株由實驗室分離并保存，非洲綠猴傳代腎細胞（Vero）細胞系于實驗室保存， PEDV鑒定引物均由實驗室設計并由博仕生物公司合成。

2??實驗方法

2.1??細胞庫的建立

將Vero細胞的復蘇后，進行培養(yǎng)，待細胞庫性狀穩(wěn)定后進行無菌檢測和支原體檢測。

2.2??PEDV的特異性檢測

2.2.1 間接免疫熒光檢測

接種病毒的Vero細胞培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液，用PBS漂洗細胞標本片3次，用4%多聚甲醛溶液固定細胞，室溫20 min后用PBS漂洗3次，用甘氨酸溶液350μL/孔處理細胞，室溫10 min，再用PBS漂洗3次，將殘留液棄凈后，加入一抗，37 ℃孵育60 min，PBS洗滌3次后，再加二抗，37 ℃避光孵育60 min，最后用中性甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.2.2 RT-PCR檢測

取150μL的PEDV放入EP管中，管中加入RA2液500μL，充分顛倒10次，靜置1 min。將PEDV裂解物全部吸入內套管中，離心1 min。取出內套管，棄掉外套管中的液體，在內套管中加入500 μL洗液，離心1 min。重復一次上面的步驟后，取出內套管棄掉外套管中的液體，再將內套管放回到外套管中，不加洗液離心1 min。將內套管移入新的EP管中，在內套管膜的中央加入洗脫液25 μL，室溫靜置1 min后離心1 min，獲得總RNA。之后用PEDV引物將RNA反轉錄成cDNA，反應參數為42 ℃、1 h，72 ℃、15 min，冰上冷卻。

將反轉錄的產物使用上游引物及下游引物進行PCR擴增。反應條件為：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

反應結束后，用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

2.2.3 PEDV滴度的測定采用96孔板進行測定。首先將細胞進行消化，分裝到96孔板內，待細胞長滿80 %時，棄去DMEM液，用PBS洗3次，將病毒稀釋成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，

10-9，10-10，10個稀釋度，每一稀釋度接種5孔細胞，接種量為100 μL/孔，并設立一行作為細胞對照，在接毒后72 h，判定細胞病變，當病變細胞在80 %以上時，判定為病變細胞孔，進行TCID50的測定。按公式計算（Reed-Muech 氏法）。

2.2.4 PEDV滴度的提高

2.2.4.1 不同胰酶濃度對病毒滴度的影響

取生長良好的Vero單層細胞進行消化，分裝到24孔板中，觀察細胞，待細胞長滿80%時，棄去24孔板中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞2次，將病毒液和無血清的DMEM液混合，同時胰酶終濃度分別為1 μg/mL、2.5 μg/ mL、5 μg/ mL、10 μg/ mL、15 μg/ mL、20 μg/ mL、25 μg/mL、50 μg/ mL、60 μg/ mL和75 μg/ mL，在37 ℃培養(yǎng)箱內共同吸附1 h后加入不含血清的DMEM，同時設立細胞對照孔，37 ℃培養(yǎng)，72 h收毒，繁殖8代后，均接種在長滿Vero細胞的96孔板中進行TCID50測定。

2.2.4.2 不同吸附時間對病毒滴度的影響

取生長良好的Vero單層細胞進行消化，分裝到24孔板中，觀察細胞，待細胞長滿80 %時，棄去24孔板中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞2次，將病毒液、最適的胰酶終濃度和無血清的DMEM液按比例混合，在37 ℃培養(yǎng)箱內共同吸附0.5 h、1 h、1.5 h和2 h后加入不含血清的DMEM，同時設立細胞對照孔，37 ℃培養(yǎng)，72 h收毒，繁殖8代后，均接種在長滿Vero細胞的96孔板中進行 TCID50測定。

2.2.4.3 不同培養(yǎng)條件對病毒滴度的影響

取生長良好的Vero單層細胞進行消化，分裝到24孔板中，觀察細胞，待長滿80 %時，棄去24孔板中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞2次，將病毒液、最適的胰酶終濃度和無血清的DMEM液按比例混合，接種在Vero細胞上，在到達最適吸附時間時，一孔直接加入無血清的DMEM，一孔棄去吸附液后加入無血清的DMEM，并設立細胞對照孔，37 ℃培養(yǎng)，72 h收毒，繁殖8代后，均接種在長滿Vero細胞的96孔板中進行 TCID50測定。

3??實驗結果

3.1??Vero細胞的培養(yǎng)

待細胞長滿單層時進行傳代，接種密度是1×106/ mL，細胞狀態(tài)良好。鏡檢可見，長滿單層的細胞緊貼于細胞壁，生長致密，呈長梭形，輪廓清晰，折光性強（如圖1A）。將PEDV病毒接種在Vero細胞上，在30 h時出現明顯的CPE，有部分細胞腫脹變圓，折光性增強，顆粒物質增多（如圖1D），細胞對照未出現異常（如圖1B）。培養(yǎng)48 h，細胞間隙變大，有少量細胞脫落（如圖1E），對照細胞生長良好，仍然未見異常（如圖1C）。在72 h時，細胞脫落已達80 %以上，細胞間隙變大、皺縮、融合，細胞單層形成網眼狀，收毒（如圖1F）。

圖1 在不同時間點接種PEDV的Vero細胞產生的病變（20X）

3.2??細胞的純凈檢測結果

3.2.1 Vero細胞的細菌、霉菌檢測結果

用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G）和葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（G.P）

對Vero細胞進行檢測，未見細菌、霉菌污染。

3.2.2 Vero細胞的支原體檢測結果

用支原體培養(yǎng)基對Vero細胞進行檢測，均未見支原體污染。

3.3??PEDV的鑒定結果

3.3.1 間接免疫熒光檢測結果

取Vero細胞培養(yǎng)物接種長滿單層的Vero細胞48 h后，經 PEDVN蛋白單克隆抗體間接免疫熒光檢測，在未接種PEDV的Vero細胞中，未見到任何特異性綠色熒光斑點（圖 2A），而在感染PEDV的Vero細胞中觀察到大量特異性綠色熒光斑點（圖 2B）。表明PEDV在Vero細胞中復制增殖。

圖2 間接免疫熒光檢測 PEDV（20 X）

3.3.2 RT-PCR檢測結果

擴增產物片段約467 bp，與預期結果相一致（見圖3）。

圖3 PEDV的RT-PCR結果

3.4??PEDV滴度的測定結果

采用96孔板進行測定，在接毒后72 h，判定細胞病變，當病變細胞在80 %以上時，判定為病變細胞孔，進行TCID50的測定。按公式計算（Reed-Muech 氏法）結果見表1。

其確切稀釋倍數可按下列公式計算：

將由上式獲得的0.73加在高于50 %死亡的稀釋度的對數（3）上，因此該病毒的 TCID50應是10-3.73/0.1 mL。

3.5??PEDV滴度的提高

3.5.1 不同的胰酶濃度對滴度的影響

設立了胰酶濃度分別為1 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL和75 μg/mL這10個濃度進行PEDV的培養(yǎng)，當胰酶濃度在50 μg/mL及以上時，PEDV無法進行培養(yǎng)。達到該濃度時可以觀察到細胞拉網成堆，很難觀察出病變。

表1 TCID50測定結果

圖4 不同的胰酶濃度對病毒滴度的影響

3.5.2 不同吸附時間對滴度的影響

在培養(yǎng)PEDV毒株時，分別設立在37 ℃培養(yǎng)箱內吸附0.5 h、1 h、1.5 h和2 h后，加入無血清的DMEM溶液，72 h收毒，測定病毒滴度。

圖5 不同吸附時間對病毒滴度的影響

3.5.3 不同培養(yǎng)方式對滴度的影響

培養(yǎng)PEDV時采用2種培養(yǎng)方式進行培養(yǎng)，分別為留吸附液和棄吸附液，之后在加入維持液，72 h收毒，測定病毒滴度。

圖6 不同培養(yǎng)方式對病毒滴度的影響

4??討論

近年來，有關PEDV疫苗的研究已經取得了一定的進展［3］，疫苗滴度的高低可以直接影響到疫苗接種的效果，因此準確測定疫苗滴度十分重要。本文通過改變胰酶終濃度、孵育時間和培養(yǎng)方式，來提高病毒的滴度，最終將PEDV的滴度維持在10-6.0/0.1 mL至10-7.0/0.1 mL之間。Hofinann和Wy1er實驗表明，在培養(yǎng)PEDV時，若不加胰酶，那么PEDV感染細胞的能力會大大減弱，連續(xù)培養(yǎng)幾代后，會使病毒在細胞上發(fā)生丟失［4］。所以PEDV的繁殖是有賴于胰酶的存在的。但是很多研究學者在培養(yǎng)PEDV時，對于胰酶的終濃度的選擇都有一定的差別［5-6］。在本實驗中，對PEDV HLJBX毒株進行培養(yǎng)時，設立了胰酶終濃度為1μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL和75 μg/mL這10個濃度進行PEDV的培養(yǎng)，結果表明當胰酶濃度在50 μg/mL及以上時，PEDV無法進行培養(yǎng)。達到該濃度時可以觀察到細胞拉網成堆，很難觀察出病變。在胰酶終濃度1～25 μg/mL之間，都適合PEDV的培養(yǎng)，但是在胰酶終濃度為2.5 μg/mL時，我們測得PEDV的病毒滴度高于其他組的病毒滴度。

本實驗對不同吸附時間對病毒滴度的影響進行了研究，分別設立了0.5 h、1 h、1.5 h和2 h 4個時間點。結果表明，吸附時間為1.5 h，病毒的滴度最高，到2 h時病毒的滴度反而有所下降，但是下降不明顯。這可能是由于吸附時間過長，導致一些狀態(tài)不好的細胞貼在了培養(yǎng)瓶底部，因此影響了病毒的滴度。本實驗還研究了不同培養(yǎng)方式對病毒滴度的影響，分別采用棄吸附液和留吸附液兩種方式，結果發(fā)現采用棄吸附液的培養(yǎng)方式PEDV的病毒滴度明顯比留吸附液的培養(yǎng)方式要高。這可能是由于在吸附液中存在一些感染能力較弱的病毒，當棄去吸附液后，感染能力較弱的病毒也隨之棄去，那么感染細胞能力較強的病毒就會吸附在細胞上。如果留吸附液，對于感染能力較弱的病毒便會留在吸附液中，繁殖幾代后便失去感染細胞的能力，從而影響了病毒的滴度。

［1］ 周靚靚，孫心，吳蕾. 豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉疫苗病毒培養(yǎng)條件的優(yōu)化［J］.廣東畜牧獸醫(yī)科技，2014，39（6）：33-35.

［2］ 王琳，邢育鋼，李繼昌. 豬流行性腹瀉病毒疫苗株在Vero細胞中繁殖條件的優(yōu)化［J］.當代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2014(11)：3-4.

［3］ 王靚靚，李訓良，李鵬沖，等. 豬流行性腹瀉的診斷與預防［J］.世界華人消化雜志，2013，21（1）：33-38.

［4］ HOFMANN M，WYLER R.Propagation of the virus of PED in ce11 cu1ture［J］.J C1in Microbio1，1988，26：2235-2239.

［5］ 郝偉偉，邱文英，徐靜，等.豬流行性腹瀉病毒SZ株的分離與鑒定［J］.福建畜牧獸醫(yī)，2012，34（6）：1-3.

［6］ 毛雅元，張桂紅，葛俊偉，等.豬流行性腹瀉病毒地方株LJB/ 03分離及培養(yǎng)特性［J］.病毒學報，2010，26（6）：483-489.

2016-07-17）

黑龍江省高校科技創(chuàng)新團隊基金資助項目（2011TD001）

王靚靚（1987-），女，黑龍江哈爾濱人，獸醫(yī)師，獸醫(yī)碩士，主要從事工作：動物衛(wèi)生監(jiān)督和疫病防控。E-mail：383456366@qq.com 聯系電話：18345587338

白會新（1986-），男，黑龍江望奎人，畜牧師，博士，研究方向：分子營養(yǎng)學與免疫學。E-mail：dqxmjbhx@163.com