宋 寧，鄧垂文，胡朝軍，張蜀瀾，李 萍，白依娜，李麗君，董曉娟，吳子燕，甘曉丹，史艷萍，李永哲，張奉春

（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院風濕免疫科，風濕免疫病學教育部重點實驗室，北京 100730）

·方法研究·

全國180家實驗室檢測抗環(huán)瓜氨酸肽抗體的比對分析

宋 寧，鄧垂文，胡朝軍，張蜀瀾，李 萍，白依娜，李麗君，董曉娟，吳子燕，甘曉丹，史艷萍，李永哲，張奉春

（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院風濕免疫科，風濕免疫病學教育部重點實驗室，北京 100730）

目的 調(diào)查全國抗環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體的檢測現(xiàn)狀，了解各實驗室檢測的準確性。方法 由衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項“風濕免疫病診療關(guān)鍵技術(shù)臨床推廣及轉(zhuǎn)化應用研究”項目組（以下稱“項目組”）制備比對樣品（液體血清），包括5支不同抗CCP抗體水平的樣品。項目組向全國180家實驗室統(tǒng)一寄送比對樣品，并要求各實驗室在規(guī)定時間內(nèi)完成檢測，項目組對各實驗室上傳的檢測結(jié)果及檢測方法進行比對分析和評價。結(jié)果 對CCP-1、CCP-3和CCP-5為抗CCP抗體陽性的樣本，比對品檢測結(jié)果符合率分別為99.4%、98.3%和98.9%；對CCP-2和CCP-4為抗CCP抗體陰性的樣本，比對品檢測結(jié)果符合率均為98.9%。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是檢測抗CCP抗體的主要方法，不同廠家的ELISA試劑盒檢測結(jié)果波動較大。結(jié)論 2013年全國實驗室檢測抗CCP抗體比對品的符合率較好，但檢測仍亟需標準化。

抗環(huán)瓜氨酸肽抗體； 類風濕關(guān)節(jié)炎； 多中心比對

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的以關(guān)節(jié)滑膜增生及軟骨破壞引起的慢性炎癥為主要特征的自身免疫性疾病。多數(shù)情況下，RA患者的慢性炎癥反應會引起關(guān)節(jié)滑膜增厚，最終導致關(guān)節(jié)的破壞、功能障礙，甚至殘疾［1］。早期診斷和系統(tǒng)治療是防止關(guān)節(jié)畸形和致殘的關(guān)鍵。2010年美國風濕病學會與歐洲風濕病學會聯(lián)手推出了新的 RA分類標準［2］，其最顯著的改變之一就是增加了抗環(huán)瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide，CCP）抗體檢測。經(jīng)研究證實，在所有檢測過的生物學標志物中，抗CCP抗體是 RA最強的預后因素之一［3］。鑒于抗CCP抗體的臨床重要性，本研究對全國 180家實驗室的抗CCP抗體的定性和／或定量檢測結(jié)果進行比對分析，發(fā)現(xiàn)問題，以提高全國范圍內(nèi)的檢測結(jié)果的一致性和準確性。

材料與方法

1 參加實驗室

本次（2013年）全國實驗室自身抗體檢測比對由衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項“風濕免疫病診療關(guān)鍵技術(shù)臨床推廣及轉(zhuǎn)化應用研究”項目組組織，共有180家實驗室自愿報名參加本次多中心抗CCP抗體檢測比對分析工作。

2 方法

2.1 比對品的制備 收集單獨潔凈來源的大劑量原始血清（抗CCP抗體陽性的高、中、低濃度范圍的血清各150mL，陰性血清200mL，每50mL收集為一管），盡量減少混合血清；所有血清進行過濾滅菌，去除纖維蛋白原的預處理；由“項目組”統(tǒng)一采用市場上主流試劑供應商的試劑對原始血清進行聯(lián)合檢測，主要包括德國歐蒙，歐州診斷，上海科新生物，德國AESKU，美國雅培，羅氏診斷等試劑廠商，采用第三方質(zhì)控血清進行結(jié)果控制，選取所有試劑檢測結(jié)果一致的血清，制備成滿足高中低濃度范圍清晰的一組血清；比對品經(jīng)穩(wěn)定性實驗驗證，結(jié)果表明在37℃和4～8℃下，樣本分別可以保存1個月和12個月，結(jié)果偏差均小于10%，以此保證運輸過程中的穩(wěn)定性。

2.2 樣品發(fā)放與回報 抗CCP抗體樣品1組，共計5支。比對樣品編號如下：CCP-1、CCP-2、CCP-3、CCP-4和CCP-5，其中樣品CCP-1、CCP-3和CCP-5為抗CCP抗體陽性，樣品CCP-2和CCP-4為陰性。比對樣品經(jīng)快遞郵寄至各報名參加的實驗室，要求各實驗室在規(guī)定時間內(nèi)完成樣本檢測，并對實驗結(jié)果進行網(wǎng)絡回報，以提高效率及減少文本報告差錯。

3 統(tǒng)計學分析

采用 Excel軟件對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析。因檢測比對樣品的方法不同，僅對定性結(jié)果采用正確率（回報結(jié)果正確實驗室數(shù)／參加該項目實驗室總數(shù)）進行描述性評價?？笴CP抗體定量結(jié)果的分析通過計算每個品牌試劑檢測結(jié)果的中位數(shù)、均值和變異系數(shù)而完成，該定量結(jié)果分析僅供參考。

結(jié) 果

1 參加單位分布情況

參加類風濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)自身抗體譜室間比對的實驗室共計180家。如表1所示，實驗室分布在4個直轄市和25個省自治區(qū)，其中參與比對的實驗室在10家及以上的為廣東省、北京、河南省、山東省和浙江省。實驗室大部分來自三甲醫(yī)院，其余來自于二甲醫(yī)院、三乙醫(yī)院和企業(yè)實驗室。

表1 2013年參加抗CCP抗體室間比對的實驗室分布（家）

2 抗CCP抗體比對品檢測結(jié)果

180家實驗室均回報了抗CCP抗體比對品的檢測結(jié)果（見表2）。樣品CCP-1、CCP-3和CCP-5的參考結(jié)果為陽性，結(jié)果回報正確率分別為99.4%、98.3%和98.9%。樣品CCP-2和CCP-4為陰性，結(jié)果回報正確率均為98.9%。整體結(jié)果正確率均高于98%。

表2 不同方法檢測抗CCP抗體的正確率（%）

在本次比對實驗中，抗CCP抗體的檢測方法以酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunesorbent assay，ELISA）為主，其次為發(fā)光酶免疫測定法（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）和電化學發(fā)光免疫測定法（electrochemiluminescence immunoassay，ECLI），還有膠體金免疫層析法（colloidal gold immunochromatographic assay，GICA）、微粒子酶免疫熒光測定法（IMX）、免疫斑點法和增強化學發(fā)光法。由于參與比對的實驗室采用 ELISA檢測抗CCP抗體的較多，對10個品牌的ELISA試劑盒的檢測結(jié)果進行了比較（見表3）。各廠家試劑盒之間的檢測結(jié)果差異較大，但其中9種試劑盒的檢測結(jié)果均顯示，樣品CCP-1的抗CCP抗體水平最高，CCP-3次之。僅1家試劑的檢測結(jié)果相反。

表3 不同廠家 ELISA試劑盒檢測抗CCP抗體結(jié)果比較

（續(xù)表3）

討 論

RA是一種致畸性自身免疫性疾病，未經(jīng)及時診治可出現(xiàn)嚴重的關(guān)節(jié)畸形。早期診斷 RA一直是國內(nèi)外學者研究的一個熱點。近 l0余年來，國內(nèi)外學者已發(fā)現(xiàn)多個對 RA有早期診斷價值的新的血清學指標，如抗CCP抗體、抗角蛋白抗體、葡萄糖6-磷酸異構(gòu)酶、抗核周因子抗體、抗突變型瓜氨酸波形蛋白抗體等［4-8］。同時上述指標的檢測方法和自動化操作系統(tǒng)也越來越多樣化。為了提高各方法學和各實驗室檢測平臺間檢測結(jié)果的可比性，促進我國各臨床單位抗CCP抗體檢測的準確性，開展了本次全國多中心的抗CCP抗體檢測的室間比對工作。

抗CCP抗體是類風濕關(guān)節(jié)炎抗體譜中的重要指標，是環(huán)狀聚絲蛋白的多肽片段，由RA患者的B淋巴細胞自發(fā)分泌，而其他疾病患者和正常人群 B淋巴細胞并不自發(fā)分泌抗CCP抗體，故具有很高的特異性。Nicola等［9］研究得出抗CCP抗體的敏感性和特異性分別為41%和97.%，與早期RA強相關(guān)，但與年齡、性別方面無相關(guān)性。抗CCP抗體陽性的RA患者骨破壞較抗CCP抗體陰性者嚴重，是預后不良的提示。2000年，Schellekens等［10］人工合成了一種環(huán)化肽，即CCP，他們將一條由 19個氨基酸殘基組成的瓜氨酸肽中的兩個絲氨酸替換為半胱氨酸，形成與β2轉(zhuǎn)角具有相似結(jié)構(gòu)的二硫鍵，合成了CCP。這種合成肽可以大量人工合成，并保證有很高的純度，其肽鏈相對較短，使得它與其他血清成分沒有特殊的相互反應，因此是一種很理想的用于檢測抗CCP抗體的抗原底物。

本次室間比對的樣品包含抗CCP抗體一種血清學指標，全國共有180家實驗室參與并回報結(jié)果。參與實驗室分布全國4個直轄市和25個省自治區(qū)，分布之廣，可以代表全國抗 CCP抗體的檢測情況。與往年相比，參與室間質(zhì)評的實驗室呈上升趨勢，二級醫(yī)院有所增加，說明各地區(qū)更加重視實驗室檢測的質(zhì)量控制。比對結(jié)果顯示，抗CCP抗體的檢測準確率較好，均高于98%。

本次比對實驗中，抗CCP抗體檢測的方法較多，其主流檢測方法與國際一致，為 ELISA法，此外還有CLEIA、ECLI、GICA、IMX、免疫斑點法和增強化學發(fā)光法。其中，CLEIA，ECLI和IMX等檢測方法有著較高的自動化水平，在國際上應用此類型方法進行抗CCP抗體檢測的實驗室正在逐年增加。我國自身抗體檢測自動化水平遠落后于世界水平，但從本次抗CCP抗體比對使用的檢測方法可見，易于自動化的自身抗體檢測方法正在國內(nèi)逐步推廣開來，將來可為我國抗CCP抗體檢測的標準化提供保障。

ELISA是本次比對中的主要檢測方法，共有137家實驗室采用此方法進行抗CCP抗體檢測。95家實驗室共采用 10家試劑廠商提供的 ELISA試劑盒回報了定量檢測結(jié)果。就不同廠家生產(chǎn)的ELISA試劑盒進行統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，不同廠家的 ELISA試劑盒檢測的定量結(jié)果差異較大，有的廠家檢測結(jié)果變異系數(shù)大于100%。分析原因：目前，抗CCP抗體的檢測方法由于缺乏國際參考物質(zhì)［11］，每個廠家采用其自身校準品進行校準，抗CCP抗體校準品及瓜氨酸表位中的差異已經(jīng)被證實為不同方法之間可比性較差的根本原因。檢測方法間的一致性只有通過采用同種抗原才能實現(xiàn)。由此，包括包被抗原在內(nèi)的抗CCP抗體檢測的標準化顯得尤為重要［12］。其次，這可能受檢測者操作工程中的人為因素或試劑盒穩(wěn)定性影響所致。

通過上述比對分析發(fā)現(xiàn)，近年來，大量商品化試劑盒的出現(xiàn)，以及新抗體和新方法的不斷出現(xiàn)，使得自身抗體檢測有很大的發(fā)展，但是抗CCP抗體檢測的標準化工作卻落后于自身抗體檢測技術(shù)的發(fā)展，自身抗體檢測的標準化亟需解決。

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（張增武編輯）

Multi-center Comparison of Anti-cyclic Citrullinated Peptide Antibodies in 180 Laboratories of China

SONG Ning，DENG Chui-wen，HU Chao-jun，ZHANG Shu-lan，LI Ping，BAI Yi-na，LI Li-jun，DONG Xiao-juan，WU Zi-yan，GAN Xiao-dan，SHI Yan-ping，LI Yong-zhe，ZHANG Feng-chun
（Beijing Union Hospital，Beijing 100730，China）

Objective To survey the current situations of anti-cyclic citrullinated peptide（CCP）antibody testing level in China and to improve the accuracy of analysis.Methods Five liquid serum samples with different concentrations were prepared by the Health Public Welfare Project research（project team），and then were uniformly sent to 180 laboratories.The study requests each lab to finish testing within the set time，and the results were uploaded to website.Comparison and evaluation was finished by the project team.Results Sample CCP-1，CCP-3，and CCP-5 were the anti-CCP antibody positive，the coincident rate was 99.4%，98.3%and 98.9%，respectively.Sample CCP-2 and CCP-4 were anti-CCP antibody negative，the coincident rate was 98.9%.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was the main method for the detection of anti-CCP antibody，and results among the ELISA kits of different manufacturers showed great volatile.Conclusion The coincident rates of comparisons of anti-CCP antibody in all labs are more than 98%，but the standardization of anti-CCP antibody testing remains to be improved.

Anti-cyclic citrullinated peptide antibody； Rheumatoid arthritis； Multicenter comparison

10.11748／bjmy.issn.1006－1703.2016.01.025

2015-06-25；

2015-07-13

衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項“風濕免疫病診療關(guān)鍵技術(shù)臨床推廣及轉(zhuǎn)化應用研究”項目（201202004）

李永哲。E－mail：yongzhelipumch＠126.com