高兵兵，秦 浩,秦家振,孫移坤,張昊駒,劉 晨，侯江雷，黃佛寶，羅 丹，戴宜武

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TPD52在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平及臨床意義

高兵兵1，秦 浩1,秦家振2,孫移坤2,張昊駒1,劉 晨2，侯江雷2，黃佛寶2，羅 丹2，戴宜武1

目的 探究TPD52在膠質(zhì)瘤及正常腦組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法 收集46例膠質(zhì)瘤患者病例標(biāo)本及瘤旁正常腦組織，應(yīng)用熒光定量PCR、Western blot、免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)TPD52 mRNA、蛋白的表達(dá)量，并分析臨床指標(biāo)與TPD52表達(dá)量之間的關(guān)系。結(jié)果 熒光定量PCR及Western blot結(jié)果具有一致性，均提示TPD52的表達(dá)量隨膠質(zhì)瘤病理分級(jí)升高，Ⅲ、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤TPD52表達(dá)量明顯高于正常腦組織、Ⅰ、Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫組織化學(xué)染色顯示TPD52蛋白定位在膠質(zhì)瘤細(xì)胞質(zhì)中，67.4%病理標(biāo)本高表達(dá)TPD52(或)。結(jié)論 TPD52 mRNA與蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，其蛋白表達(dá)量與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)呈正相關(guān)性，與生存期呈負(fù)相關(guān)性，其可能是膠質(zhì)瘤臨床治療的一個(gè)潛在基因靶點(diǎn)。

膠質(zhì)瘤；TPD52；病理分級(jí)；生存期

腦膠質(zhì)瘤是發(fā)病率最高的顱內(nèi)惡性腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的一半[1]，平均生存期僅為9～12個(gè)月[2]。雖然臨床上“手術(shù)+放療+化療”[3]為主的綜合治療發(fā)揮到極致，但由于膠質(zhì)瘤的浸潤(rùn)性、放療的低敏感性、血腦屏障對(duì)化療藥物的阻隔性，患者預(yù)后仍未明顯改善。因此，研究者把目光轉(zhuǎn)向基因治療，經(jīng)過(guò)多年的探索，基因治療有望成為人類(lèi)戰(zhàn)勝腫瘤的手段之一，而靶基因的篩選是基因治療的核心。TPD52是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因，其位于8q12染色體上，由200余個(gè)氨基酸組成[4]。TPD52基因被發(fā)現(xiàn)已有二十年，但對(duì)其作用的研究仍剛剛起步。目前為止，TPD52在膠質(zhì)瘤的作用仍未被報(bào)道。該研究通過(guò)檢測(cè)TPD52在原發(fā)惡性膠質(zhì)瘤以及瘤旁正常腦組織中的表達(dá)水平，分析其在膠質(zhì)瘤中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料 膠質(zhì)瘤標(biāo)本來(lái)源于2007年1月～2012年1月北京軍區(qū)總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院膠質(zhì)瘤患者46例，其中男20例，女26例；年齡37～75(62.3±3.2)歲。按照WHO病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)，其中Ⅰ級(jí)4例，Ⅱ級(jí)15例，Ⅲ級(jí)14例，Ⅳ級(jí)13例。隨訪(fǎng)時(shí)間為3年。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：① 患者均為原發(fā)膠質(zhì)瘤且第一次行膠質(zhì)瘤全切術(shù)；② 術(shù)后行規(guī)范化放療加替莫唑胺化療；③ 患者無(wú)其他惡性腫瘤、全身系統(tǒng)性疾病及免疫性疾病。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：① 患者術(shù)后復(fù)發(fā)，再次手術(shù)；② 非正常死亡患者。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 一抗：人TPD52抗體購(gòu)自英國(guó)Abcom公司(ab132140)；BCA蛋白分析試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(北京天根生物有限公司)；引物由生工生物(北京)工程有限公司合成。

1.3 免疫組化 膠質(zhì)瘤標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片、脫蠟、水化，PBS沖洗3遍，3% H2O2阻斷，PBS再次沖洗3遍，抗原修復(fù)，山羊血清封閉，加一抗(1 ∶1 000稀釋)后4 ℃過(guò)夜，PBS沖洗3遍，滴加二抗后37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3遍，加SP后37 ℃孵育30 min，DAB顯色5 min，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片。通過(guò)陽(yáng)性細(xì)胞染色率與染色濃度方式評(píng)估TPD52蛋白表達(dá)量。陽(yáng)性細(xì)胞染色率得分：0(<5%,陰性)，1(5%～25%，弱陽(yáng)性)，2(25%～50%，陽(yáng)性)，3(>50%，強(qiáng)陽(yáng)性)。細(xì)胞染色濃度得分：0(未染色)，1(淡黃色)，2(棕黃色)，3(棕褐色)。免疫組化最終得分等于陽(yáng)性細(xì)胞染色率×細(xì)胞染色濃度，為0～9分。TPD52表達(dá)水平分為：-(0～1分)，+(2～3分)，(4～6分)，(7～9分)。病理樣本分為：TPD52低表達(dá)組(TPD52-或TPD52+)，TPD52高表達(dá)組(TPD52或TPD52)。

1.4 TPD52 mRNA提取、逆轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR 取約60 g凍存腦組織研磨成粉，總RNA的提取采用TRIzol法，分光光度計(jì)測(cè)量總RNA在260/280下的濃度及純度。然后，取1 μg總RNA，行逆轉(zhuǎn)率得到cDNA。最后將cDNA適當(dāng)稀釋后行熒光定量PCR擴(kuò)增評(píng)估TPD52表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系20 μl，包括2 μl cDNA、2×SYBR Premix Ex TaqⅡ、0.4 μl 50×ROX Reference Dye、各0.8 μl上下游引物、6 μl無(wú)菌離子水。循環(huán)參數(shù)設(shè)置如下：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，總共40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：TPD52 上游引物:5′-TTCACAGGCAGGACAGAAAGA-3′,下游引物:5′-TTGAAGGTCGCAGAGTTCCT-3′;β-actin上游引物：5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′,下游引物:5′-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3′。采用2-ΔΔCt方法分析結(jié)果。

1.5 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)量 從液氮中取出冰凍的組織標(biāo)本，提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。8% SDS-PAGE膠電泳分離含25 μg的蛋白樣品，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，脫脂奶粉室溫封閉1 h，加一抗TPD52(1 ∶1 000)、GAPHD(1 ∶2 000),4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗PVDF膜3遍，加二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，再次TBSA洗PVDF膜3遍，顯色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行分析，組間、組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，TPD52蛋白表達(dá)量與患者年齡、性別的關(guān)系采用Spearman法分析，TPD52蛋白表達(dá)量與患者生存期的關(guān)系采用Kaplan-Meier方法。

2 結(jié)果

2.1 TPD52 mRNA在膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達(dá)水平 由于執(zhí)行PCR擴(kuò)增需要約60 g組織提取總mRNA，部分病理標(biāo)本體積較小，無(wú)法從瘤旁正常腦組織提取足夠的總mRNA，因此，選擇其中35例來(lái)執(zhí)行熒光定量PCR分析。經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行Ct值計(jì)算分析，瘤旁正常腦組織、膠質(zhì)瘤組織ΔCt值分別為5.02±0.34、1.14±0.20，采用配對(duì)t檢驗(yàn)方法，結(jié)果顯示與瘤旁正常腦組織比較，TPD52 mRNA表達(dá)量在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中顯著增高(P<0.01)。而且TPD52 mRNA表達(dá)量隨膠質(zhì)瘤病理分級(jí)升高而升高(圖1)，Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ的ΔCt值分別為1.45±0.31、0.73±0.47，在Ⅲ、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)量明顯高于Ⅰ、Ⅱ級(jí)，表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 TPD52 mRNA在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤與瘤旁正常腦組織中的表達(dá)量

A：瘤旁正常腦組織；B：Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤；C：Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤；D：Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤；E：Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤

2.2 免疫組化結(jié)果 通過(guò)免疫組織化學(xué)染色顯示在膠質(zhì)瘤標(biāo)本中TPD52蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。在不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤中TPD52蛋白表達(dá)均為陽(yáng)性，其中31例(67.4%)高表達(dá)TPD52(或)，其余15例低表達(dá)TPD52(-或+),而瘤旁正常腦組織中僅5例低表達(dá)TPD52(-或+)，表達(dá)陽(yáng)性率為10.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TPD52蛋白隨膠質(zhì)瘤病理分級(jí)升高而增高，Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤與Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤、Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤與Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤TPD52 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ⅲ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中TPD52蛋白的表達(dá)量明顯高于Ⅰ～Ⅱ膠質(zhì)瘤中，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

2.3 Western blot法檢測(cè)蛋白量結(jié)果 TPD52蛋白表達(dá)量與TPD52 mRNA表達(dá)量具有一致性。與瘤旁正常腦組織比較，膠質(zhì)瘤明顯高表達(dá)TPD52蛋白(圖3)。TPD52蛋白表達(dá)量隨膠質(zhì)瘤級(jí)別升高而增加。在Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中表達(dá)量最高，Western blot條帶灰度值最高，在正常腦組織中表達(dá)量最低，Western blot條帶灰度值最低,TPD52蛋白在瘤旁正常腦組織、Ⅰ～Ⅱ膠質(zhì)瘤、Ⅲ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 TPD52 蛋白在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)量 免疫組化×200

圖3 TPD52蛋白在4組配對(duì)膠質(zhì)瘤與瘤旁正常腦組織中的表達(dá)

A：瘤旁正常腦組織；B：Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤；C：Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤；D：Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤；E：Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤

2.4 TPD52表達(dá)量與臨床指標(biāo)的關(guān)系 經(jīng)對(duì)患者年齡、性別、WHO病理分級(jí)、生存期臨床指標(biāo)與TPD52蛋白表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表3)，結(jié)果顯示年齡、性別與TPD52蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而病理分級(jí)與TPD52蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)性，生存期與TPD52蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)性，高表達(dá)TPD52蛋白患者(中位生存期11.74個(gè)月)比低表達(dá)TPD52蛋白患者(中位生存期23.32個(gè)月)生存期短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

表3 膠質(zhì)瘤中TPD52表達(dá)量與臨床指標(biāo)的關(guān)系(n)

3 討論

腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是涉及多種基因相互作用的復(fù)雜過(guò)程，包括一系列突變基因的積累、原癌基因的激活、抑癌基因的失活。因此，基因治療成為人類(lèi)戰(zhàn)勝腫瘤的手段之一，而靶基因的篩選是基因治療的核心。

圖4 TPD52表達(dá)量與患者生存期的關(guān)系

TPD52是一種原癌基因，由200余個(gè)氨基酸編碼，位于8q12染色體上，這段區(qū)域在多種腫瘤中頻繁擴(kuò)增，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。TPD52被首先報(bào)道在乳腺癌[5]中過(guò)度表達(dá)。后續(xù)研究[6]顯示TPD52在肺癌、前列腺癌、卵巢癌、B細(xì)胞淋巴瘤等惡性腫瘤中表達(dá)增高。

Chen et al[7]發(fā)現(xiàn)肺癌組織比正常肺組織中的TPD52表達(dá)增高，Lewis et al[8]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TPD52促進(jìn)肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移。Wang et al[9]發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中TPD52表達(dá)量升高，前列腺癌病理分級(jí)越高其表達(dá)量越高，且預(yù)示著差的術(shù)后生存期。Byrne et al[10]發(fā)現(xiàn)TPD52在卵巢癌中表達(dá)量同樣升高，且與患者生存期呈負(fù)相關(guān)性。Ummanni et al[11]報(bào)道TPD52在乳腺癌中的高表達(dá)與不良的預(yù)后有關(guān)，且促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的擴(kuò)增、侵襲。以上這些研究結(jié)果，說(shuō)明TPD52是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展一種生物標(biāo)志物，可能是基因治療的靶點(diǎn)。研究[7,9,11]表明TPD52在多種腫瘤組織中表達(dá)升高，與腫瘤分級(jí)、預(yù)后密切相關(guān)，參與腫瘤發(fā)生、擴(kuò)增、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等進(jìn)程。Yang et al[12]敲除乳腺癌中TPD52基因后，發(fā)現(xiàn)這可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖及集落形成，使細(xì)胞周期停留在G0/G1期，促進(jìn)GSK3β磷酸化作用。Mirshahidi et al[13]經(jīng)過(guò)對(duì)TPD52基因研究，對(duì)乳腺癌小鼠模型采取TPD52基因治療后，可明顯延長(zhǎng)模型鼠生存期。進(jìn)一步證實(shí)了TPD52在惡性腫瘤治療中擁有廣泛的前景。

目前國(guó)際上關(guān)于TPD52在腫瘤中的表達(dá)水平、臨床意義及相關(guān)機(jī)制的報(bào)道仍很少，國(guó)內(nèi)暫無(wú)此有關(guān)報(bào)道。本研究數(shù)據(jù)首次證實(shí)TPD52在膠質(zhì)瘤組織中過(guò)度表達(dá)，瘤旁正常腦組織中不表達(dá)或少量表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)TPD52表達(dá)量與患者術(shù)后生存期呈負(fù)相關(guān)性。同時(shí)，本研究數(shù)據(jù)表明TPD52的表達(dá)量隨病理分級(jí)升高而升高，這表明TPD52具有促進(jìn)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的作用。因此，TPD52可能是膠質(zhì)瘤分化程度及術(shù)后生存期的分子生物學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，推測(cè)TPD52對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展具有一定的影響和促進(jìn)作用，可能是反應(yīng)膠質(zhì)瘤惡性程度和預(yù)后的標(biāo)志物，這提示TPD52是膠質(zhì)瘤臨床治療的一個(gè)潛在基因靶點(diǎn)，為在膠質(zhì)瘤治療的研究中提供了新的思路和基因靶點(diǎn)。由于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多種基因相互的結(jié)果，TPD52在膠質(zhì)瘤中具體機(jī)制尚不清楚，需要更深入的研究進(jìn)行闡明。

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Expression level of TPD52 in gliomas and its clinical significance

Gao Bingbing1,Qin Hao1,Qin Jiazhen2，et al

(1AffiliatedBayiBrainHospitalofGeneralHospitalofBeijingMilitaryCommand,AnhuiMedicalUniversity,Beijing100000；2AffiliatedBayiBrainHospitalofGeneralHospitalofBeijingMilitaryCommand,Beijing100000)

ObiectiveToexploretheexpressionoftumorproteinD52(TPD52 )inhumangliomaandnormalbraintisseanditsclinicalsignificance.MethodsCollectingspecimensof46casesofgliomasandnormalbraintissueadjacenttotumours.TheexpressionofTPD52wasinvestigatedbyreal-timequantitativePCR,Westernblotandimmunohistochemistryingliomas.TherelationshipsbetwenTPD52espressionandclinicalfactorswereanalyzed.ResultsTheresultsofreal-timequantitativePCRandWesternblotshowedthattheexpressionofTPD52mRNAandproteinsignificantlyincreasedingliomatissuesascomparedwiththoseinnormalbraintissues．Immunohistochemistrydisplayedthat67.4%gliomatissuesexpressedhigherTPD52protein.ConclusionTheexpressionsofTPD52mRNAandproteinaresignificantlyhigheringliomathannormalbraintisse,andtheexpressionofTPD52proteinispositivelyassociatedwithgliomaWHOclassificationandnegativelyassociatedwithpatientslifetime.Itmaybeapotentialtargetgenestotreatgliomas.

glioma;TPD52;pathologicalgrade;lifetime

時(shí)間：2016-8-10 11:04:49

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.028.html

2016-05-19接收

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81271391)

1安徽醫(yī)科大學(xué)北京軍區(qū)總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院，北京 100000

2北京軍區(qū)總醫(yī)院附屬八一醫(yī)院腦科醫(yī)院，北京 100000

高兵兵，男，碩士研究生；

戴宜武，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：dddyyywww@163.com

R 730.26

A

1000-1492(2016)10-1521-04

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.028