袁檬，翁沁玉，盧進(jìn)登

(湖北大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢，430062)

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嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌低溫誘變試驗研究

袁檬，翁沁玉，盧進(jìn)登

(湖北大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢，430062)

嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillusferrooxidans，簡稱A.ferrooxidans菌)在生產(chǎn)實踐中有著廣泛的運(yùn)用和發(fā)展前景，然而低溫是限制其發(fā)展的一個重要因素.通過紫外線低溫誘變試驗探討A.ferrooxidans菌低溫誘變的可行性.結(jié)果表明：1)Fe2+濃度隨時間變化的曲線呈反“S”型，A.ferrooxidans菌的活性變化符合“S”型增長曲線；2)紫外線誘變可以產(chǎn)生適宜低溫生長的A.ferrooxidans菌種，但誘變時間30 s、60 s的效果無顯著差異；3)A.ferrooxidans菌的活性是隨溫度的降低而減小的，誘變產(chǎn)生的菌種并不能逆轉(zhuǎn)這一生長規(guī)律；4)3個誘變溫度相比較，15 ℃的誘變效果最佳，誘變組的Fe2+氧化率比未誘變的空白組高了14%，這也表明了A.ferrooxidans菌紫外線低溫誘變的可行性，為A.ferrooxidans菌的推廣和應(yīng)用提供一定的理論支持.

A.ferrooxidans菌；紫外線誘變；鄰啡羅啉比色法

0 引言

嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillusferrooxidans，簡稱A.ferrooxidans菌)是一種化能自養(yǎng)且專性好氧的嗜酸革蘭氏陰性菌，以自身細(xì)胞分裂的形式進(jìn)行繁殖，可以固定空氣中的CO2，以氧化Fe2+、S0及S2-的化合物等來獲得生長過程所需的能量[1-2].A.ferrooxidans菌在生產(chǎn)實踐中主要運(yùn)用在3個方面：1)生物冶金.A.ferrooxidans菌是迄今已報道的20多種浸礦細(xì)菌中研究得最多的浸礦細(xì)菌，主要應(yīng)用在鈾礦和低品位銅礦的堆浸上[3-4]，后來發(fā)展出利用細(xì)菌氧化作用處理難處理的金屬礦的方面，可處理鈾、銻、福、鉆、鋁、鎳和鋅等多種硫化金屬礦，種類多達(dá)19種.2)金屬及礦物材料的微加工.A.ferrooxidans菌可生物合成黃鉀鐵礬(一種環(huán)境友好材料)、施氏礦物等金屬、礦物材料.周順桂等[5]利用A.ferrooxidans菌的生物催化氧化作用在常溫常壓條件下合成赭黃色的黃鉀鐵礬，經(jīng)鑒定其晶體粒徑均勻，分散性好，且沒有無定形的羥基硫酸高鐵副產(chǎn)物.張德遠(yuǎn)[6]等人利用A.ferrooxidans菌成功開展了純銅的生物加工實驗，明確了生物加工過程中細(xì)菌對鐵離子循環(huán)的動力學(xué)作用，給出了生物加工系統(tǒng)離子循環(huán)模型.3)環(huán)境工程應(yīng)用.目前A.ferrooxidans菌在礦山廢水廢渣處理、煤炭和燃油脫硫、去除H2S以及生活和工業(yè)廢水中的重金屬離子、清除放射性水泥等方面都已經(jīng)得到了運(yùn)用，該類技術(shù)具有經(jīng)濟(jì)、高效、低污染等優(yōu)點(diǎn)，運(yùn)用的前景十分廣泛.

A.ferrooxidans菌用途廣泛且發(fā)展前景大，然而冬季的低溫是其發(fā)展所要面臨的一個難題.低溫條件下A.ferrooxidans菌生長緩慢，活性大大降低，無法繼續(xù)工作.因此本研究中設(shè)計A.ferrooxidans菌紫外線低溫誘變(紫外線可引起諸如DNA鏈的斷裂、DNA分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)、核酸與蛋白質(zhì)的交聯(lián)、胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用以及胸腺嘧啶二聚體的形成等多種變化[7]，從而引起堿基轉(zhuǎn)換、顛倒、移碼突變或缺失，達(dá)到誘變的目的)的試驗方案，定期監(jiān)測細(xì)菌培養(yǎng)期間培養(yǎng)基的pH值、Fe2+和Fe3+的濃度的變化情況，并將誘變組與未經(jīng)過誘變的空白組進(jìn)行對比分析，觀察各培養(yǎng)期間細(xì)菌的生長特征，氧化Fe2+和水解Fe3+的效率，進(jìn)而論證A.ferrooxidans菌紫外線低溫誘變的可行性，找出合適的紫外誘變溫度、時間，培養(yǎng)出可以適應(yīng)冬季低溫條件的菌種，以及為A.ferrooxidans菌的推廣和廣泛應(yīng)用提供理論支持.

1 材料與方法

1.3 測定方法 亞鐵(Fe2+)：鄰啡羅啉比色法(GB7873-87，3)[8].分別吸取鐵的標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于6支50 mL比色管中，對管口、內(nèi)壁吹水，將附著于內(nèi)壁的水樣沖到管底，然后依次分別加入5 mL醋酸-醋酸銨緩沖溶液，搖勻，加入0.5%鄰菲羅啉溶液2 mL，搖勻，加水至刻度，靜置15 min，在510 nm波長處，用1 cm比色皿，以空白為參比，測定溶液吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，亞鐵含量為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線.

先向比色管中各滴加2滴1:1濃硫酸(防止Fe2+被A.ferrooxidans菌氧化)，再吸取待測水樣20 μL于50 mL比色管中，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作，測得水樣吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得相應(yīng)亞鐵含量，計算出亞鐵的摩爾濃度.

總鐵(TFe)：吹水后先加入10%鹽酸羥胺1 mL(還原樣品中的Fe3+)，其余步驟與亞鐵測定方法相同，計算出待測溶液中總鐵的摩爾濃度.

1.4 菌種與培養(yǎng)基 菌種：A.ferrooxidans菌濃縮菌液放入28 ℃的SPX-150B-D型振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)活化并定時傳代保持活性.

培養(yǎng)基：本試驗所用培養(yǎng)基為9K液體培養(yǎng)基，其組成為：44.48 g的FeSO4·7H2O，0.01 g的Ca(NO3)2·4H2O，0.5 g的MgSO4·7H2O，0.1 g的KCl,0.5 g的K2HPO4，3 g的(NH4)2SO4，去離子水1 L，用1∶1硫酸調(diào)節(jié)pH到2.5.

2 結(jié)果與分析

2.1A.ferrooxidans菌在15 ℃下紫外線誘變結(jié)果分析 實驗測得20、15、10 ℃下紫外線誘變后培養(yǎng)基的pH值和亞鐵、總鐵含量變化情況.現(xiàn)以15 ℃為例分析誘變后A.ferrooxidans菌各培養(yǎng)階段的活性狀態(tài).3個階段測得的pH值如表1，亞鐵、總鐵的摩爾含量變化情況依次如表2、表3，pH值、亞鐵及總鐵均測定初始值.

表1 15 ℃的3個培養(yǎng)階段的pH值

表2 15 ℃的3個培養(yǎng)階段的Fe2+的摩爾濃度值 mmol/L

表3 15 ℃的3個培養(yǎng)階段的TFe的摩爾濃度值 mmol/L

表4 15 ℃的3個培養(yǎng)階段的Fe2+的氧化速率 mmol/L·d

表5 15 ℃的3個培養(yǎng)階段的Fe2+的氧化率

表6 15 ℃的3個培養(yǎng)階段的總鐵沉淀率

表5中第一培養(yǎng)階段兩組誘變菌種將亞鐵氧化完全用了4 d，而第二、三階段卻只花了3 d，對照組3個階段的第3天均氧化了85%的亞鐵，這是因為照射紫外線后有部分細(xì)菌死亡，培養(yǎng)基中產(chǎn)生各種類型的菌種互相爭奪養(yǎng)料，其中適宜15 ℃生長的菌種在第一階段過程中不斷排擠其他菌群，最終占據(jù)優(yōu)勢地位，此時細(xì)菌數(shù)量達(dá)到最大.又第二、三階段各組的亞鐵氧化率變化是大致相同的，這表明此時A.ferrooxidans菌的生長已穩(wěn)定.因此之后的數(shù)據(jù)對比均取第三階段的數(shù)據(jù).

A.ferrooxidans菌將Fe2+全部氧化需3 d，與國內(nèi)去除酸性廢水中鐵離子的常規(guī)方法相比，耗時較長，但更加安全、清潔，且便于操作和管理.而如曝氣法，次氯酸鈉氧化法等常規(guī)方法，雖然除鐵效果明顯，用時短，卻存在勞動衛(wèi)生環(huán)境差，資源浪費(fèi)，處理費(fèi)用高，腐蝕性強(qiáng)，無法實現(xiàn)資源化利用的缺點(diǎn).

第二、三階段的第3天，總鐵沉淀率并無顯著差異，這是因為Fe3+水解后生成黃鉀鐵礬類礦物沉淀的反應(yīng)尚在初期，僅有少量沉淀生成，各組間的差別不大.而此時誘變的兩組之間亞鐵的氧化率無明顯差異，又都比空白組高，高了14%，其氧化速率亦高于空白組，這說明誘變是有效果的，但30 s和60 s兩種誘變時間的效果無顯著差別.

2.2A.ferrooxidans菌在20 ℃、15 ℃與10 ℃下紫外線誘變結(jié)果對比分析 培養(yǎng)過程中第二、三階段為穩(wěn)定時期，故取20 ℃、15 ℃與10 ℃下誘變后第三培養(yǎng)階段的Fe2+氧化率做表7.3個誘變溫度下A.ferrooxidans菌將亞鐵氧化完全依次需要2 d、3 d和5 d，10 ℃花時最長，是20 ℃的2.5倍，15 ℃的1.67倍，F(xiàn)e2+氧化速率隨溫度的降低而減小的，這說明A.ferrooxidans菌的活性是隨溫度的降低而減小的，這一現(xiàn)象是符合細(xì)菌生長特征的.實驗中的A.ferrooxidans菌屬于嗜溫菌，最佳生長溫度是28 ℃.小于28 ℃時其活性降低，溫度回升，活性恢復(fù)，溫度高于28 ℃時其活性發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的降低.實驗產(chǎn)生的誘變菌種并不能逆轉(zhuǎn)這種生長規(guī)律.

3個溫度相比較，15 ℃時誘變組與空白組的Fe2+氧化率的差距是最大的，誘變30 s組的Fe2+氧化率比空白組高了14%，即15 ℃的誘變效果最佳.有另一種細(xì)菌——氧化鐵鞘細(xì)菌——可以產(chǎn)生一種胞外酶來氧化水中的Fe2+，但該酶的最適溫度為30 ℃，最適pH為7.0，pH過高或過低都會對該酶的酶活產(chǎn)生較大影響.與A.ferrooxidans菌相比，既不符合冬季的低溫條件，也不能適應(yīng)酸性廢水.

表7 20 ℃、15 ℃和10 ℃的Fe2+的氧化率

2.3 小結(jié) 綜上所述，A.ferrooxidans菌的活性變化是符合有限環(huán)境容量下微生物的“S”型增長曲線的.紫外線誘變可以產(chǎn)生適宜低溫生長的A.ferrooxidans菌種，但誘變時間30 s、60 s的效果無顯著差異.20 ℃、15 ℃與10 ℃時誘變效果相比較，15 ℃的誘變效果最佳，誘變組的Fe2+氧化率比未誘變的空白組高了14%.

3 結(jié)論與討論

本研究可得出如下結(jié)論：1) Fe2+濃度隨時間變化的曲線呈反“S”型，F(xiàn)e2+濃度又與A.ferrooxidans菌的活性成反比，因而A.ferrooxidans菌的活性變化是符合有限環(huán)境容量下微生物的增長曲線——“S”型增長曲線的；2) 各組亞鐵氧化率在第二、三培養(yǎng)階段的變化大致相同，這表明此時A.ferrooxidans菌的生長已穩(wěn)定，故取第三培養(yǎng)階段的數(shù)據(jù)作為有效數(shù)據(jù)；3) 紫外線誘變可以產(chǎn)生適宜低溫生長的A.ferrooxidans菌種，但誘變時間30 s、60 s的效果無顯著差異；4)A.ferrooxidans菌的活性是隨溫度的降低而減小的，誘變產(chǎn)生的菌種并不能逆轉(zhuǎn)這一生長規(guī)律；5) 3個誘變溫度相比較，15 ℃的誘變效果最佳，誘變組的Fe2+氧化率比未誘變的空白組高了14%.

研究可能存在的問題及對后續(xù)研究的展望：a) 未直接測定A.ferrooxidans菌的活性，而是通過Fe2+的含量變化間接表示；b) 就不同誘變時間、次數(shù)、溫度對A.ferrooxidans菌的活性進(jìn)行更詳細(xì)、深入的研究，可得到更全面的數(shù)據(jù)支持，有利于建立A.ferrooxidans菌活性與誘變時間和溫度的關(guān)系的數(shù)學(xué)模型.

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(責(zé)任編輯 游俊)

Experimental study on ultraviolet mutation of Acidithiobacillus ferrooxidans at low temperature

YUAN Meng，WENG Qinyu，LU Jindeng

(Faculty of Resources and Environmental Science，Hubei University，Wuhan 430062，China)

Acidithiobacillusferrooxidansis widely used in production practice and has development prospect，but low temperature severely limits its developing. Through the ultraviolet mutation experiment ofA.ferrooxidansat low temperature，the feasibility of this method was discussed. Experimental results showed that the ferrous molarity changed as a reversed S shape over time. A newA.ferrooxidanswhich is suitable for grow in low temperature could be generated by ultraviolet mutation，although the effects of two different mutagenesis times(30 s、60 s) had no significant difference. And theA.ferrooxidansactivities were decreased as the temperature decreased. Furthermore，the comparison of three different mutagenesis temperature showed that the mutagenic effect was the best at 15 ℃. The above conclusions indicate that the ultraviolet mutation method is feasible. And it provide some theoretical support for the popularization and application ofA.ferrooxidans.

Acidithiobacillusferrooxidans；ultraviolet mutation；phenanthroline colorimetry

2015-10-19

科技部科技惠民計劃(S2013GMD100042)和湖北省科技支撐計劃(2015BCA294)資助

袁檬(1992-)，女，碩士生；盧進(jìn)登，通信作者，教授，E-mail：ljd@hubu.edu.cn

1000-2375(2016)06-0557-04

Q93-3

A

10.3969/j.issn.1000-2375.2016.06.015