尹淑杰 張 濤 榮光影 宋慶嬌 汪 悅 柳朝陽
(佳木斯大學,黑龍江 佳木斯 154007)
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川芎嗪對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力和細胞周期蛋白E、P21表達的影響
尹淑杰1張 濤 榮光影 宋慶嬌 汪 悅 柳朝陽2
(佳木斯大學,黑龍江 佳木斯 154007)
目的 探討川芎嗪(TMP)對阿爾茨海默病(AD)模型大鼠學習記憶和細胞周期蛋白(Cyclin)E、P21表達的影響及作用機制。方法 大鼠海馬區(qū)注入β淀粉樣蛋白(Aβ)1~42制作AD模型。Morris水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力;免疫組化法檢測海馬區(qū)CyclinE和P21蛋白的表達。結(jié)果 低、高劑量TMP組均能改善 AD大鼠的學習記憶能力(P<0.01,P<0.05),下調(diào)大鼠海馬CyclinE蛋白表達(P<0.05),上調(diào)P21蛋白表達(P<0.05)。低、高劑量TMP組相比無明顯差異。結(jié)論 TMP能改善AD大鼠學習記憶功能,下調(diào)CyclinE蛋白和上調(diào)P21蛋白表達,減輕神經(jīng)細胞凋亡。
川芎嗪;阿爾茨海默??;細胞凋亡
阿爾茨海默病(AD)的病理特征為神經(jīng)元纖維纏結(jié)、老年斑和神經(jīng)元廣泛丟失等〔1〕。有研究表明〔2〕細胞凋亡是引起大量神經(jīng)元丟失的主要原因之一,細胞凋亡可通過細胞周期蛋白的異常表達介導〔3〕。故通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的表達可以減少神經(jīng)細胞凋亡,延緩AD發(fā)病。本實驗采用β-淀粉樣蛋白(Aβ)1~42海馬區(qū)注入制作 AD 模型,觀察川芎嗪(TMP)對AD大鼠學習記憶能力及海馬區(qū)細胞周期蛋白E(CyclinE)和P21蛋白表達的影響。
1.1 動物 采用10~14月齡SD大鼠,體重 210~230 g,佳木斯大學動物實驗中心提供。
1.2 主要試劑 磷酸川芎嗪片(北京市燕京制藥廠,50 mg/片,批號030201);Aβ1~42(Sigma公司);兔抗大鼠CyclinE多克隆抗體,兔抗大鼠P21多克隆抗體,免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 AD模型建立〔4〕和動物分組 大鼠麻醉后,固定在顱腦立體定位儀,暴露前囟,按大鼠腦立體定位圖譜進行定位,在前囟后方 3.3 mm、中線左右各旁開1.9 mm穿顱鉆一小孔(直徑約1 mm),將微量注射器垂直插入,緩慢進針2.4 mm 至海馬,分別注入Aβ1~425 μl,注射后留針 5 min,緩慢拔針。術(shù)后牙托粉封固顱骨孔,青霉素預防感染。
將40只SD大鼠隨機分為五組(每組8只):正常對照組、假手術(shù)組、AD模型組、TMP低劑量組(150 mg·kg-1·d-1)(L-TMP組)、TMP高劑量組(250 mg·kg-1·d-1)(H-TMP組)。
1.3.2 Morris水迷宮實驗〔5〕造模后第7天起進行水迷宮實驗,連續(xù)5 d,前4 d作逃避潛伏期實驗。在水迷宮中央隱蔽平臺的位置,將大鼠頭朝外壁在任何一個象限內(nèi)的隨機位置放入水中,潛伏期是指大鼠在120 s內(nèi)從入水點爬到平臺所需時間。實驗中,如果在120 s內(nèi)大鼠找到平臺,讓大鼠站立在平臺上10 s;如果找不到,引導大鼠爬上平臺,并站立10 s,潛伏期計為120 s。空間探索實驗在第5天進行,平臺撤掉,從第二象限任何點放大鼠入水,記錄大鼠在120 s內(nèi)的游泳路徑,計算大鼠在入水象限游泳路徑長度占總路徑長度的百分比。Morris水迷宮圖像處理系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)采集和處理。
1.3.3 免疫組化法檢測大鼠海馬CyclinE和P21蛋白的表達 取大鼠海馬組織于4%多聚甲醛中固定24 h,進行乙醇系列脫水、二甲苯透明、常規(guī)石蠟包埋,制成4 μm厚連續(xù)切片。切片常規(guī)脫蠟至水,高壓修復抗原,冷卻后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,滴加適當稀釋的一抗,37℃恒溫水浴箱孵育2 h,滴加二抗,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復染,脫水,透明,封片。經(jīng)DAB顯色,CyclinE和P21陽性細胞為黃褐色。 用PBS代替一抗作為陰性對照。 在CyclinE和P21免疫組化染色切片的海馬區(qū)各取3個視野(×400),應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測量每個視野內(nèi)CyclinE和P21陽性細胞數(shù)。
1.4 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS11.0軟件行t檢驗。
2.1 Morris 水迷宮實驗結(jié)果 與正常對照組相比,在前4 d逃避潛伏期實驗中,AD模型組潛伏期明顯延長(P<0.01);與正常對照組相比,在第5天空間探索實驗中,AD模型組穿越平臺象限路徑占總路徑百分比降低(P<0.05)。與AD模型組相比,低、高劑量TMP組逃避潛伏期和穿越平臺象限路徑百分比明顯改善(P<0.01,P<0.05)。高劑量TMP組較低劑量TMP組有所改善,但無統(tǒng)計學意義。正常對照組和假手術(shù)組逃避潛伏期和穿越平臺象限路徑比無顯著差異(P>0.05)。見表1。
表1 各組大鼠水迷宮實驗結(jié)果
與正常對照組相比:1)P<0.01,2)P<0.05;與AD模型組相比:3)P<0.01,4)P<0.05
2.2 免疫組化檢測CyclinE和P21蛋白表達結(jié)果 與正常對照組相比,假手術(shù)組CyclinE和P21表達陽性細胞數(shù)無顯著差異(P>0.05),而AD模型組大鼠海馬組織CyclinE陽性細胞數(shù)明顯增加(P<0.05),P21陽性細胞數(shù)明顯減少(P<0.01);與AD模型組相比,TMP各組CyclinE陽性細胞數(shù)明顯減少(P<0.05),P21陽性細胞數(shù)明顯增加(P<0.05);低、高劑量TMP組相比,CyclinE和P21陽性細胞數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)。提示TMP能減少CyclinE的表達和增加P21的表達。見表 2。
表2 各組大鼠海馬CyclinE和P21表達陽性細胞數(shù)
與正常對照組相比:1)P<0.01,2)P<0.05;與AD模型組相比:3)P<0.05
本實驗中AD大鼠學習能力和記憶保持能力明顯降低,TMP治療后AD大鼠的學習能力和記憶保持能力得以明顯改善。細胞凋亡是引起AD病理特征之一的神經(jīng)元喪失的主要機制〔6〕。Cyclin、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)相互作用調(diào)控細胞周期,使細胞分裂正常進行。如果Cyclin、CDK或CKI三者的平衡被打破,細胞周期將重啟進入有絲分裂,后期出現(xiàn)障礙,細胞分裂失敗,細胞周期停滯,形成細胞凋亡〔7〕。
AD病人正常的腦神經(jīng)細胞已停止分化處于G0期。Vincent等〔8〕發(fā)現(xiàn),AD患者腦中有神經(jīng)元重新進入細胞周期,由于CKI失活,導致神經(jīng)細胞經(jīng)過G1/S期檢驗點,DNA復制后進入G2期,但是細胞不能進行正常的分裂,凋亡程序啟動,細胞凋亡引發(fā)〔3〕。
CyclinE與CDK2結(jié)合在 G1/S 期啟動和運行中發(fā)揮作用。CyclinE可激活視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(pRb),使其與轉(zhuǎn)錄因子(E2F)解離,E2Fs可促進形成CyclinE-CDK2復合體,使細胞越過G1/S期檢驗點,進入S期,CyclinE-CDK2復合體進一步磷酸化pRb,使E2F充分釋放,促進有關(guān)S期DNA復制的基因表達〔9〕。
P21屬于CKI家族成員,可結(jié)合并抑制CyclinE-CDK2等復合物的磷酸化活性,使Rb低磷酸化不能解離E2F而致DNA合成障礙,使細胞停滯在G1期。另外,P21分子可與增殖細胞核抗原(PCNA)結(jié)合,使PCNA不能與DNA聚合酶形成δ復合物,影響DNA的復制〔10〕,從而阻止細胞重新進入分裂周期失敗而導致細胞凋亡。
CyclinE在G1期表達,CyclinE-CDK2復合體正性調(diào)控細胞周期,而P21負性調(diào)控細胞周期,CyclinE與P21表達紊亂可引發(fā)細胞周期紊亂。
本文結(jié)果顯示,大鼠海馬區(qū)注入Aβ1~42后,可上調(diào)CyclinE表達,啟動了神經(jīng)元的細胞周期;同時由于其神經(jīng)毒性,使P21的表達抑制,打破細胞周期的平衡狀態(tài),引發(fā)細胞凋亡。TMP可通過下調(diào)CyclinE蛋白表達和上調(diào)P21蛋白表達阻止細胞重新進入細胞周期,減少神經(jīng)細胞凋亡,從而延緩AD大鼠腦神經(jīng)病理進程,減少Aβ對腦細胞神經(jīng)元的損傷,進而改善大鼠學習記憶能力。
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〔2015-11-17修回〕
(編輯 袁左鳴)
黑龍江省自然科學基金資助項目(H2015074);黑龍江省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目(20050222026);黑龍江省普通高等學校青年學術(shù)骨干支持計劃項目(1252G059);佳木斯大學科技重點項目(Sz2011-009)
柳朝陽(1971-),男,碩士,副主任醫(yī)師,主要從事神經(jīng)干細胞和阿爾茨海默病機制研究。
尹淑杰(1969-),女,副主任醫(yī)師,主要從事腦血管病、癲癇,頭痛及眩暈的診斷和治療研究。
R749.16
A
1005-9202(2016)20-4961-02;
10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.009
1 濟寧市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科
2 佳木斯大學附屬第一醫(yī)院