岳康異 楊甜 李新 楊?lèi)偡?戴舒惠 馬文科 蔣曉帆 羅鵬

(第四軍醫(yī)大學(xué)：1西京醫(yī)院神經(jīng)外科，2學(xué)員一旅;3西京醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710032；4西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西 西安 710061)

·論著·

Preso調(diào)控nNOS在神經(jīng)元機(jī)械性損傷中的作用

岳康異1,4楊甜1,2李新3楊?lèi)偡?戴舒惠1馬文科1蔣曉帆1羅鵬1*

(第四軍醫(yī)大學(xué)：1西京醫(yī)院神經(jīng)外科，2學(xué)員一旅;3西京醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710032；4西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西 西安 710061)

目的通過(guò)建立神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型，研究突觸后致密物質(zhì)(PSD)支架蛋白中的樹(shù)突棘突觸后致密物質(zhì)-95(PSD-95)相互作用調(diào)節(jié)蛋白(Preso)在創(chuàng)傷性腦損傷中的作用及調(diào)控機(jī)制。方法建立神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型，通過(guò)細(xì)胞活力和乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)神經(jīng)元損傷程度，并通過(guò)Western blot檢測(cè)明確Preso在損傷后的表達(dá)變化；利用Preso慢病毒過(guò)表達(dá)載體上調(diào)Preso在神經(jīng)元中的表達(dá)，通過(guò)細(xì)胞活力和LDH檢測(cè)明確上調(diào)Preso在神經(jīng)元損傷中的作用；利用神經(jīng)元特異性一氧化氮合酶(nNOS)特異性抑制劑ARL 17477，通過(guò)細(xì)胞活力和LDH檢測(cè)明確抑制nNOS對(duì)上調(diào)Preso調(diào)控神經(jīng)元損傷的影響。結(jié)果神經(jīng)元機(jī)械性損傷后，Preso表達(dá)無(wú)明顯改變，而上調(diào)Preso表達(dá)可加重神經(jīng)元損傷；利用nNOS特異性抑制劑ARL 17477可顯著改善神經(jīng)元損傷，并抑制上調(diào)Preso表達(dá)對(duì)神經(jīng)元損傷的影響。結(jié)論神經(jīng)元機(jī)械性損傷后，Preso可促進(jìn)神經(jīng)元損傷的形成，而nNOS是其重要的下游效應(yīng)分子。

創(chuàng)傷性腦損傷; 突觸后致密物質(zhì); 支架蛋白; 神經(jīng)元特異性一氧化氮合酶

世界衛(wèi)生組織的報(bào)告顯示，外傷是導(dǎo)致人群死亡或喪失正常生活能力的主要原因。在眾多外傷性疾病中，創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)的致殘、致死率最高，給傷者個(gè)人、家庭及社會(huì)帶來(lái)極大的負(fù)擔(dān)，是世界范圍內(nèi)亟待解決的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。突觸后致密物質(zhì)(postsynaptic density,PSD)是神經(jīng)元突觸后膜上一系列蛋白的統(tǒng)稱(chēng)，包括谷氨酸受體、支架蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子等上百種分子，與興奮性毒性損傷的調(diào)控密切相關(guān)[2]。大量的研究表明，PSD支架蛋白參與TBI后神經(jīng)元損傷的調(diào)節(jié)，是潛在的TBI治療關(guān)鍵點(diǎn)。

突觸后支架蛋白樹(shù)突棘突觸后致密物質(zhì)-95(PSD-95)相互作用調(diào)節(jié)蛋白(PSD-95 interacting regulator of spine morphogenesis,Preso)是一種包含多個(gè)蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域的PSD支架蛋白，可以同時(shí)連接谷氨酸受體及其他PSD支架蛋白，進(jìn)而參與突觸功能調(diào)控[3]。我們的前期研究證實(shí)，Preso可通過(guò)差異性調(diào)節(jié)代謝性谷氨酸受體和離子型谷氨酸受體的功能，影響神經(jīng)元興奮性毒性損傷，提示其可作為神經(jīng)元保護(hù)的重要靶點(diǎn)[4]。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究利用機(jī)械性神經(jīng)元損傷模型在離體神經(jīng)元上模擬TBI，旨在探討Preso在TBI后神經(jīng)元損傷中的作用及機(jī)制。

材料與方法

一、材料

孕14～16 d 昆明小鼠購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；Preso抗體購(gòu)自美國(guó)Ramp;D公司；β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；山羊抗兔二抗、兔抗小鼠二抗均購(gòu)自北京鼎國(guó)公司；神經(jīng)元特異性一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)特異性抑制劑ARL17477購(gòu)自英國(guó)Tocris公司；神經(jīng)元基質(zhì)培養(yǎng)基(neurobasal)、B27、10%胎牛血清、改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；多聚賴氨酸、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Preso慢病毒過(guò)表達(dá)載體(lentiviral vector-Preso,LV-Preso)、慢病毒對(duì)照載體(lentiviral vector-control,LV-Con)均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司；細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒、蛋白裂解液(radio immunoprecipitation assay,RIPA)、苯甲基磺酞氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)、凝膠電泳試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)公司。

二、方法

1.小鼠腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)：孕14～15 d昆明小鼠，常規(guī)處死后在無(wú)菌狀態(tài)下快速取出小鼠胚胎，在解剖顯微鏡下剝離小鼠胚胎大腦皮層。剪碎腦皮層，加入胰蛋白酶并置于37℃、5% CO2孵箱中消化20 min。在室溫下加入含10%胎牛血清的DMEM終止消化10 min，并在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中將組織塊吹打成細(xì)胞懸液。室溫靜置5 min，顯微鏡下計(jì)數(shù)，以2.5×105個(gè)細(xì)胞/cm2將細(xì)胞接種于6孔和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，神經(jīng)元體外培養(yǎng)2 w后備用。

2.體外培養(yǎng)神經(jīng)元機(jī)械性損傷：以10 μl的微量移液器塑料槍頭于6孔板內(nèi)劃割，造成神經(jīng)元機(jī)械性損傷，劃傷道寬度為1 mm，兩相鄰劃傷道間隔4 mm。依據(jù)預(yù)先在培養(yǎng)皿底面畫(huà)好的標(biāo)記線(9×9)劃割培養(yǎng)好的神經(jīng)元，標(biāo)記線均勻分布在培養(yǎng)皿底面，保證同一組內(nèi)的神經(jīng)元損傷程度和范圍一致。

3.神經(jīng)元轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前6 h對(duì)神經(jīng)元換液，按照1×105TU/ml的濃度分別加入LV-Preso和LV-Con，轉(zhuǎn)染48 h后在顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，72 h后可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組操作。

4.乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性測(cè)定：每培養(yǎng)皿收集100 μl培養(yǎng)基用于LDH活性測(cè)定，方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，反應(yīng)結(jié)束后在440 nm測(cè)定樣品吸光度計(jì)算LDH活性。標(biāo)準(zhǔn)以每克乳酸脫氫酶蛋白37℃與基質(zhì)作用15 min，反應(yīng)體系中產(chǎn)生1 μmol丙酮酸記為1 U LDH活性。

5.蛋白印跡法(Western blot)檢測(cè)蛋白表達(dá)：將損傷區(qū)域腦組織加入蛋白裂解液后在冰上進(jìn)行勻漿，完成后將組織勻漿離心30 min，取上清液進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)，并制備成Western Blot樣品。常規(guī)電泳，Preso一抗(1∶800)、β-actin一抗(1∶1 500)，顯色壓片后使用掃描儀采集電子圖像信息進(jìn)行分析。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示，通過(guò)GraphPad Prism software version 5.0對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。多區(qū)間數(shù)據(jù)比較采用雙因素方差分析(ANOVA)，若總體差異顯著，再以t檢驗(yàn)分析相應(yīng)兩組間的顯著性差別。以Plt;0.05為有顯著性差異。

結(jié) 果

一、神經(jīng)元機(jī)械性損傷后Preso的表達(dá)變化

在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)離體神經(jīng)元進(jìn)行機(jī)械性損傷，細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示，神經(jīng)元細(xì)胞活力隨損傷時(shí)間延長(zhǎng)不斷降低(圖1A)；LDH檢測(cè)結(jié)果顯示，LDH釋放含量隨損傷時(shí)間延長(zhǎng)不斷增加(圖1B)；這些結(jié)果提示機(jī)械性神經(jīng)元損傷模型造模成功。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，損傷后6 h、12 h、24 h神經(jīng)元中的Preso表達(dá)未見(jiàn)明顯變化(圖1C)，提示Preso在損傷后穩(wěn)定表達(dá)。

二、Preso在神經(jīng)元機(jī)械性損傷中的作用

利用LV-Preso和LV-Con對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行轉(zhuǎn)染，72 h后建立機(jī)械性神經(jīng)元損傷模型。Western blot結(jié)果顯示，LV-Preso轉(zhuǎn)染組與LV-Con組相比，Preso表達(dá)明顯上調(diào)(圖2A)；細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示，上調(diào)Preso表達(dá)顯著降低損傷后神經(jīng)元細(xì)胞活力(圖2B)；LDH檢測(cè)結(jié)果顯示，上調(diào)Preso表達(dá)顯著升高LDH釋放量(圖2C)。這些結(jié)果提示，Preso可促進(jìn)機(jī)械性神經(jīng)元損傷的形成。

三、nNOS在Preso調(diào)控神經(jīng)元機(jī)械性損傷中的作用

利用LV-Preso和LV-Con對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行轉(zhuǎn)染，72 h后建立機(jī)械性神經(jīng)元損傷模型，并給予nNOS特異性抑制劑ARL 17477(10 μM)。細(xì)胞活力檢測(cè)和LDH檢測(cè)結(jié)果顯示，與DMSO組相比，ARL 17477可明顯改善神經(jīng)元活力、減少LDH釋放(圖3)。然而，給予ARL 17477后，LV-Con組與LV-Preso組相比在細(xì)胞活力、LDH釋放上并無(wú)顯著差異(圖3)。以上結(jié)果提示，抑制nNOS活性可在神經(jīng)元機(jī)械性損傷后發(fā)揮保護(hù)作用，并明顯抑制Preso對(duì)神經(jīng)元損傷的影響，表明nNOS在Preso調(diào)控神經(jīng)元機(jī)械性損傷中發(fā)揮重要作用。

圖1 神經(jīng)元機(jī)械性損傷后細(xì)胞活力、LDH釋放及Preso表達(dá)的變化
Fig 1 Alterations of cell viability,LDH release,and Preso expression after neuronal mechanical injury
A:Cell viability assay showed a significant reduction of cell viability at 6 h,12 h,and 24 h after injury;B:LDH assay showed a significant elevation of LDH release at 6 h,12 h,and 24 h after injury;C:Western blot did not show a significant change of Preso expression after injury.
aPlt;0.05,vsCon.

圖2 上調(diào)Preso對(duì)神經(jīng)元機(jī)械性損傷的影響
Fig 2 Effects of Preso up-regulation on neuronal mechanical injury
A:Western blot showed a significant elevation of Preso expression in LV-Preso group;B:Cell viability assay showed a significant reduction of cell viability in LV-Preso after injury;C:LDH assay showed a significant elevation of LDH release in LV-Preso after injury.
aPlt;0.05,vsLV-Con.

圖3 nNOS抑制ARL 17477對(duì)Preso調(diào)控神經(jīng)元機(jī)械性損傷的影響
Fig 3 Effects of ARL 17477,a nNOS inhibitor,on regulation of neuronal mechanical injury by Preso
A:Cell viability assay showed a significant elevation of cell viability in ARL 17477 group,but no significant difference between LV-Con group and LV-Preso group after ARL 17477 treatment;B:LDH assay showed a significant reduction of LDH release in ARL 17477 group,but no significant difference between LV-Con group and LV-Preso group after ARL 17477 treatment.
aPlt;0.05,vsDMSO;bPlt;0.05,vsLV-Con.

討 論

PSD支架蛋白是PSD分子網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，一方面可通過(guò)PSD-95/Dlg/ZO-1(PDZ)結(jié)構(gòu)域(例如PSD-95)聚集PSD蛋白，發(fā)揮穩(wěn)定PSD結(jié)構(gòu)的作用；另一方面，PSD支架蛋白(例如Homer、Shank)通過(guò)相互連接形成一種分子網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)，為PSD中的受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白提供作用平臺(tái)，調(diào)節(jié)PSD功能[5]。早期的研究發(fā)現(xiàn)，TBI后PSD支架蛋白PSD-95、Homer1a及Homer1b/c表達(dá)均有所變化，提示TBI后突觸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。而近期的研究表明，PSD-95抑制劑ZL006可顯著降低TBI后腦水腫反應(yīng)，改善神經(jīng)功能，并抑制TBI后損傷灶周邊的氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]。此外，上調(diào)Homer1a或下調(diào)Homer1b/c能夠減輕TBI及興奮性毒性損傷引起的神經(jīng)元凋亡、腦組織破壞及神經(jīng)功能障礙[7,8]。以上結(jié)果證實(shí)，PSD支架蛋白不但是TBI后突觸結(jié)構(gòu)改變的標(biāo)志蛋白，同時(shí)也可作為潛在的功能性分子參與TBI病理過(guò)程。

Preso是一種包含多個(gè)蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域的PSD支架蛋白，可以同時(shí)連接PSD-95、mGluR和Homer，進(jìn)而參與突觸結(jié)構(gòu)與功能調(diào)節(jié)。研究表明，Preso羧基末端的PDZ結(jié)合結(jié)構(gòu)域可直接與PSD-95的PDZ結(jié)構(gòu)域相連，從而為PSD-95及其連接的N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)提供了分子作用平臺(tái)，使其構(gòu)成的NMDAR/PSD-95復(fù)合體在發(fā)揮調(diào)節(jié)突觸結(jié)構(gòu)和功能的作用[4]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Preso在神經(jīng)元中的表達(dá)，可明顯減輕神經(jīng)元谷氨酸興奮性毒性損傷，其具體機(jī)制與抑制NMDAR受體引起的Ca2+超載密切相關(guān)[5]。本研究證實(shí)，上調(diào)Preso在神經(jīng)元中的表達(dá)，可加重神經(jīng)元機(jī)械性損傷，進(jìn)一步說(shuō)明Preso可直接參與TBI后神經(jīng)元損傷的形成，而其作用機(jī)制與Preso調(diào)控NMDAR/PSD-95復(fù)合體下游信號(hào)密切相關(guān)。

PSD-95可通過(guò)2個(gè)不同的PDZ結(jié)構(gòu)域分別和NMDA受體及nNOS相結(jié)合，形成NMDAR/PSD-95/nNOS復(fù)合體，發(fā)揮促進(jìn)氧化應(yīng)激的作用。TBI后，nNOS選擇性結(jié)合環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)，通過(guò)亞硝基化激活COX-2，從而參與NMDAR介導(dǎo)的神經(jīng)毒性[9]。除NO外，線粒體內(nèi)Ca2+水平上調(diào)可引起包括超氧陰離子自由基在內(nèi)的ROS的產(chǎn)生。NO與ROS結(jié)合會(huì)形成具有高硝化活性的過(guò)氧亞硝基陰離子(ONOO-)。研究表明，TBI可產(chǎn)生大量的ONOO-，從而引起蛋白質(zhì)硝基化、脂質(zhì)過(guò)氧化和DNA斷裂，最終引起神經(jīng)細(xì)胞大量死亡[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，nNOS特異性抑制劑可有效抑制上調(diào)Preso所引起的神經(jīng)元過(guò)度損傷，證實(shí)nNOS是TBI后Preso調(diào)控NMDAR/PSD-95復(fù)合體的關(guān)鍵下游效應(yīng)分子。

本實(shí)驗(yàn)以PSD支架蛋白Preso為切入點(diǎn)，證實(shí)其在TBI后發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)元損傷的作用，并進(jìn)一步探討了nNOS作為其重要效應(yīng)分子在TBI中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。這些研究結(jié)果不但豐富了TBI的分子病理機(jī)制，同時(shí)為有效干預(yù)TBI后神經(jīng)元損傷提供了關(guān)鍵靶點(diǎn)。

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EffectsofPresoonregulationofnNOSafterneuronalmechanicalinjury

YUEKangyi1,3,YANGTian1,2,LIXin4,YANGYuefan1,DAIShuhui1,MAWenke1,JIANGXiaofan1,LUOPeng1

1DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,2FirstTroopsofUndergraduateStudents,3DepartmentofAnesthesiology,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032;4CollegeofMedicine,Xi'anJiaotongUniversity,Xi'an710061,China

ObjectiveThe role of postsynaptic density (PSD) scaffold protein PSD-95 interacting regulator of spine morphogenesis (Preso) in traumatic brain injury via establishment of neuronal mechanical injury model was investigated.MethodsAfter neuronal mechanical injury,neuronal injury was detected by cell viability and lactate dehydrogenase (LDH) assay;expression of Preso was detected by Western blot. After up-regulating Preso expression in neurons by transfection of lentiviral vector,neuronal injury was detected by cell viability and LDH assay. After administration of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) specific inhibitor,ARL 17477,neuronal injury was detected by cell viability and LDH assay.ResultsAfter neuronal mechanical injury,expression of Preso did not change. Overexpression of Preso reduced the neuronal injury. Neuronal injury was reversed by using ARL 17477. ARL 17477 suppressed the effects of Preso overexpression on neuronal injury.ConclusionPreso promotes the neuronal injury after neuronal mechanical injury and nNOS acts as an important downstream factor of Preso.

Traumatic brain injury;Postsynaptic density;Scaffold protein;Neuronal nitric oxide synthase

1671-2897(2016)15-510-04

R 651

A

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81301037,81371447)；陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014JM4200)；中國(guó)博士后基金資助項(xiàng)目(2015M572683)

岳康異，本科， E-mail:176214964@qq.com

*通訊作者：羅鵬，講師、主治醫(yī)師， E-mail:pengluo@fmmu.edu.cn

2016-07-08；

2016-10-10)