李盈龍，馬 應(yīng)，王李松，蔣正軒

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翼狀胬肉中MMP-9、TIMP-1及VEGF的表達(dá)及意義

李盈龍，馬 應(yīng)，王李松，蔣正軒

目的 比較金屬基質(zhì)蛋白酶-9(MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP-1)、新生血管因子(VEGF)在翼狀胬肉中的表達(dá)，探討3者在翼狀胬肉中的作用。方法 收集復(fù)發(fā)性翼狀胬肉患者翼狀胬肉標(biāo)本38例、初發(fā)性翼狀胬肉患者翼狀胬肉標(biāo)本47例和斜視患者球結(jié)膜標(biāo)本32例。采用免疫組化法檢測85例翼狀胬肉和32例正常人球結(jié)膜中MMP-9、TIMP-1及VEGF的表達(dá)，比較MMP-9、TIMP-1及VEGF在3組中的表達(dá)差異，分析3者在翼狀胬肉中表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 復(fù)發(fā)性翼狀胬肉和初發(fā)翼狀胬肉標(biāo)本均有MMP-9、TIMP-1和VEGF的表達(dá)，MMP-9、TIMP-1和VEGF在復(fù)發(fā)翼狀胬肉和初發(fā)翼狀胬肉中陽性表達(dá)均顯著高于正常球結(jié)膜。經(jīng)相關(guān)檢驗分析，在翼狀胬肉中，MMP-9和VEGF的陽性表達(dá)存在相關(guān)性；而TIMP-1與VEGF表達(dá)間無顯著相關(guān)性。結(jié)論MMP-9在翼狀胬肉發(fā)生和復(fù)發(fā)過程中發(fā)揮重要作用。其可能通過破壞細(xì)胞外基質(zhì)的屏障和促進(jìn)VEGF產(chǎn)生來調(diào)控翼狀胬肉的發(fā)生和復(fù)發(fā)。細(xì)胞外基質(zhì)屏障的打破可能是翼狀胬肉發(fā)病的基礎(chǔ)。

細(xì)胞外基質(zhì)；翼狀胬肉；復(fù)發(fā)；免疫組織化學(xué)；新生血管

翼狀胬肉是我國眼科常見病和多發(fā)病。眼球的瞼裂部球結(jié)膜和結(jié)膜下組織變性增生，并向角膜侵潤，外觀呈三角形[1]。翼狀胬肉的病因復(fù)雜，是環(huán)境因素和自身因素共同作用的結(jié)果，但其確切的發(fā)病機(jī)制至今尚不完全清楚。一致認(rèn)為，在紫外線等外界因素的作用下，瞼裂區(qū)的球結(jié)膜變性及纖維血管組織大量增生，且有較強(qiáng)侵襲能力；同時外界的危險因素?fù)p傷了角膜緣的干細(xì)胞，使增生的組織侵入透明的角膜組織，逐漸增大覆蓋角膜[1-2]。由此可見，在翼狀胬肉發(fā)病過程中，纖維血管組織的增生和不斷的侵襲是翼狀胬肉形成的基礎(chǔ)，細(xì)胞間基質(zhì)屏障和角膜緣屏障的破壞可能是該病進(jìn)展的主要原因。

金屬基質(zhì)蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)是降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要酶類，幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的全部成分。其可能通過破壞細(xì)胞外基質(zhì)的降解平衡而促進(jìn)病變的組織增生侵襲，突破細(xì)胞外基質(zhì)的組織屏障，從而侵襲周圍的組織[3]。MMP-9是依賴金屬鋅離子的金屬酶，其底物廣泛，是當(dāng)今研究熱點[4]。基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(matrixmetalloproteinaseinhibitor，TIMP)是MMP的抑制劑，能抑制MMP活性及其生物學(xué)功能，防止細(xì)胞外組織屏障的破壞。人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)4種TIMP，其中TIMP-1被廣泛研究[5]。然而，這2種蛋白酶在復(fù)發(fā)、初發(fā)翼狀胬肉中的作用及機(jī)制尚不清楚。該研究利用免疫組化法檢測復(fù)發(fā)、初發(fā)翼狀胬肉及正常球結(jié)膜組織中MMP-9、TIMP-1及新生血管的表達(dá)差異，從而闡明MMP在翼狀胬肉發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集 收集2012年7月～2015年2月行翼狀胬肉切除手術(shù)獲得38例復(fù)發(fā)翼狀胬肉組織、47例初發(fā)翼狀胬肉組織及32例正常人球結(jié)膜組織。3組人群年齡、性別均相互匹配。

1.2 試劑 鼠抗促血管生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)及兔抗MMP-9多克隆抗體、二步法免疫組化檢測試劑及DAB試劑盒購自北京中衫金橋公司；兔抗TIMP-1多克隆抗體購自北京生物合成技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1HE染色 翼狀胬肉及正常球結(jié)膜組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)組織切片，HE染色，鏡下觀察并比較各組織的病理狀況。在同一個顯微鏡下對切片的著色顆粒進(jìn)行檢測計數(shù)，比較其是否有差異。免疫組織化學(xué)方法采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法，即SP法。

1.3.2 免疫組化 復(fù)發(fā)、初發(fā)翼狀胬肉及正常人球結(jié)膜組織收集后，立即采用10%福爾馬林固定，然后石蠟包埋，再進(jìn)行標(biāo)記切片。運(yùn)用二步法進(jìn)行染色，步驟如下：常規(guī)脫蠟，水化組織切片，將切片放入3%過氧化氫去離子水中孵育5min(阻斷內(nèi)源性過氧化物酶)，再用PBS沖洗；滴加一抗，4 ℃過夜，PBS沖洗，每次2min，沖洗3次；滴加通用型IgG抗體-HRP多聚體，37 ℃孵育20min，PBS沖洗，每次2min，沖洗3次；DAB顯色，再用蘇木精復(fù)染，然后封片觀察。在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行染色參數(shù)分析，并做統(tǒng)計。

1.3.3 免疫組化著色顆粒的計數(shù) 在100倍顯微鏡下觀察切片中的著色細(xì)胞數(shù)，記錄每個切片中的數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，計量資料使用方差分析，計數(shù)資料使用χ2檢驗。P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)發(fā)翼狀胬肉、初發(fā)翼狀胬肉和人類正常球結(jié)膜組織病理學(xué)變化 通過對復(fù)發(fā)、初發(fā)的翼狀胬肉和正常人球結(jié)膜的HE染色結(jié)果示：復(fù)發(fā)翼狀胬肉的表層上皮層明顯增厚，上皮細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞體積增大，基底上皮邊界模糊，間質(zhì)中大量血管。初發(fā)翼狀胬肉的上皮細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞體積及細(xì)胞核增大，基底層邊界不清，間質(zhì)層可見較多的血管。正常人球結(jié)膜表層上皮層較翼狀胬肉組薄，上皮細(xì)胞排列極為整齊，基底細(xì)胞邊界清晰，間質(zhì)中血管較少，見圖1。

2.2 復(fù)發(fā)翼狀胬肉、初發(fā)翼狀胬肉和正常人球結(jié)膜中TIMP-1、MMP-9及VEGF的表達(dá)TIMP-1表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)中，在復(fù)發(fā)胬肉、初發(fā)胬肉和正常人球結(jié)膜組織中表達(dá)陽性率約90%。在復(fù)發(fā)的翼狀胬肉組織中，TIMP-1大量表達(dá)于近基底膜的上皮細(xì)胞質(zhì)中，間質(zhì)的成纖維細(xì)胞也有染色。在初發(fā)翼狀胬肉中，TIMP-1陽性顆粒主要位于上皮細(xì)胞中，集中于基底膜，較復(fù)發(fā)胬肉組少。在正常球結(jié)膜組織中TIMP-1陽性表達(dá)主要位于上皮細(xì)胞，分布較為彌散，基底膜較前兩組少，見圖2。

MMP-9免疫組化結(jié)果顯示：MMP-9表達(dá)主要位于炎癥細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核膜上，細(xì)胞質(zhì)也有染色，呈棕黃色顆粒。在復(fù)發(fā)翼狀胬肉組織中，可見大量的棕黃色顆粒。在初發(fā)翼狀胬肉組織中，基底膜下方及血管周圍均有棕黃色的顆粒著色，較復(fù)發(fā)組少。在正常球結(jié)膜組織中MMP-9僅有少量陽性表達(dá)，見圖3。

VEGF免疫組化結(jié)果顯示：呈棕黃色的顆粒，位于間質(zhì)層、上皮層和血管壁上。在復(fù)發(fā)翼狀胬肉組織中，可見大量的棕黃色顆粒位于復(fù)發(fā)翼狀胬肉間質(zhì)層中，上皮層中均有表達(dá)。在初發(fā)翼狀胬肉組織中，間質(zhì)層有VEGF棕黃色的顆粒物表達(dá)，上皮層中有表達(dá)。在正常球結(jié)膜組織中上皮層有表達(dá)，間質(zhì)層中表達(dá)很少，見圖4。

圖1 復(fù)發(fā)、初發(fā)翼狀胬肉和正常球結(jié)膜組織 HE×400

圖2 人正常球結(jié)膜與翼狀胬肉中TIMP-1的表達(dá) 免疫組化×400

圖3 人正常球結(jié)膜與翼狀胬肉中MMP-9的表達(dá) 免疫組化×200

圖4 人正常球結(jié)膜與翼狀胬肉中VEGF的表達(dá) 免疫組化×400

顯微鏡下相同倍率的視野下著色顆粒的計數(shù)見表1。結(jié)果表明TIMP-1、MMP-9和VEGF在復(fù)發(fā)翼狀胬肉和初發(fā)翼狀胬肉組織明顯高于正常球結(jié)膜組織；進(jìn)一步分析，其在復(fù)發(fā)翼狀胬肉組織的表達(dá)明顯高于初發(fā)翼狀胬肉組織。

表1 TIMP-1、MMP-9和VEGF在復(fù)發(fā)、初發(fā)翼狀胬肉和正常球結(jié)膜表達(dá)著色顆粒計數(shù)比較±s)

2.3MMP-9、TIMP-1表達(dá)與VEGF在翼狀胬肉中的表達(dá)的相關(guān)性 在38例復(fù)發(fā)翼狀胬肉和47例初發(fā)翼狀胬肉中MMP-9、TIMP-1和VEGF蛋白陽性表達(dá)分別是69、73和57例。MMP-9和VEGF蛋白在翼狀胬肉中的表達(dá)關(guān)系見表2。TIMP-1和VEGF蛋白在翼狀胬肉中的表達(dá)關(guān)系見表3。經(jīng)χ2檢驗后，VEGF與MMP-9蛋白表達(dá)相關(guān)(χ2=6.91，P=0.013);VEGF與TIMP-1蛋白表達(dá)相關(guān)(χ2=0.09，P=0.623)。

表2 MMP-9和VEGF蛋白在翼狀胬肉中的表達(dá)關(guān)系(n)

表3 TIMP-1和VEGF蛋白在翼狀胬肉中的表達(dá)關(guān)系(n)

3 討論

翼狀胬肉是眼科一種常見的眼表疾病，常表現(xiàn)為鼻側(cè)球結(jié)膜組織增厚的病變。其通過破壞角膜前彈力層和角膜的基質(zhì)層，造成視覺質(zhì)量的下降和外觀缺陷。目前臨床上對翼狀胬肉的主要治療方式是翼狀胬肉切除術(shù)，但患者術(shù)后復(fù)發(fā)率較高[4]。關(guān)于翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制，研究[2]表明細(xì)胞外基質(zhì)和角膜緣干細(xì)胞屏障的破壞是翼狀胬肉進(jìn)展的基礎(chǔ)。當(dāng)翼狀胬肉組織中的細(xì)胞外基質(zhì)等屏障受到破壞，胬肉組織進(jìn)展迅速，侵入角膜組織。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白家族的重要成員之一，主要功能是降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)[3,5]。在正常的組織中，一方面，MMP-9通過分解和重塑，實現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)的重建，同時其還能調(diào)控其他蛋白酶、細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的活性；另一方面，MMP-9刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞分泌VEGF來調(diào)控新生血管的發(fā)生。TIMP是MMP的天然抑制劑，阻止MMPs酶原活化，抑制已活化的MMPs酶的活性。TIMP-1是多功能分子，不僅能抑制MMPs酶的活性，還能刺激皮質(zhì)類固醇的生成、抑制血管發(fā)生、改變細(xì)胞形態(tài)學(xué)作用[5]。研究[5-7]表明，新生血管在翼狀胬肉中發(fā)揮重要作用，翼狀胬肉中存在大量VEGF及新生血管的表達(dá)，這一結(jié)果證實了新生血管的發(fā)生是翼狀胬肉形成的重要機(jī)制。其中角膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF能夠促進(jìn)局部組織毛細(xì)血管網(wǎng)的形成，被認(rèn)為是新生血管生成的最重要的生長因子之一[7]。鑒于MMP-9和TIMP-1在維持細(xì)胞外基質(zhì)動態(tài)平衡和新生血管生成等方面的作用，以及這兩個因素在翼狀胬肉的發(fā)生的重要作用[8]，本實驗通過研究MMP-9、TIMP-1和VEGF在翼狀胬肉發(fā)病中的作用，并進(jìn)一步分析其內(nèi)在關(guān)系。

本研究隨機(jī)收集手術(shù)后的復(fù)發(fā)翼狀胬肉、初發(fā)翼狀胬肉及正常球結(jié)膜組織標(biāo)本。HE染色結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)翼狀胬肉組織上皮層明顯最厚，細(xì)胞體積增大，上皮細(xì)胞排列紊亂，上皮基底部呈不規(guī)則樣改變，間質(zhì)中新生血管數(shù)量明顯增加；初發(fā)翼狀胬肉次之。結(jié)果表明球結(jié)膜組織細(xì)胞的增殖和侵襲性生長是翼狀胬肉發(fā)展的重要原因?？赡芘c細(xì)胞外基質(zhì)屏障的破壞緊密相連[3]。本研究通過檢測翼狀胬肉組織中MMP-9和TIMP-1的表達(dá)情況來評價細(xì)胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡，結(jié)果顯示MMP-9和TIMP-1在翼狀胬肉組織中表達(dá)明顯高于正常球結(jié)膜，且在復(fù)發(fā)翼狀胬肉中表達(dá)最高。研究[9-10]表明，MMP-9在翼狀胬肉中表達(dá)增高，這一結(jié)果與本研究的結(jié)果一致。結(jié)果表明，MMP-9參與了翼狀胬肉的發(fā)生及復(fù)發(fā)。然而，與本研究結(jié)果不同是，TIMP-1被報道在翼狀胬肉中表達(dá)無明顯增加[5,11]。結(jié)果的差異可能有以下原因：首先，術(shù)前患者接受的治療可能不同；其次，標(biāo)本的收集、處理以及患者的年齡不完全相同，導(dǎo)致結(jié)果的不同；再次，胬肉標(biāo)本收取時疾病所處時間不相同會造成結(jié)果的差異[7]。當(dāng)外界因素刺激翼狀胬肉組織，MMP-9表達(dá)增加，TIMP-1也相應(yīng)地增加來維持細(xì)胞外基質(zhì)的平衡；隨著疾病的進(jìn)展，MMP-9表達(dá)進(jìn)一步增加，細(xì)胞外基質(zhì)平衡打破，翼狀胬肉組織侵襲性增加，導(dǎo)致翼狀胬肉的快速生長和復(fù)發(fā)[11]。本實驗進(jìn)一步分析MMP-9和TIMP-1與VEGF的關(guān)系，顯示MMP-9與VEGF相關(guān)，而TIMP-1與VEGF無相關(guān)性。這一結(jié)果提示，MMP-9可能通過破壞細(xì)胞外基質(zhì)和促進(jìn)VEGF的產(chǎn)生這兩個方面引起翼狀胬肉的發(fā)生和復(fù)發(fā)。

翼狀胬肉是結(jié)膜及其結(jié)膜下組織的增殖性病變，尤其結(jié)膜下組織增生明顯，本研究僅觀察結(jié)膜組織MMP-9和TIMP-1與VEGF分子的表達(dá)，具有一定片面性，在以后的研究中，需進(jìn)一步完善。盡管如此，本實驗表明MMP-9在翼狀胬肉發(fā)生和復(fù)發(fā)過程中發(fā)揮重要作用，其可能通過破壞細(xì)胞外基質(zhì)的屏障和促進(jìn)VEGF的產(chǎn)生來調(diào)控翼狀胬肉的發(fā)生和復(fù)發(fā)，這一結(jié)果將為治療人類翼狀胬肉這一眼表常見疾病提供新的理論依據(jù)。

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Expression and significance of vascular endothelial growth factor, matrix metalloproteinase 9 and matrix metalloproteinaseinhibitor1inthepterygium

LiYinglong,MaYing,WangLisong，etal

(Dept of Ophthamology, The Thind Affiliated Hospital of Anhui Medical University,The First People’s Hospital of Hefei, Hefei 230061)

ObjectiveToinvestigatetheexpressionofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF),matrixmetalloproteinase9 (MMP-9)andmatrixmetalloproteinaseinhibitor1 (TIMP-1)inpterygiumandfindtherolesoftheminthisdisease.MethodsThirty-eightrecurrentpterygium,forty-sevenearlyonsetpterygiumandthirty-twonormalbulbarconjunctivaswereobtainedinpresentstudy.TheexpressionsofMMP-9,TIMP-1andVEGFweretestedin85casesofpterygiumand32casesofnormalconjunctivalbyusingimmunehistochemicalmethod.TheexpressionsoftheMMP-9,TIMP-1andVEGFwerecomparedinthethreegroupsofpatientsandtherelationsamongthemwereanalyzed.ResultsTheMMP-9,TIMP-1andVEGFwereexpressedintherecurrentpterygiumandearlypterygiumspecimens.ThepositiveratesofMMP-9,TIMP-1andVEGFsignificantlyincreasedintherecurrentandearlypterygiumpterygiumsamplescomparedwiththenormalconjunctivasamples.Inpterygium,therewasarelationbetweenexpressionMMP-9andVEGFcorrelationexists,buttherewasnocorrelationbetweenTIMP-1andVEGFbyusingtheχ2analysis.ConclusionMMP-9playsanimportantroleinthepathogenosisofoccurrenceandrecurrencepterygium.ItmaydestroytheextracellularmatrixbarriersandpromoteVEGFproductiontocontroltheoccurrenceandrecurrenceofpterygium.Breakingdowntheextracellularmatrixbarriersmaybethebasisinhumanpterygiumpathogenesis.

extracellularmatrix;pterygia;recurrent;immunohistochemical;neovascularisation

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.021.html

2016-07-21接收

安徽省高校省級自然科學(xué)研究項目(編號：KJ2013A147)

安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院、合肥市第一人民醫(yī)院眼科，合肥 230061

李盈龍，男，碩士，副主任醫(yī)師，責(zé)任作者，E-mail:Lylong3760@sohu.com

R382.33

A

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.021