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        川芎嗪對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和細(xì)胞周期蛋白E、P21表達(dá)的影響

        2016-11-28 00:44:33尹淑杰榮光影宋慶嬌柳朝陽(yáng)
        中國(guó)老年學(xué)雜志 2016年20期
        關(guān)鍵詞:阿爾茨海默陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞周期

        尹淑杰 張 濤 榮光影 宋慶嬌 汪 悅 柳朝陽(yáng)

        (佳木斯大學(xué),黑龍江 佳木斯 154007)

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        川芎嗪對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和細(xì)胞周期蛋白E、P21表達(dá)的影響

        尹淑杰1張 濤 榮光影 宋慶嬌 汪 悅 柳朝陽(yáng)2

        (佳木斯大學(xué),黑龍江 佳木斯 154007)

        目的 探討川芎嗪(TMP)對(duì)阿爾茨海默病(AD)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶和細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)E、P21表達(dá)的影響及作用機(jī)制。方法 大鼠海馬區(qū)注入β淀粉樣蛋白(Aβ)1~42制作AD模型。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力;免疫組化法檢測(cè)海馬區(qū)CyclinE和P21蛋白的表達(dá)。結(jié)果 低、高劑量TMP組均能改善 AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力(P<0.01,P<0.05),下調(diào)大鼠海馬CyclinE蛋白表達(dá)(P<0.05),上調(diào)P21蛋白表達(dá)(P<0.05)。低、高劑量TMP組相比無明顯差異。結(jié)論 TMP能改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能,下調(diào)CyclinE蛋白和上調(diào)P21蛋白表達(dá),減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

        川芎嗪;阿爾茨海默??;細(xì)胞凋亡

        阿爾茨海默病(AD)的病理特征為神經(jīng)元纖維纏結(jié)、老年斑和神經(jīng)元廣泛丟失等〔1〕。有研究表明〔2〕細(xì)胞凋亡是引起大量神經(jīng)元丟失的主要原因之一,細(xì)胞凋亡可通過細(xì)胞周期蛋白的異常表達(dá)介導(dǎo)〔3〕。故通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)可以減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡,延緩AD發(fā)病。本實(shí)驗(yàn)采用β-淀粉樣蛋白(Aβ)1~42海馬區(qū)注入制作 AD 模型,觀察川芎嗪(TMP)對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬區(qū)細(xì)胞周期蛋白E(CyclinE)和P21蛋白表達(dá)的影響。

        1 材料與方法

        1.1 動(dòng)物 采用10~14月齡SD大鼠,體重 210~230 g,佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

        1.2 主要試劑 磷酸川芎嗪片(北京市燕京制藥廠,50 mg/片,批號(hào)030201);Aβ1~42(Sigma公司);兔抗大鼠CyclinE多克隆抗體,兔抗大鼠P21多克隆抗體,免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

        1.3 方法

        1.3.1 AD模型建立〔4〕和動(dòng)物分組 大鼠麻醉后,固定在顱腦立體定位儀,暴露前囟,按大鼠腦立體定位圖譜進(jìn)行定位,在前囟后方 3.3 mm、中線左右各旁開1.9 mm穿顱鉆一小孔(直徑約1 mm),將微量注射器垂直插入,緩慢進(jìn)針2.4 mm 至海馬,分別注入Aβ1~425 μl,注射后留針 5 min,緩慢拔針。術(shù)后牙托粉封固顱骨孔,青霉素預(yù)防感染。

        將40只SD大鼠隨機(jī)分為五組(每組8只):正常對(duì)照組、假手術(shù)組、AD模型組、TMP低劑量組(150 mg·kg-1·d-1)(L-TMP組)、TMP高劑量組(250 mg·kg-1·d-1)(H-TMP組)。

        1.3.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)〔5〕造模后第7天起進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn),連續(xù)5 d,前4 d作逃避潛伏期實(shí)驗(yàn)。在水迷宮中央隱蔽平臺(tái)的位置,將大鼠頭朝外壁在任何一個(gè)象限內(nèi)的隨機(jī)位置放入水中,潛伏期是指大鼠在120 s內(nèi)從入水點(diǎn)爬到平臺(tái)所需時(shí)間。實(shí)驗(yàn)中,如果在120 s內(nèi)大鼠找到平臺(tái),讓大鼠站立在平臺(tái)上10 s;如果找不到,引導(dǎo)大鼠爬上平臺(tái),并站立10 s,潛伏期計(jì)為120 s。空間探索實(shí)驗(yàn)在第5天進(jìn)行,平臺(tái)撤掉,從第二象限任何點(diǎn)放大鼠入水,記錄大鼠在120 s內(nèi)的游泳路徑,計(jì)算大鼠在入水象限游泳路徑長(zhǎng)度占總路徑長(zhǎng)度的百分比。Morris水迷宮圖像處理系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)采集和處理。

        1.3.3 免疫組化法檢測(cè)大鼠海馬CyclinE和P21蛋白的表達(dá) 取大鼠海馬組織于4%多聚甲醛中固定24 h,進(jìn)行乙醇系列脫水、二甲苯透明、常規(guī)石蠟包埋,制成4 μm厚連續(xù)切片。切片常規(guī)脫蠟至水,高壓修復(fù)抗原,冷卻后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,滴加適當(dāng)稀釋的一抗,37℃恒溫水浴箱孵育2 h,滴加二抗,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片。經(jīng)DAB顯色,CyclinE和P21陽(yáng)性細(xì)胞為黃褐色。 用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。 在CyclinE和P21免疫組化染色切片的海馬區(qū)各取3個(gè)視野(×400),應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量每個(gè)視野內(nèi)CyclinE和P21陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0軟件行t檢驗(yàn)。

        2 結(jié) 果

        2.1 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與正常對(duì)照組相比,在前4 d逃避潛伏期實(shí)驗(yàn)中,AD模型組潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01);與正常對(duì)照組相比,在第5天空間探索實(shí)驗(yàn)中,AD模型組穿越平臺(tái)象限路徑占總路徑百分比降低(P<0.05)。與AD模型組相比,低、高劑量TMP組逃避潛伏期和穿越平臺(tái)象限路徑百分比明顯改善(P<0.01,P<0.05)。高劑量TMP組較低劑量TMP組有所改善,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常對(duì)照組和假手術(shù)組逃避潛伏期和穿越平臺(tái)象限路徑比無顯著差異(P>0.05)。見表1。

        表1 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        與正常對(duì)照組相比:1)P<0.01,2)P<0.05;與AD模型組相比:3)P<0.01,4)P<0.05

        2.2 免疫組化檢測(cè)CyclinE和P21蛋白表達(dá)結(jié)果 與正常對(duì)照組相比,假手術(shù)組CyclinE和P21表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無顯著差異(P>0.05),而AD模型組大鼠海馬組織CyclinE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.05),P21陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01);與AD模型組相比,TMP各組CyclinE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05),P21陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.05);低、高劑量TMP組相比,CyclinE和P21陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)。提示TMP能減少CyclinE的表達(dá)和增加P21的表達(dá)。見表 2。

        表2 各組大鼠海馬CyclinE和P21表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

        與正常對(duì)照組相比:1)P<0.01,2)P<0.05;與AD模型組相比:3)P<0.05

        3 討 論

        本實(shí)驗(yàn)中AD大鼠學(xué)習(xí)能力和記憶保持能力明顯降低,TMP治療后AD大鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶保持能力得以明顯改善。細(xì)胞凋亡是引起AD病理特征之一的神經(jīng)元喪失的主要機(jī)制〔6〕。Cyclin、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)相互作用調(diào)控細(xì)胞周期,使細(xì)胞分裂正常進(jìn)行。如果Cyclin、CDK或CKI三者的平衡被打破,細(xì)胞周期將重啟進(jìn)入有絲分裂,后期出現(xiàn)障礙,細(xì)胞分裂失敗,細(xì)胞周期停滯,形成細(xì)胞凋亡〔7〕。

        AD病人正常的腦神經(jīng)細(xì)胞已停止分化處于G0期。Vincent等〔8〕發(fā)現(xiàn),AD患者腦中有神經(jīng)元重新進(jìn)入細(xì)胞周期,由于CKI失活,導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)過G1/S期檢驗(yàn)點(diǎn),DNA復(fù)制后進(jìn)入G2期,但是細(xì)胞不能進(jìn)行正常的分裂,凋亡程序啟動(dòng),細(xì)胞凋亡引發(fā)〔3〕。

        CyclinE與CDK2結(jié)合在 G1/S 期啟動(dòng)和運(yùn)行中發(fā)揮作用。CyclinE可激活視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb),使其與轉(zhuǎn)錄因子(E2F)解離,E2Fs可促進(jìn)形成CyclinE-CDK2復(fù)合體,使細(xì)胞越過G1/S期檢驗(yàn)點(diǎn),進(jìn)入S期,CyclinE-CDK2復(fù)合體進(jìn)一步磷酸化pRb,使E2F充分釋放,促進(jìn)有關(guān)S期DNA復(fù)制的基因表達(dá)〔9〕。

        P21屬于CKI家族成員,可結(jié)合并抑制CyclinE-CDK2等復(fù)合物的磷酸化活性,使Rb低磷酸化不能解離E2F而致DNA合成障礙,使細(xì)胞停滯在G1期。另外,P21分子可與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)結(jié)合,使PCNA不能與DNA聚合酶形成δ復(fù)合物,影響DNA的復(fù)制〔10〕,從而阻止細(xì)胞重新進(jìn)入分裂周期失敗而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

        CyclinE在G1期表達(dá),CyclinE-CDK2復(fù)合體正性調(diào)控細(xì)胞周期,而P21負(fù)性調(diào)控細(xì)胞周期,CyclinE與P21表達(dá)紊亂可引發(fā)細(xì)胞周期紊亂。

        本文結(jié)果顯示,大鼠海馬區(qū)注入Aβ1~42后,可上調(diào)CyclinE表達(dá),啟動(dòng)了神經(jīng)元的細(xì)胞周期;同時(shí)由于其神經(jīng)毒性,使P21的表達(dá)抑制,打破細(xì)胞周期的平衡狀態(tài),引發(fā)細(xì)胞凋亡。TMP可通過下調(diào)CyclinE蛋白表達(dá)和上調(diào)P21蛋白表達(dá)阻止細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期,減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡,從而延緩AD大鼠腦神經(jīng)病理進(jìn)程,減少Aβ對(duì)腦細(xì)胞神經(jīng)元的損傷,進(jìn)而改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

        1 Petrella JR,Coleman RE,Doraiswamy PM.Neuroimaging and early diagnosis of Alzheimer's disease:a look to the future〔J〕.Radiology,2003;226(2):315-36.

        2 黃文林,朱孝峰.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,2007:345-7.

        3 McPhie DL,Coopersmith R,Hines-Peralta A,etaI.DNA synthesis and neuronal apoptosis caused by familial Alzheimer's disease mutants of the amyloid precursor protein are mediated by the p21 activated kinase PAK3 〔J〕.J Neurosci,2003;23(17):6914-27.

        4 朱飛奇,馬 英,錢采韻.大鼠海馬立體定向注射Aβ 1-40建立阿爾茨海默病動(dòng)物模型〔J〕.鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008;27(2):106-8.

        5 劉潔生,陳 式,謝麗玲,彭志英.K-銀環(huán)蛇毒素對(duì)小鼠被動(dòng)學(xué)習(xí)和空間記憶的影響〔J〕.衛(wèi)生研究,1998;27(S1):96-9.

        6 莊 瑩,陳 杰.阿爾茨海默病病因及發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展〔J〕.吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào),2008;29(2):101-4.

        7 謝朝陽(yáng),祝其鋒.細(xì)胞周期調(diào)控與阿爾茨海默病的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2004;24(4):379-81.

        8 Vincent I,Rosado M,Davies P.Mitotic mechanisms in Alzheimer's disease〔J〕?J Cell Biol,1996;132(3):413-25.

        9 Obaya AJ,Sedivy JM.Regulation of cyclin-Cdk activity in mammalian cells〔J〕.Cell Mol Life Sci,2002;59(1):126-42.

        10 馬 驥,劉文超.細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑與腫瘤相關(guān)性的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)腫瘤生物治療雜志,2009;16(3):315-8.

        〔2015-11-17修回〕

        (編輯 袁左鳴)

        黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(H2015074);黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(20050222026);黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃項(xiàng)目(1252G059);佳木斯大學(xué)科技重點(diǎn)項(xiàng)目(Sz2011-009)

        柳朝陽(yáng)(1971-),男,碩士,副主任醫(yī)師,主要從事神經(jīng)干細(xì)胞和阿爾茨海默病機(jī)制研究。

        尹淑杰(1969-),女,副主任醫(yī)師,主要從事腦血管病、癲癇,頭痛及眩暈的診斷和治療研究。

        R749.16

        A

        1005-9202(2016)20-4961-02;

        10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.009

        1 濟(jì)寧市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

        2 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院

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