于紅鴿 （山東省即墨市畜牧獸醫(yī)局266100)

水貂犬瘟熱病毒RT-PCR檢測(cè)方法建立及應(yīng)用

于紅鴿 （山東省即墨市畜牧獸醫(yī)局266100)

水貂犬瘟熱病毒 (Canine distemper virus，CDV)屬于副黏病毒科 (Paramyxoviridae)麻疹病毒屬 (Morbillivirus)。形狀多種，病毒直徑大小多在150～300nm[1]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RTPCR技術(shù)檢測(cè)了水貂病料中犬瘟熱病毒的感染情況，建立具有快速、靈敏的RT-PCR檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 參考毒株

犬瘟熱CDV-3弱毒株。

1.1.2 試劑

DNAzol Regent、TRIzol LS?Reagent、RNA提取試劑盒；rTaqDNA ploymerase、 dNTPs、 AMV Reverse Transcriptase、Rnase-Inhibitor、 DNA Marker（DL2000）； Agarose 瓊脂糖；異丙醇、無(wú)水乙醇、DEPC水、氯仿、瓊脂粉等。

1.1.3 儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀 （Alpha Unit Black Assembly PCR、PTC-200）、42℃可調(diào)恒溫水浴鍋、高速離心機(jī)、微波爐、電子天平、DYY-Ⅲ-7型、DYY-Ⅲ-8B核酸電泳儀、紫外凝膠成像系統(tǒng)[2]。

1.1.4 檢測(cè)的組織病料來(lái)源及病料采集方法

某新建貂場(chǎng)飼養(yǎng)水貂1600只，其中44日齡斷奶幼貂1100只，2016年4月23日突然發(fā)病176只，死亡114只。

無(wú)菌操作剪取1.0～2.0g病料，加少量滅菌PBS(含青霉素、鏈霉素)，注意邊研磨邊加液氮，防止RNA被降解。用PBS按1∶4稀釋成懸液，-20℃反復(fù)凍融3次，4℃10000r/min離心10min，取上清，-70℃保存。

1.2 方法步驟

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中CDV-3N蛋白基因序列，用Primer軟件設(shè)計(jì)了特異性引物，擴(kuò)增引物：CDV-3-P1（5′TAGGTTAGGGCTGTGGCCTT3′）； CDV-3-P2 （5′CCGCACCTTCGGATATACTG3′）。

1.2.2 CDV的RNA提取

1.5ml離心管中加入 250μl組織液；加 TRIzol LSR Reagent750μl，顛倒 6～8 次，4℃靜止 5min； 加 200μl氯仿充分震蕩，在4℃冰箱，靜止10min；4℃離心12000轉(zhuǎn)15min；取上清液500μl，轉(zhuǎn)入新EP管，加等量的異丙醇，顛倒6～8次 （-70℃冰箱中靜置45min），充分沉淀核酸；4℃離心12000轉(zhuǎn)15min，棄上清液；加入75%冷乙醇 （DEPC配置）1000μl，離心5min，棄上清液，干燥核酸；加20μlDEPC水溶解-20℃保存，備用。

1.2.3 CDV RNA的反轉(zhuǎn)錄

CDV反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) (RT-PCR)總體積為 20μl：5×Buffer4μl，M-MLV(反轉(zhuǎn)錄酶)0.5μl，RNase inhibitor 0.5μl，RT 引物 1μl，2.5mM dNTP2.5μl，DEPC 滅菌水 8.5μl，病毒RNA模板3μl，混勻42℃水浴1h，70℃5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。得到cDNA模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 CDV PCR的反應(yīng)條件的優(yōu)化及體系的建立

最適模板量確定：分別以2、3、4、5、6、7和8μl反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察，保持其他試劑濃度及反應(yīng)條件不變，確立最佳模板濃度。最適引物濃度確定：在PCR反應(yīng)體系中分別加入上、下游引物（20μmol/μl） 0.1、 0.3、 0.5、 0.7、 1.0μl，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物觀察，確立最佳引物濃度。最佳退火溫度確定：分別以47、49、51、53、55和 57℃退火溫度進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的觀察，確立最佳退火溫度。CDV最佳反應(yīng)體系：總體積25μl，10×Buffer2.5μl，dNTP Mixture(2.5mmol/L)2μl，P1+P2 0.5μl+0.5μl，Taq0.5μl，滅菌雙蒸水 17μl，DNA 模板 2μl。 最佳擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 5min，94℃變性 30s，51℃退火 40s，72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10min。

在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，51℃退火40s，72℃延伸2min，循環(huán)數(shù)30次；72℃終延伸10min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳：用TAE緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠，瓊脂糖加熱溶化后加入溴化乙錠 （EB，10mg/ml）至終濃度0.5μg/μl，混勻，制成電泳凝膠板待用。取3μl擴(kuò)增產(chǎn)物加3μl6×Loading Buffer（上樣緩沖液）混勻，加入上樣孔，同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量 （DL-2000 Marker）為對(duì)照，100V電泳30min，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察分析結(jié)果。

1.3 CDV PCR檢測(cè)方法的特異性、敏感性、重復(fù)性試驗(yàn)

1.3.1 RT-PCR特異性試驗(yàn)

分別取犬瘟熱病毒 （CDV）、犬冠狀病毒 （CCV）反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及犬細(xì)小病毒 （CPV）抽提的DNA，用已建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證本方法的特異性。

1.3.2 RT-PCR敏感性試驗(yàn)

從疫苗中抽提CDV-3的RNA，用DEPC水將RNA依次進(jìn)行10-1～10-7倍稀釋，分別進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，確定其敏感性。

1.3.3 RT-PCR重復(fù)性性試驗(yàn)

用已建立的RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)用免疫膠體金試紙跟RT-PCR同檢測(cè)為水貂犬瘟熱病毒為陽(yáng)性的病料進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)3次，驗(yàn)證本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.4 RT-PCR的臨床應(yīng)用

從儲(chǔ)存水貂病料中隨機(jī)取2份病料，分別用膠體金和RT-PCR方法檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)方法反應(yīng)條件的確定

以CDV-3株為模板，利用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行RTPCR反應(yīng)。顯示擴(kuò)增得到與預(yù)期目的條帶大小相符的特異性片段。經(jīng)過(guò)不同條件，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，確定采用2μl的模板量，上、下游引物各0.5μl，退火溫度為51℃進(jìn)行擴(kuò)增。以優(yōu)化的PCR反應(yīng)的最佳條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行凝膠電泳，在287bp處得到清晰可見(jiàn)的目的條帶。

2.2 CDV PCR檢測(cè)方法的特異性、敏感性、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 特異性試驗(yàn)結(jié)果

RT-PCR能從提取的核酸中擴(kuò)增出287bp特異條帶，其他泳道的病毒：犬細(xì)小病毒 （CPV）、犬冠狀病毒 （CCV）擴(kuò)增結(jié)果為陰性，說(shuō)明本引物特異性好 （見(jiàn)圖1）。

圖1 RT-PCR特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 RT-PCR敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 RT-PCR重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)不同濃度CDV-3RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，顯示該RT-PCR方法最低能檢出約稀釋濃度10～5倍的病毒RNA（見(jiàn)圖 2）。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3次重復(fù)操作RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果一致，表明方法穩(wěn)定可靠 （見(jiàn)圖3）。

2.3 臨床收集樣品檢測(cè)結(jié)果

本試驗(yàn)RT-PCR檢測(cè)方法比免疫膠體金法敏感度高，結(jié)果準(zhǔn)。

[1]高娃,楊敬,陳振文,等.犬瘟熱病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2004,14(4):241-244.

[2]殷震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].第2版.北京科學(xué)出版社,1997,16(7):329-330.

于紅鴿 （1989.9-)，女，山東省即墨市人，大學(xué)本科，助理獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疾病防控、動(dòng)物疾病診斷工作。