郝栩婷

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院檢驗科，北京 100006）

兩種不同方法學(xué)檢測精子DNA完整性分析的結(jié)果評價

郝栩婷

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院檢驗科，北京 100006）

精子； DNA完整性； 方法學(xué)評價

近年來，不孕不育問題已經(jīng)成為世界性醫(yī)學(xué)和社會問題，約有10%～15%的育齡夫婦受到不孕不育的困擾。其中男方因素約占50%（約20%為男方單方因素，30%～40%為男女雙方因素），全世界不孕不育發(fā)病率有逐漸上升趨勢［1］。目前國內(nèi)評價男性生育功能的指標(biāo)主要還是精液常規(guī)參數(shù)分析。然而，傳統(tǒng)的精液常規(guī)檢測項目尚不能準(zhǔn)確、完全地反映精子質(zhì)量情況。有學(xué)者研究認為，男性不育者中仍有15%的精液常規(guī)分析是正常的，并且30%以上的男性不育患者因病因不清而被診斷為特發(fā)性不育［2］。精子 DNA是遺傳物質(zhì)的攜帶者，成熟的精子，其DNA鏈緊密纏繞著魚精蛋白，使精子染色質(zhì)高度緊密完整。當(dāng)精子受外部應(yīng)激狀態(tài)（如氧化應(yīng)激反應(yīng)、溫度升高等）刺激，就可能損傷精子DNA，從而導(dǎo)致精子DNA完整性受損。精子DNA完整性分析（DFI）檢測作為評價精子DNA損傷的指標(biāo)逐漸成為男性不育臨床檢測的新選擇，越來越受到臨床醫(yī)生的重視。但是，目前DFI檢測的方法學(xué)有很多種，且沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，各實驗間的檢測結(jié)果是否能夠通用還需要進一步研究。目前國內(nèi)檢測 DFI主要有精子染色質(zhì)擴散實驗（SCD）法和末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP末端標(biāo)記法（TUNEL）兩種，本文針對這兩種方法進行比對研究，旨在探討這兩種方法學(xué)結(jié)果的可比性。

材料和方法

1 研究對象

選擇2014年10月至2014年12月在我院不孕不育門診就診的80例男性患者作為研究對象，年齡28～52歲，身體健康，無睪丸外傷、家族遺傳性疾病史及性功能障礙病史，體檢無明顯異常。所有研究對象取精前禁欲3～7d，手淫法采集精液于干燥無菌取精杯中，立即送檢。

2 儀器及試劑

SCD法儀器使用日本奧林帕斯 CX-21顯微鏡，試劑使用西班牙Halosperm＠試劑盒；TUNEL法采用美國BD公司FACSCalibur流式細胞儀，試劑由浙江星博生物公司提供。

3 方法

3.1 重復(fù)性實驗（批內(nèi)精密度） 選取同一份樣本，用兩種不同方法同時檢測20次，計算均值、標(biāo)準(zhǔn)差s、變異系數(shù) CV。

3.2 兩種方法的檢測結(jié)果比較 所有樣本均同時使用兩種方法進行檢測，并將記錄數(shù)據(jù)進行比較；以DFI結(jié)果30%為臨界值［3］，分別計算各自的陽性率并進行分析。

4 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

（1）重復(fù)性實驗結(jié)果見表1。由表1可見，使用TUNEL法檢測結(jié)果的重復(fù)性要優(yōu)于SCD法。

表1 兩種方法檢測的精密度比較（%）

（2）兩種方法學(xué)檢測結(jié)果見表2。兩組檢測結(jié)果差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），陽性率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 兩種方法的檢測結(jié)果比較

（3）兩種方法學(xué)檢測結(jié)果一致性見表3。kappa＝0.70，兩種方法學(xué)的一致性不理想。

表3 兩種方法結(jié)果的一致性比較

討 論

從上述實驗數(shù)據(jù)中能看出，TUNEL法檢測結(jié)果的精密度要明顯優(yōu)于 SCD法。這可能是兩者實驗方法導(dǎo)致的。目前采用 SCD法檢測 DFI尚無自動化儀器操作，只能以手工法進行計數(shù)，結(jié)果的判斷受到人為的主觀因素影響較大；另外受人力的限制，一次實驗只在鏡下觀測五百個精子，結(jié)果有一定的片面性。而TUNEL法通過全自動流式細胞儀檢測，結(jié)果的判斷全部由儀器進行，一次實驗?zāi)苡^測近萬個精子，結(jié)果的代表性好，所以 TUNEL法檢測的精密度要優(yōu)于SCD法。

兩組結(jié)果之間的相關(guān)性不理想，且兩組檢測結(jié)果之間差異較大，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且兩種方法的一致性也不理想。這可能是因為二者檢測原理不同導(dǎo)致的。TUNEL法檢測原理是在保持細胞結(jié)構(gòu)的前提下，通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（dUTP）將熒光標(biāo)記物與 DNA斷裂片段末端的游離氫氧根結(jié)合，通過流式細胞儀直接測定精子DNA單鏈和雙鏈的數(shù)量；而SCD法檢測原理是通過檢測精子 DNA對酸變性的易感性間接反映精子DNA的完整性，即將液化后的精液與瓊脂糖混合鋪于載玻片上，酸變性和除去核蛋白后，經(jīng)染色后在顯微鏡下觀察，用有DNA碎片的精子不能產(chǎn)生特征性的光暈的特性來判讀結(jié)果［4］。

兩種方法學(xué)檢測的陽性率結(jié)果，SCD法略高于TUNEL法，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。有研究顯示［5］，SCD法檢測結(jié)果較TUNEL法檢測結(jié)果更敏感，這點可能是本次實驗樣本量較少有關(guān)。

綜上所述，這兩種方法均能反應(yīng)出精子 DNA的完整性。由于二者實驗方法及檢測原理的不同，檢測結(jié)果目前尚不同通用。

檢測精子 DNA完整性的方法還有很多，每種方法的檢測原理及實驗方法都不一樣，各種方法也缺乏標(biāo)準(zhǔn)化及檢測標(biāo)準(zhǔn)值［6］。如果實驗室同時使用兩種不同方法進行檢測，有可能會出現(xiàn)同一患者不同的檢測結(jié)果。因此建議不要同時使用兩種方法進行檢測，臨床實驗室應(yīng)根據(jù)自身的情況選擇一種適合本實驗室的檢測方法。

［1］李佳祥，舒金輝，李勁，等.精子DNA完整性檢測在男性不育診斷中的應(yīng)用價值.中國男科學(xué)雜志，2012，26（9）：15-23.

［2］孫靜波，姜宏，何瑞冰.精子DNA完整性與精液參數(shù)的相關(guān)性研究.中國男科學(xué)雜志，2010，24（4）：26-29.

［3］黃學(xué)鋒，金建遠，費前進，等.精子 DNA損傷：獨立的精子質(zhì)量評價指標(biāo).溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，40（3）：239-242.

［4］楊譯，姜輝，張海嬌，等.男性不育患者年齡與精子DNA碎片和精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)性分析.中國性科學(xué)，2012，21（2）：17-19.

［5］Zhang L H，Qiu Y，Wang K H，et al.Measurement of sperm DNA fragmentation using bright-field microscopy：comparison between sperm chromatin dispersion test and terminal uridine nick-end labeling assay.Fertil Steril，2010，94（3）：1027-1032.

［6］孫爍磊.精子DNA損傷的機制及檢測方法研究進展.國際泌尿系統(tǒng)雜志，2008，28（4）：480-483.

（張增武編輯）

10.11748／bjmy.issn.1006－1703.2016.01.035

2015-09-08；

2015-10-28

郝栩婷，主管檢驗師。Tel：13501039505；E-mail：13501039505＠163.com