曹新廣 崔淵博 陳小兵 曹巍

(1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 普外科 河南 鄭州 450000； 2.鄭州市中心醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 河南 鄭州 450000)

?

食管鱗癌細(xì)胞中ESCCAL_1對(duì)蛋白激酶磷酸化的調(diào)節(jié)作用

曹新廣1崔淵博2陳小兵1曹巍2

(1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 普外科 河南 鄭州 450000； 2.鄭州市中心醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 河南 鄭州 450000)

目的 探討ESCCAL_1在食管鱗癌中發(fā)揮功能的可能機(jī)制。方法 使用人磷酸化激酶陣列試劑盒檢測(cè)ESCCAL_1敲減前后EC9706細(xì)胞中相關(guān)蛋白激酶磷酸化水平，對(duì)各蛋白條帶進(jìn)行灰度值定量分析。結(jié)果 KD組與NC組中FAK、JNK1、Src、AMPKα1等蛋白激酶的相對(duì)磷酸化水平比值分別為2.76∶1、2.20∶1、2.15∶1、2.01∶1，表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 ESCCAL_1可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白激酶的磷酸化水平調(diào)控EC9706細(xì)胞生長(zhǎng)。

食管鱗狀細(xì)胞癌；ESCCAL_1；蛋白激酶磷酸化

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的RNA，基因組中80%的轉(zhuǎn)錄本為L(zhǎng)ncRNA[1]。目前越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA參與了生命進(jìn)程中一系列重要的生命活動(dòng)，包括發(fā)育、造血、器官形成、凋亡、細(xì)胞增殖及腫瘤形成等[2]。前期研究中我們采用高通量篩查技術(shù)在食管鱗癌(esophageal squmaous cancer，ESCC)中發(fā)現(xiàn)表達(dá)差異最大的一種LncRNA位于8號(hào)染色體(Chr8：76121095～76189420)，其在ESCC組織中的表達(dá)顯著增高，約為癌旁組織的30倍。由于文獻(xiàn)中沒(méi)有關(guān)于該LncRNA的表達(dá)及功能的研究報(bào)道，我們將其命名為食管鱗狀細(xì)胞癌特異相關(guān)長(zhǎng)片段非編碼RNA_1(esophageal squmaous cancer associated LncRNA，ESCCAL_1)，初步研究表明其可能參與了ESCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，是潛在的診斷和預(yù)后標(biāo)志物[3]。為了探討ESCCAL_1在ESCC中發(fā)揮功能的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用人蛋白激酶磷酸化水平芯片陣列檢測(cè)ESCCAL_1敲減前后EC9706細(xì)胞系蛋白激酶磷酸化水平表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 ESCC EC-9706細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。慢病毒載體系統(tǒng)由pGC-LV載體、pHelper 1.0載體和 pHelper 2.0載體三質(zhì)粒組成，購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司。蛋白質(zhì)組分析陣列-人磷酸化激酶陣列試劑盒購(gòu)自R&D公司(美國(guó))。

靶向ESCCAL_1基因的慢病毒載體的構(gòu)建與生產(chǎn)：含干擾片段及無(wú)關(guān)序列的慢病毒載體委托上海吉?jiǎng)P公司合成。實(shí)驗(yàn)分為敲減組(ESCCAL_1-shNRA-EC9706轉(zhuǎn)染組，KD 組)、陰性對(duì)照組(即轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)系列，NC- ESCCAL_1-shNRA-EC9706，NC組)和空白對(duì)照組(不做任何處理，Con組)。

1.2 檢測(cè)方法 采用人蛋白激酶磷酸化芯片陣列檢測(cè)抑制ESCCAL_1表達(dá)后EC9706細(xì)胞蛋白激酶磷酸化相對(duì)水平，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并在伯樂(lè)成像系統(tǒng)中進(jìn)行掃描分析。用伯樂(lè)成像分析軟件對(duì)各蛋白膜進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算各蛋白激酶磷酸化相對(duì)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。表達(dá)水平差異的比較采用χ2檢驗(yàn)；多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

KD組與NC組中FAK、JNK1、Src、AMPKα1等蛋白激酶的相對(duì)磷酸化水平比值分別為2.76∶1、2.20∶1、2.15∶1、2.01∶1，表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1及圖1、圖2。

表1 人磷酸化激酶灰度值分析

圖1 芯片陣列檢測(cè)ESCCAL_1敲減前后EC9706中

圖2 芯片檢測(cè)蛋白激磷酸化相對(duì)水平

3 討論

LncRNA的作用機(jī)制非常復(fù)雜，至今人們知之甚少。近年來(lái)研究表明，LncRNA作為細(xì)胞功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中必需的生物分子，在染色體折疊組裝與穩(wěn)定、核小體形成、基因表達(dá)、信使RNA的選擇性剪輯以及蛋白質(zhì)形成等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前研究顯示，LncRNA位于增強(qiáng)子區(qū)域時(shí)，可調(diào)節(jié)蛋白-蛋白、蛋白-DNA的相互作用，也可以直接結(jié)合蛋白或miRNAs，可從復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等多種層面對(duì)細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)控，調(diào)控的主要方式是充當(dāng)信號(hào)分子、分子誘餌、蛋白復(fù)合體骨架等[4]，可以積累體細(xì)胞基因拷貝數(shù)變異(copy-number variations，CNAs)，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，一部分CNAs會(huì)引起腫瘤發(fā)生。有的LncRNA可以從多個(gè)層面，充當(dāng)多個(gè)角色，發(fā)揮極其復(fù)雜精確的調(diào)控功能。

Hu等[5]使用RNA pull down、Western blotting及RIP-qPCR確認(rèn)FAL1 RNA的結(jié)合蛋白為BMI1。BMI1是PRC1(polycomb repressive complex 1)復(fù)合體的一個(gè)亞基，PRC1是染色體修飾復(fù)合物，可抑制多種基因表達(dá)。shRNA沉默F(xiàn)AL1或BMI1，發(fā)現(xiàn)表達(dá)量增加最多的是CDKN1A基因，該基因與癌癥發(fā)生有關(guān)，說(shuō)明FAL1可能通過(guò)調(diào)控BMI1在CDKN1A啟動(dòng)子的結(jié)合率而控制CDKN1A的轉(zhuǎn)錄，提高CDKN1A的表達(dá)。另有研究采用LncRNA芯片發(fā)現(xiàn)MEG3在肝癌中的特異性表達(dá)下調(diào)。對(duì)MEG3表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究認(rèn)為，MEG3的表達(dá)下調(diào)可能是因?yàn)镸EG3啟動(dòng)子發(fā)生了超甲基化，即LncRNA的表達(dá)同樣可能受到表觀遺傳調(diào)控；MEG3啟動(dòng)子的超甲基化可能是與microRNA-29a 調(diào)控通路相互作用的結(jié)果，從而認(rèn)為miRNA和LncRNA可以相互作用而參與基因表達(dá)調(diào)控[6]。MALAT1也稱為NEAT2(nuclear-enriched abundant transcript 2)，目前研究較多。Wang等[7]研究表明，在ESCC細(xì)胞系中miRNA-101和miRNA-217通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制使MALAT1表達(dá)沉默，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。MALAT1的5’端可以與SR剪切蛋白家族中的多種因子結(jié)合，改變SR蛋白的磷酸化與去磷酸化，影響其活性；通過(guò)影響SR蛋白的空間，調(diào)控其對(duì)pre-mRNA的剪接作用[8]。

蛋白激酶(protein Kinases，PK)是一類催化蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)的酶，是一個(gè)非常龐大的功能性蛋白家族。它能把腺苷三磷酸(ATP)上末位的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的特定氨基酸殘基上。根據(jù)被磷酸化底物蛋白的氨基酸殘基種類，蛋白激酶共分為5類，即絲氨酸/蘇氨酸、酪氨酸、組氨酸、色氨酸和天冬氨?；?谷氨酰基蛋白激酶。蛋白激酶的調(diào)控功能非常強(qiáng)大，涉及面廣，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、免疫和炎癥反應(yīng)等復(fù)雜生命活動(dòng)中均起著非常重要的作用。近年來(lái)科研人員發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶還和腫瘤細(xì)胞的增殖、分化以及腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，如局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)[9]。隨后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK可通過(guò)調(diào)控多條信號(hào)通路參與腫瘤生長(zhǎng)、發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，并與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)[10-11]。近年來(lái)，研究人員已開(kāi)發(fā)多種靶向藥物并應(yīng)用于臨床，抑制PK活性以殺死或控制癌細(xì)胞。如在 ER(+)乳腺癌中，三苯氧胺可通過(guò)調(diào)節(jié)PKC活性抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[12]；吉非替尼和厄洛替尼作為酪氨酸激酶抑制劑用于治療肺癌等。本研究中使用人磷酸化激酶陣列試劑盒檢測(cè)抑制ESCCAL_1表達(dá)后EC9706中磷酸蛋白激酶的表達(dá)，用軟件對(duì)各蛋白條帶進(jìn)行灰度值定量分析。結(jié)果顯示， NC組與敲減組相比，F(xiàn)AK、JNK1、Src、AMPKα1、Chk2和GSK3α/β相對(duì)水平比值分別為2.76∶1、2.20∶1、2.15∶1、2.01∶1，1.51∶1、1.44∶1，敲減組表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。這提示在體外食管癌細(xì)胞系中，ESCCAL_1能與多種蛋白激酶作用，引起這些蛋白激酶磷酸化，參與食管癌的發(fā)生發(fā)展。當(dāng)然，進(jìn)一步的研究需驗(yàn)證這些蛋白激酶磷酸化在食管癌中的作用，ESCCAL_1與蛋白激酶的作用機(jī)制，并明確這些激酶之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)對(duì)話，對(duì)食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制有進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。

[1] Kapranov P, Cheng J, Dike S, et al. RNA maps reveal new RNA classes and a possible function for pervasive transcription[J]. Science, 2007, 316(5830): 1484-1488.

[2] Ponting C P, Oliver P L, Reik W. Evolution and functions of long noncoding RNAs[J]. Cell, 2009, 136(4): 629-641.

[3] Cao W, Wu W, Shi F, et al. Integrated analysis of long noncoding RNA and coding RNA expression in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Int J Genomics, 2013, 2013: 480534.

[4] Rinn J L, Kertesz M, Wang J K, et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs[J]. Cell, 2007, 129(7): 1311-1323.

[5] Hu X, Feng Y, Zhang D, et al. A functional genomic approach identifies FAL1 as an oncogenic long noncoding RNA that associates with BMI1 and represses p21 expression in cancer[J]. Cancer Cell, 2014, 26(3): 10.

[6] Braconi C, Kogure T, Valeri N, et al. microRNA-29 can regulate expression of the long non-coding RNA gene MEG3 in hepatocellular cancer [J]. Oncogene, 2011, 30(47): 7.

[7] Wang X, Li M, Wang Z, et al. Silencing of long noncoding RNA MALAT1 by miR-101 and miR-217 inhibits proliferation, migration, and invasion of esophageal squamous cell carcinoma cells[J]. J Biol Chem, 2015, 290(7): 3925-3935.

[8] Lin R, Roychowdhury-Saha M, Black C, et al. Control of RNA processing by a large non-coding RNA over-expressed in carcinomas[J]. FEBS Lett, 2011, 585(4): 671-676.

[9] Luo M, Guan J L. Focal adhesion kinase: a prominent determinant in breast cancer initiation, progression and metastasis[J]. Cancer Lett, 2010, 289(2): 127-139.

[10]Ou J, Pan F, Geng P, et al. Silencing fibronectin extra domain A enhances radiosensitivity in nasopharyngeal carcinomas involving an FAK/Akt/JNK pathway[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2012, 82(4): e685-e691.

[11]Zhao X, Guan J L. Focal adhesion kinase and its signaling pathways in cell migration and angiogenesis[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2011, 63(8): 610-615.

[12]Gundimeda U, Chen Z H, Gopalakrishna R. Tamoxifen modulates protein kinase C via oxidative stress in estrogen receptor-negative breast cancer cells[J]. J Biol Chem, 1996, 271(23): 13504-13514.

Regulatory effects of ESCCAL_1 on protein kinase phosphorylation in esophageal squamous cell carcinoma

Cao Xinguang1, Cui Yuanbo2, Chen Xiaobing1, Cao Wei2

(1.DepartmentofGeneralSurgery,theAffiliatedCancerHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450003,China;2.DepartmentofTranslationalMedicineCenter,ZhengzhouCenterHospital,Zhengzhou450007,China)

Objective To explore the possible mechanism of ESCCAL_1 in esophageal squamous cell carcinoma. Methods Human phospho-kinase array kit was used to detect the phosphorylation of protein kinase in EC9706 cells transfected with ESCCAL_1-shRNA or control. Each gray value of protein band was quantitatively analyzed.Results The relative gray value ratios of FAK、pJNK1、pSrc、pAMPKα1 between KD group and NC group were 2.76∶1, 2.20∶1, 2.15∶1, 2.01∶1 respectively, and the phosphorylation of these protein kinases in KD group was significantly down-regulated (P<0.05).Conclusion ESCCAL_1 may regulate the EC9706 cell proliferation and metastasis through protein kinase phosphorylation.

esophageal squamous cancer; ESCCAL_1; protein kinase phosphorylation

曹巍，E-mail：xinguangcao@126.com。

R 735.1

10.3969/j.issn.1004-437X.2016.10.002

2016-03-17)