范雪嬌，沈 菁，蔡鵬威，張建舫，徐如梅，陳發(fā)林，黃 毅，伍嚴(yán)安

（福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 福州350001）

乙肝標(biāo)志物 ELISA檢測不同方法的比較研究

范雪嬌，沈 菁，蔡鵬威，張建舫，徐如梅，陳發(fā)林，黃 毅，伍嚴(yán)安

（福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 福州350001）

目的 探討全自動ELISA系統(tǒng)檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HbcAb（HBV-M）是否在重復(fù)性、準(zhǔn)確度等方面優(yōu)于手工法和半自動法，為其更好地在臨床實(shí)驗(yàn)室開展工作提供進(jìn)一步的數(shù)據(jù)和基礎(chǔ)。方法 用以上各項(xiàng)指標(biāo)的弱陽性質(zhì)控品，分別做手工法、半自動法和全自動法的批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)。另用三種方法分別檢測臨床血清標(biāo)本，每項(xiàng)810人份。定性結(jié)果不完全一致的標(biāo)本，HBsAg用中和法做確證試驗(yàn)，其余四項(xiàng)用化學(xué)發(fā)光法作為參考方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果批內(nèi)與批間重復(fù)性比較，全自動法的 CV小于手工法和半自動法。三種方法檢測臨床標(biāo)本，定性結(jié)果兩兩比較，均顯示一致性非常好（k＞0.8，P＜0.05）；進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，除 HBcAb的半自動法陽性率顯著高于全自動法（P＜0.0125）外，其余項(xiàng)目三種方法兩兩比較，均無顯著性差異（P＞0.0125）。經(jīng)過確證／參考試驗(yàn)驗(yàn)證，全自動法、半自動法、及手工法不完全一致的標(biāo)本，HBsAg17份，符合個數(shù)分別為15、9和4；HBsAb 24份，符合個數(shù)分別為17、13、7；HBeAg 9份，符合個數(shù)分別為7、2、5；HBeAb 34份，符合個數(shù)分別為19、16、19；HBcAb 36份，符合個數(shù)分別為28、15、19。結(jié)論 ①全自動法比半自動法和手工法具有更好的重復(fù)性。②三種方法有非常好的一致性，均能較好的診斷乙型肝炎。③全自動法 ELISA檢測HBV-M比半自動法和手工法準(zhǔn)確度更高，可進(jìn)一步提高這些項(xiàng)目的檢驗(yàn)質(zhì)量。

乙型肝炎； 血清標(biāo)志物； 酶聯(lián)免疫吸附測定； 方法學(xué)

乙型肝炎病毒（HBV）感染被認(rèn)為是病毒性肝炎最重要的原因［1］。大約20%～25%的乙肝病毒攜帶者患有各種慢性肝臟疾病包括肝硬化和肝癌［2］。我國感染 HBV人數(shù)占全球感染人數(shù)的33%［3］。由于臨床診治的需要，乙肝標(biāo)志物是我國臨床實(shí)驗(yàn)室最常檢測的項(xiàng)目之一。其檢測方法有多種。酶聯(lián)免疫分析（ELISA）是臨床應(yīng)用最早且目前仍廣泛使用的半定量檢測方法，其靈敏度、準(zhǔn)確性與重復(fù)性雖不及化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)（CLIA）［4］，但其具有檢測成本低廉，成批檢測時間消耗不長，設(shè)備儀器要求不高等優(yōu)點(diǎn)。目前用ELISA方法檢測乙肝五項(xiàng)血清標(biāo)志物 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HbcAb（乙肝兩對半，HBV-M）廣泛應(yīng)用于各臨床實(shí)驗(yàn)室。ELISA法操作步驟多，任意一步驟操作不當(dāng)都有可能影響檢測結(jié)果［5］。隨著技術(shù)的進(jìn)步，ELISA半自動法和高通量全自動法逐漸應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室，這提高了ELISA自動化水平，尤其是全自動法近些年越來越多地得到應(yīng)用。但后者與手工法、半自動法相比，對HBV-M檢測結(jié)果有何影響還未見系統(tǒng)的比較資料。本研究試圖在這方面進(jìn)行探討，并為臨床實(shí)驗(yàn)室對ELISA法 HBV-M檢測結(jié)果進(jìn)行分析時提供參考。

材料和方法

1 標(biāo)本及質(zhì)控品

五項(xiàng)HBV-M的標(biāo)本，每項(xiàng)的陽性、弱陽性和陰性標(biāo)本均等量來自：福建省立醫(yī)院 2013年2月至2013年4月采用TECAN酶免加樣儀加樣，半自動方法檢測的臨床標(biāo)本，2013年6月至2013年8月采用ADC ELISA 600全自動法檢測的臨床標(biāo)本及福州市第一醫(yī)院、福州市第二醫(yī)院2013年5月至2013年7月手工法檢測的臨床標(biāo)本。其中陽性標(biāo)本占總標(biāo)本數(shù)的20%左右，弱陽性標(biāo)本占陽性標(biāo)本數(shù)的50%左右。

北京康徹斯坦生物科技有限公司生產(chǎn)的HBVM質(zhì)控品，濃度見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品濃度

2 試劑及儀器

ELISA全自動儀為 ADC ELISA 600高通量ELISA檢測系統(tǒng)，由煙臺艾德康生物科技有限公司生產(chǎn)。乙型肝炎血清標(biāo)志物（兩對半）檢測試劑由英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司提供。化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析（CMIA）由雅培公司提供的雅培i2000全自動免疫分析儀及配套試劑。其他設(shè)備和儀器還有PW-960多功能酶標(biāo)洗板機(jī)，TECAN酶標(biāo)儀，HH-W-600數(shù)顯電熱恒溫水箱及 Finnpipette 5～50μL、20～200μL加樣槍。所有儀器均經(jīng)過校準(zhǔn)，試劑均在有效期內(nèi)。

3 方法

手工法：整個實(shí)驗(yàn)過程按照英科新創(chuàng)試劑盒所附說明書的操作步驟手工進(jìn)行，其中孵育、洗板及比色用實(shí)驗(yàn)室所配設(shè)備。

半自動法：用TECAN freedom前處理系統(tǒng)加樣及加酶后，將微孔板移出，后續(xù)步驟按照英科新創(chuàng)試劑盒所附說明書的操作步驟手工進(jìn)行，其中孵育、洗板及比色用實(shí)驗(yàn)室所配設(shè)備。

全自動法：用ADC ELISA 600高通量ELISA檢測系統(tǒng)預(yù)先設(shè)定的程序進(jìn)行，整個過程均在全自動分析系統(tǒng)上進(jìn)行。

3.1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 以上各項(xiàng)指標(biāo)的弱陽性質(zhì)控品用手工法、半自動法和全自動法，分別做重復(fù)性試驗(yàn)，批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)為在同批試驗(yàn)中用弱陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)品連續(xù)加樣 20孔測定。批間重復(fù)性試驗(yàn)為弱陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)單孔測定 ×20d。計算所得 S／CO及CV值。

3.2 三種方法一致性及符合率的比較 用手工、半自動和全自動法對乙肝五種血清標(biāo)志物指標(biāo)做對比。檢測標(biāo)本同時加室內(nèi)質(zhì)控品，分 2～3d完成，但是對每一份標(biāo)本而言，3種方法的檢測在同一天進(jìn)行。三種方法測得定性結(jié)果不完全一致的標(biāo)本，有需確證試驗(yàn)的項(xiàng)目，如HBsAg，用確證試驗(yàn)（中和法）確證，對無確證試驗(yàn)的其余四項(xiàng)，用 CMIA作為參考方法，再次驗(yàn)證。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用Microsoft Excel 2003軟件直接分別計算三種方法批內(nèi)與批間的 CV值。使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計算三種方法結(jié)果的差異性用配對四格表χ2檢驗(yàn)，以P＜0.0125為有統(tǒng)計學(xué)意義。一致性檢驗(yàn)用Kappa檢驗(yàn)，以 P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

所有三種方法不符的標(biāo)本用確證試驗(yàn)（或參考試驗(yàn)）確證后，計算每種方法的符合數(shù)。

結(jié) 果

1 重復(fù)性試驗(yàn)

批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)（n＝20）與批間重復(fù)試驗(yàn)（n＝20）結(jié)果分別見表1與表2。從結(jié)果可見，全自動ELISA法較半自動和手工法具有較小的 CV值，提示全自動法有較好的精確度。半自動與手工法的 CV值大小沒有一定的規(guī)律。

表1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)測定值比較（±s）

表1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)測定值比較（±s）

HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb全自動法及其CV（%） 2.14±0.1 4.67項(xiàng)目00半自動法及其CV（%） 2.10±0.17 8.10 3.38±0.22 6.55 3.84±0.13 3.52 0.89±0.08 9.28 0.17±0.0319.0.14±0.03 20.21手工法及其CV（%） 2.33±0.18 7.73 2.51±0.30 12.12 3.63±0.29 7.98 0，84±0.11 12.83 2.37±0.27 11.19 3.35±0.28 8.51 0.8±0.09 10.84 0.15±0.03 19.21

表2 批間重復(fù)性試驗(yàn)測定值比較（±s）

表2 批間重復(fù)性試驗(yàn)測定值比較（±s）

HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb全自動法及其CV（%） 2.52±0.37 14.69項(xiàng)目42半自動法及其CV（%） 2.11±0.47 22.54 2.64±0.30 14.33 2.42±0.45 18.76 0.75±0.16 21.71 0.12±0.03 25.0.18±0.06 34.00手工法及其 CV（%） 2.34±0.5 21.34 2.13±0.41 19.00 2.44±0.54 21.91 0.48±0.13 26.31 2.06±0.36 17.32 2.2±0.59 27.00 0.58±0.15 26.12 0.13±0.05 39.11

2 三種檢測方法一致性、差異性及符合率的比較

2.1 三種方法差異性及一致性的比較 三種方法學(xué)比較中，任意兩種方法定性結(jié)果一致性均較好（Kappa檢驗(yàn)，k＞0.75）。三種方法兩兩之間差異性比較時，HBeAb的半自動法與手工法陽性率有明顯差異（χ2＝5.33，P＜0.05），HBcAb的全自動與半自動法有明顯差異（χ2＝8.52，P＜0.05），其余均無顯著性差異（P＞0.05），結(jié)果見表3。

表3 HBV-M三種方法定性結(jié)果一致性及差異性的比較

2.2 手工法、半自動法及全自動法符合率對比五項(xiàng)HBV-M三種方法符合率比較，見圖1。

討 論

ELISA檢測中涉及加樣、加酶、洗板、溫育、顯色等多個操作步驟及生化反應(yīng)階段，任意一方面把控不準(zhǔn)都可能對結(jié)果產(chǎn)生影響。全自動 ELISA檢測的溫育方式，與半自動法和手工法不同，前者是干熱，后兩者是濕熱；而手工法的加樣方式與全自動和半自動不同，前者是實(shí)驗(yàn)員手工加樣槍操作，后兩者是機(jī)器加樣。

對比三種方法重復(fù)性批內(nèi)及批間實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，HBV-M五項(xiàng)檢測的結(jié)果均是全自動CV值最小，而半自動與手工法的CV值大小沒有一定的規(guī)律，提示全自動法的精密度最好。手工法、半自動法、全自動法三者之間最大的不同是孵育方式和對孵育時間的準(zhǔn)確掌握。對于孵育方式的不同對結(jié)果產(chǎn)生的影響，已有研究顯示干熱板式孵育精密度較好［6］，但是也有研究顯示不同結(jié)果［7］。本研究似乎也傾向于板式干熱比水浴有更高的精密度，但考慮到實(shí)驗(yàn)中還有其他因素的影響，這一結(jié)論還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本研究半自動法采用一次性槍式加樣，手工法采用人工一次性槍式加樣，從手工法與半自動法精密度無明顯差異可得出如若加樣操作規(guī)范、加樣槍準(zhǔn)確，手工加樣與機(jī)器加樣同樣有較好的精確度，即使對于低濃度血清或質(zhì)控品亦如此。

三種方法學(xué)比較中，發(fā)現(xiàn) HBV-M五項(xiàng)檢測中，任意兩項(xiàng)定性結(jié)果一致性均較好（Kappa檢驗(yàn)，k＞0.75）。進(jìn)行三種方法兩兩比較時，HBeAb的半自動法與手工法陽性率有明顯差異（χ2檢驗(yàn)，P＜0.05），HBcAb的全自動與半自動法有明顯差異（χ2檢驗(yàn)，P＜0.05）。這些差別可能與ELISA HBeAb和HBcAb都是使用競爭法有關(guān)。ELISA法的 CO值是由陰性對照孔的均值計算得來，而結(jié)果又是根據(jù)S／CO來判斷，所以陰性對照孔的吸光度大小直接影響著最終結(jié)果的判定。HBV-M的前三項(xiàng)為雙抗夾心法，陰性對照孔均為無色。而后兩項(xiàng)都是采用競爭法，陰性對照孔為顯色孔，因而兩塊板陰性對照孔顯色的深淺稍有不同，可能就會對結(jié)果產(chǎn)生很大的影響。在實(shí)際工作中試劑盒陰性對照不穩(wěn)定的情況經(jīng)常發(fā)生，雖然本研究嚴(yán)格按照操作規(guī)程，但仍不能排除陰性對照試劑不穩(wěn)定的因素。所以對于 HBeAb與HBcAb這兩項(xiàng)，如果結(jié)果產(chǎn)生有統(tǒng)計學(xué)意義的差異，不能單從手工、半自動、全自動三種方法去分析，還有可能是陰性對照不穩(wěn)定引起。

HBsAg中和試劑盒選用兩種或兩種以上單克隆抗體作為捕獲抗體對變異病毒的檢出能力大大提高，且固相載體體積很小，反應(yīng)面積增大，再加之標(biāo)記物的循環(huán)利用，發(fā)光時間延長，靈敏度大大提高，檢測HBsAg的靈敏度達(dá)到0.05ng／mL。因此，該方法被公認(rèn)為全球檢測HBsAg金標(biāo)準(zhǔn)［8-9］。本研究中我們選擇了它作為三種 ELISA方法HBsAg不一致標(biāo)本的確證試驗(yàn)。HBV-M的其他四項(xiàng) HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb目前未有確證試驗(yàn)試劑盒，由于CLIA有很好的敏感度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，所以我們選擇其作為檢測這四項(xiàng)的參考方法。

五個項(xiàng)目，手工法、半自動法和全自動法不符合的標(biāo)本所占弱陽性標(biāo)本數(shù)分別為 20.98%、29.6%、11.1%、41.9%和44.4%。如前文所述，HBcAb和HBeAb由于競爭法的固有缺陷，導(dǎo)致三種方法不一致標(biāo)本多于其他三項(xiàng)。三種方法不一致的標(biāo)本用確證試驗(yàn)（或參考方法）驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)除HBeAb全自動法與手工法有相同的最高的符合率外，其余四項(xiàng)均是全自動法的符合率高于半自動和手工，提示全自動法是三種方法中準(zhǔn)確性最高的方法。此外，HBeAg與 HBeAb，其他三項(xiàng)均是半自動法符合率高于手工法。

分別對比三種方法與CLIA不難發(fā)現(xiàn)，ELISA法雖然靈敏度遠(yuǎn)不如 CLIA，但是無論手工法、半自動法還是全自動法都有一定的假陽性，原因可能有以下幾點(diǎn)：①血清中的補(bǔ)體、RF及其他自身抗體造成假陽性［10-11］。②免疫復(fù)合物吸附于塑料表面，造成的非特異性吸附，導(dǎo)致假陽性。③血漿中的纖維蛋白原與酶結(jié)合物一起粘附到 ELISA板上，不易洗掉，造成假陽性［12］。這些因素在判斷 ELISA檢驗(yàn)結(jié)果時，都應(yīng)加以考慮。

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（潘子昂編輯）

Comparison of Different ELISA Methods on Hepatitis B Virus Markers Detection

FAN Xue-jiao，SHEN Jing，CAI Peng-wei，ZHANG Jian-fang，XU Ru-mei，CHEN Fa-lin，HUANG Yi，WU Yan-an
（Department of Clinical Laboratory，F(xiàn)ujian Provincial Hospital of Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350001，China）

Objective To investigate whether automatic ELISA system is superior to semi-automatic ELISA and manual ELISA for detecting HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb，HbcAb（HBV-M）in terms of precision and accuracy，and to provide further data and foundation on ELISA detection of HBV-M for clinical laboratory.Methods Within-run and between-run repetitive experiments were performed with each weakly positive quality control standard of the above indexes through manual method，semi-automatic method and high-throughput automatic method respectively.In addition，clinical serum samples were detected by manual method，semiautomatic method and high-throughput automatic method.Each test items contained 810 serum samples.For the samples whose qualitative results were not completely consistent，the neutralization was used as a confirmatory test for HBsAg and CLIA was regarded as the reference method to confirm the rest four indexes.Results Comparison of within-run and between-run repeatability，it was found that the CV obtained by automatic method was smaller than that by manual method and semi-automatic method.Paired comparison of qualitative results of serum samples indicated that any two methods had good consistency（k＞0.8，P＜0.05）.According to Chi-square test，there was no difference in qualitative results between any two methods（P＞0.0125），except that the semi-automatic method had higher positive rate than automatic method（P＜0.0125）in HBcAb.The numbers of samples which were not completely consistent in the three methods for HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb and HBcAb were 17，24，9，34 and 36 respectively.Conclusion Automatic method showed better stability than semi-automatic method and manual method.Tree methods have relatively good consistency，and all of them can be used for better diagnosis of HBV.Automatic method has higher accuracy than semi-automatic method and manual method in ELISA HBV-M tests and can further improve the quality of the analysis.

Hepatitis B； Serologic marker； ELISA； Methodology

10.11748／bjmy.issn.1006－1703.2016.01.026

2015-06-29；

2015-12-04

衛(wèi)生部醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心（28-1-2）

范雪嬌，福建醫(yī)科大學(xué)，碩士生。Tel：15806038206；E-mail：499836598＠qq.com

伍嚴(yán)安，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：wyaslyy＠126.com