馬 歡，郝 攀，馬 超，閆 平，劉 敏，王榮福，陳雪祺，張春麗

（1.北京大學(xué)第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，北京 100034；2.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，福建 廈門 361004）

·基礎(chǔ)研究·

131I-c（RGD）2的藥代動(dòng)力學(xué)及急性毒性研究

馬 歡1，郝 攀1，馬 超2，閆 平1，劉 敏1，王榮福1，陳雪祺1，張春麗1

（1.北京大學(xué)第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，北京 100034；2.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，福建 廈門 361004）

目的 用131I標(biāo)記二硫鍵成環(huán)的 RGD肽二聚體 c（RGD）2，探討其在裸鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)、急性毒性反應(yīng)和死亡情況，評(píng)價(jià)其應(yīng)用的安全性。方法 選取5只裸鼠為實(shí)驗(yàn)對象，每只經(jīng)尾靜脈注射131I-c（RGD）2（7.4 MBq／200 μL），分別于注射后3、6、10、15、30、45、60、120、180及360min斷尾取血5 μL，測量血液的放射性計(jì)數(shù)，采用PKSolver軟件進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)分析。另取裸鼠10只隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對照組，實(shí)驗(yàn)組每只經(jīng)尾靜脈注射131I-c（RGD）2（7.4 MB／60μL）；對照組經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水60μL，觀察注射后72 h內(nèi)裸鼠的不良反應(yīng)和死亡情況。結(jié)果 血液藥-時(shí)曲線符合權(quán)重系數(shù)為1／CC的開放性二房室分布模型，其中分布相半衰期（t1／2α）為15.364 min，消除相半衰期（t1／2β）為123.125 min。注射131I-c（RGD）2后72 h內(nèi)，裸鼠無不良反應(yīng)與死亡。結(jié)論 c（RGD）2具有理想的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，且無明顯毒性作用，這些均有利于其作為新藥應(yīng)用于臨床。

藥代動(dòng)力學(xué)； RGD肽； 急性毒性

RGD是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）的多肽，在生物體內(nèi)廣泛存在，它是整合素及其配體作用的識(shí)別位點(diǎn)，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附作用，并且具有信號(hào)傳導(dǎo)的功能［1-3］。整合素 αvβ3受體在腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高度表達(dá)，而含 RGD序列的多肽可特異性地與αvβ3受體結(jié)合，放射性核素標(biāo)記的含 RGD序列的多肽已應(yīng)用于腫瘤血管生成顯像研究［4］。

目前研究較多的 RGD肽多為酰胺鍵成環(huán)的環(huán)肽及其多聚體，其環(huán)化過程困難，而二硫鍵成環(huán)的RGD肽合成相對容易。在前期研究中，我們通過 V-life軟件分子對接程序篩選出了二硫鍵成環(huán)的新型RGD二聚體肽c（RGD）2［5］，制備合成了具有高放化純度的131I-c（RGD）2，并且在活體動(dòng)物顯像中獲得了高質(zhì)量的影像［6］，表明該新型多肽有應(yīng)用于臨床腫瘤顯像的潛在價(jià)值。作為新藥用于臨床顯像，不僅要求 c（RGD）2在靶組織中具有較高的攝取率，而且要具有適合于診斷的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。

本文采用放射性核素131I標(biāo)記 c（RGD）2，研究131I-c（RGD）2在裸鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征及急性毒性反應(yīng)，獲取體內(nèi)半衰期等主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為其作為新藥在臨床中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 主要材料

Na131I溶液由中國原子能科學(xué)研究院同位素所提供；氯胺-T（ChT）：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，純度＞98%；Sephadex TM G10：Amersham Bioscience（AB公司）產(chǎn)品。層析紙為新華 1號(hào)濾紙。BALB／c裸鼠15只（雌性，體重20～22g，4～6周齡）由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法

2.1131I-（RGD）2的制備與純化 采用ChT法標(biāo)記c（RGD）2，將50 μg c（RGD）2溶于100 μL pH 7.4的0.5 mmol／L的磷酸鹽緩沖液中，然后向上述反應(yīng)液中加入 10 μL Na131I溶液，同時(shí)加入 ChT溶液，使ChT的終濃度為 10 μg／μL，總反應(yīng)體積不超過 200 μL，室溫下震蕩反應(yīng)2 min，立即將標(biāo)記物經(jīng)Sephadex G10柱層析分離純化，用pH 7.4的0.05 mmol／L磷酸鹽緩沖液沖洗，收集淋洗液1 mL／管，測定每管的放射性計(jì)數(shù)。第一個(gè)計(jì)數(shù)峰值管為131I-c（RGD）2，采用紙層析法測定標(biāo)記率與放化純度，展開劑為正丁醇∶無水乙醇∶0.5mol／L氨水 ＝5∶1∶2（V∶V∶V），Rf為0～0.1。最終產(chǎn)品的放化純度≥90%。

2.2 最佳房室模型分析與藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算 取 5只裸鼠，分別經(jīng)尾靜脈注射 7.4 MBq131I-c（RGD）2，于注射后 3、6、10、15、30、45、60、120、180及360 min經(jīng)斷尾取血5 μL，測定血液樣品的放射性計(jì)數(shù)，并換算為血液放射性濃度（即kBq／mL）。應(yīng)用藥代動(dòng)力學(xué)軟件PKSolver，將軟件中藥物濃度用血液放射性濃度替換，對 5只裸鼠的平均血液放射性濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分別用一、二、三室模型進(jìn)行消除曲線擬合，同時(shí)將 1、1／C、1／CC作為權(quán)重系數(shù)（C為血液的放射性濃度），AUC、AUMC、MRT采用統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)，遵循最小信息準(zhǔn)則（Akaike information criterion，AIC）最小原則，得出最佳房室模型，求得各有關(guān)體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)方程系數(shù)及代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2.3 急性毒性試驗(yàn) 取裸鼠 10只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對照組，每組5只，實(shí)驗(yàn)組每只裸鼠經(jīng)尾靜脈注射131I-c（RGD）2溶液 7.4 MBq／60 μL；對照組每只裸鼠經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水 60 μL。給藥后 72 h內(nèi)觀察裸鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、活動(dòng)行為、糞便、體重變化及死亡等情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 最佳房室模型及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

利用 PKSolver軟件繪制出平均血液放射性濃度-時(shí)間曲線（圖 1），并得出不同模型各權(quán)重下的AIC及擬合度（R2）值（表1）?？梢?31I-c（RGD）2在裸鼠體內(nèi)的最佳藥代動(dòng)力學(xué)房室模型為權(quán)重1／CC的二室模型。經(jīng)擬合得到血液放射性濃度-時(shí)間關(guān)系式為：

C（t）＝9245.084e-0.045t＋2278.969e-0.006t

其中，公式中C為血液放射性濃度（kBq／mL），t為注射標(biāo)記物后的時(shí)間（min）。標(biāo)記物在裸鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2。

表1 不同權(quán)重?cái)?shù)下各室模型的 AIC值和 R2

表2 標(biāo)記物131I-c（RGD）2在裸鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

注射131I-c（RGD）2后72 h內(nèi)，裸鼠未出現(xiàn)步伐不穩(wěn)、抽搐、呼吸困難、后肢強(qiáng)直及死亡等不良現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)組裸鼠注射131I-c（RGD）2后，體重未發(fā)生明顯改變，且飲水量與對照組裸鼠無差別。

討 論

藥代動(dòng)力學(xué)研究是新藥臨床前研究的重要組成部分，通過對新藥的動(dòng)物和人體藥代動(dòng)力學(xué)研究，明確藥物吸收、分布、代謝和排泄的特征，尋找藥物在體內(nèi)的處置過程和轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律，藥物在體內(nèi)的積蓄速度和積蓄程度，為臨床安全合理用藥提供依據(jù)。

藥代動(dòng)力學(xué)研究顯示，多肽 c（RGD）2在裸鼠體內(nèi)符合權(quán)重系數(shù)為1／CC的二室模型，與αvβ3受體在正常組織中極低表達(dá)或不表達(dá)的結(jié)論相符［7］。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)中，反映藥物自血液向組織液分布快慢的α值（0.045）是代表體內(nèi)藥物消除速率β值（0.006）的 7.5倍。分布相半衰期（t1／2α）表示藥物在血液中的濃度達(dá)到最大值的一半所需要的時(shí)間，代表藥物吸收的快慢。t1／2α為15.364 min，說明131I-c（RGD）2吸收快，靜脈注射后能迅速通過血液循環(huán)向組織液分布，能較快的到達(dá)靶器官，有利于減少早期顯像時(shí)心臟與大血管的影像干擾。消除相半衰期表示血液藥物濃度下降一半所需要的時(shí)間，反應(yīng)藥物在血中維持時(shí)間的長短及從體內(nèi)消除的快慢。t1／2β（123.125 min）符合小分子多肽血液清除快的特點(diǎn)，能保證常規(guī)顯像時(shí)間內(nèi)軟組織處于低放射性本底，并有利于減少對其他組織器官的輻射損傷。這也與 c（RGD）2多肽結(jié)構(gòu)的預(yù)期設(shè)計(jì)一致，我們在c（RGD）2結(jié)構(gòu)中引入了兩個(gè)D型絲氨酸以增加它的水溶性，以加快多肽在正常組織中的清除、降低肝臟攝取，提高腫瘤與正常組織的靶本比。K12值大于K2l值，提示131I-c（RGD）2在裸鼠體內(nèi)的分布達(dá)到暫時(shí)平衡后，進(jìn)入組織液中的量大于離開量，保證了高表達(dá) αvβ3受體的腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞與放射性核素標(biāo)記的c（RGD）2有充足的時(shí)間進(jìn)行結(jié)合。表觀分布容積（Vd）是給藥劑量與血藥濃度的一個(gè)比值，表觀分布容積大，說明藥物分布廣，組織攝取多，而血藥濃度低。該多肽Vd值為 0.880，因此該多肽組織攝取多而血液中濃度低，組織與血液本底的比值高，可以得到高質(zhì)量的圖像。

對以上參數(shù)進(jìn)行分析可知，靜脈注射131I-c（RGD）2后可在短時(shí)間內(nèi)行αvβ3受體陽性腫瘤顯像，且延遲顯像可獲得低血池本底及高質(zhì)量的圖像，這與我們前期的顯像研究結(jié)果一致，在前期我們選用了αvβ3受體高表達(dá)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠模型，靜脈注射131I-c（RGD）2后3 h即可獲得高對比度的腫瘤顯像圖像，靜脈注射后 5 h、24 h時(shí)行延遲顯像圖像質(zhì)量更佳［7］。本實(shí)驗(yàn)為在注射131I-c（RGD）2后的較短時(shí)間內(nèi)行核素顯像，并獲得低血池本底及高質(zhì)量圖像提供了理論依據(jù)。

通過V-life軟件分子對接程序設(shè)計(jì)合成的二硫鍵成環(huán)的c（RGD）2多肽結(jié)構(gòu)簡單、合成容易，標(biāo)記方便、標(biāo)記率高，該藥物具有良好的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，且急性毒性試驗(yàn)未見不良反應(yīng)，這些均有利于其作為新藥應(yīng)用于臨床腫瘤的顯像研究。

［1］Seong J，Wang N，Wang Y.Mechanotransduction at focal adhesions：from physiology to cancer development.J Cell Mol Med，2013，17（5）：597-604.

［2］Robinson S D，Hodivala-Dilke K M.The role of beta3-integrins in tumor angiogenesis：context is everything.Curr Opin Cell Biol，2011，23（5）：630-637.

［3］Haubner R，Wester H J，Reuning U，et al.Radiolabeled αvβ3integrin antagonists：a new class of tracers for tumor targeting.J Nucl Med，1999，40（6）：1061-1071.

［4］Gaertner F C，Kessler H，Wester H J，et al.Radiolabelled RGD peptides for imaging and therapy.Eur J Nucl Med Mol Imaging，2012，39 Suppl 1：S126-138.

［5］張麗，張春麗，王榮福，等.RGD多肽類藥物設(shè)計(jì)、活性測定及99mTc-cRGD二聚體的制備.核化學(xué)與放射化學(xué)，2011，33（2）：106-113.

［6］張春麗，郝攀，成彧，等.131I-c（RGD）2在荷不同類型腫瘤小鼠中的生物分布與顯像研究.腫瘤學(xué)雜志，2014，20（11）：875-880.

［7］von Wallbrunn A，Holtke C，Zuhlsdorf M，et al.In vivo imaging of integrin αvβ3expression using fluorescence-mediated tomography.Eur J Nucl Med Mol Imaging，2007，34（5）：745-754.

（潘子昂編輯）

Pharmacokinetics and Acute Toxicity Study of131I-c（RGD）2

MA Huan，HAO Pan，MA Chao，YAN Ping，LIU Min，WANG Rong-fu，CHEN Xue-qi，ZHANG Chun-li
（Department of Nuclear Medicine，Peking University First Hospital，Beijing 100034，China）

Objective To evaluate the safety，pharmacokinetics and acute toxicity of131I-c（RGD）2in nude mice.Methods Five nude mice were injected with131I-c（RGD）2via tail vein（7.4 MBq in 200 μL／mouse）and blood samples（5 μL）were collected by cutting down the tail end at 3，6，10，15，30，45，60，120，180 and 360 min after administration.The radioactive accounts of blood samples were measured using a γ-counter and the pharmacokinetics data was calculated by the PKSolver software.10 nude mice were randomly divided into 2 groups，the experimental group and the control group，for the acute toxicity study.The experimental mice were injected with131I-c（RGD）2via tail vein（7.4 MBq in 60 μL／mouse）and the control mice were injected with saline（60 μL／mouse）to observe the adverse reaction.Results The blood dynamics of131I-c（RGD）2in nude mice conformed to the two-compartment model with the weight of 1／CC，and t1／2αand t1／2βwere 15.364 min and 123.125 min respectively.No adverse reaction was observed within 72 h after injection.Conclusion The ideal pharmacokinetic characteristics and tissue tolerance of131I-c（RGD）2suggest it to be a potential agent in clinical practice.

Pharmacokinetics； RGD peptide； Acute toxicity

10.11748／bjmy.issn.1006－1703.2016.01.024

2015-11-03；

2015-11-26

北京市自然科學(xué)基金（7112129）

張春麗，研究員，博士。E-mail：zhangcl0326＠sina.com