丁 然，王靜靜，葛金芳，陳飛虎

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Shp2表達沉默對ATPR誘導(dǎo)K562細胞分化作用的影響

丁 然，王靜靜，葛金芳，陳飛虎

目的 研究4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯(ATPR)在誘導(dǎo)慢性粒細胞白血病K562細胞分化過程中蛋白酪氨酸磷酸酶(Shp2)的作用。方法 ATPR作用K562細胞，CCK-8法檢測細胞生長抑制率；Q-PCR和Western blot法檢測Shp2表達；合成特異性熒光短鏈Shp2 siRNA鏈，抑制Shp2表達后，觀察ATPR對K562細胞增殖和形態(tài)學(xué)影響。流式細胞術(shù)測定周期動力學(xué)和特異性分化指標CD235a表達，利用Western blot和Q-PCR法檢測維甲酸受體RARs 蛋白和mRNA的表達。結(jié)果 ATPR(10-5mol/L)作用于K562細胞72 h時能最顯著地抑制增殖，且Shp2的表達明顯下降。靶向沉默K562 細胞中Shp2基因的最佳序列為PTPN-Homo-438，siRNA 與 Lipo 的最佳濃度比例為1 ∶0.05。與 ATPR單獨用藥組比較，siRNA-Shp2+ATPR組的K562細胞增殖活性升高，G0/G1期細胞所占比例降低，S期增多，CD235a的表達下降，形態(tài)學(xué)較空白組變化不大。Shp2轉(zhuǎn)染沉默后用藥組維甲酸受體RARs表達與單獨用藥組比較有差異。結(jié)論 Shp2沉默后，ATPR誘導(dǎo)K562細胞分化作用減弱，提示ATPR誘導(dǎo)K562細胞分化過程中，Shp2可能發(fā)揮著作用。

4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯；蛋白酪氨酸磷酸酶；K562細胞；誘導(dǎo)分化；維甲酸受體

全反式維甲酸(all trans retinoic acid，ATRA)作為分化誘導(dǎo)劑的代表已廣泛應(yīng)用于臨床上治療急性早幼粒細胞性白血病[1]。但長期使用ATRA會導(dǎo)致多種不良反應(yīng)，制約了其在臨床上廣泛應(yīng)用[2]。課題組前期研究[3]對ATRA的碳鏈末端進行結(jié)構(gòu)改造，經(jīng)過藥效學(xué)篩選，顯示4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate，ATPR)具有較強的活性，并且可誘導(dǎo)多種腫瘤細胞分化成熟，有望成為一種新型的誘導(dǎo)分化劑。蛋白酪氨酸磷酸酶(Shp2)是PTPs胞內(nèi)非受體型( non-receptor PTPs，NRPTPs)的一員，由ptpn11基因編碼。Shp2不僅通過調(diào)節(jié)包括RAS在內(nèi)的多條信號通路，而且還與細胞存活、遷移、凋亡、分化等密切相關(guān)[4]。同時，編碼基因ptpn11的突變在多種疾病如努南綜合征、LEOPARD綜合征[5]、部分白血病[6-7]等多種腫瘤中發(fā)揮著重要作用。在血液系統(tǒng)中，造血祖細胞對造血生長因子的刺激可以通過Shp2突變體而變得敏感[8]，并且Shp2對造血細胞的發(fā)育也十分重要[9]。Shp2被認為是治療腫瘤的靶點。該研究以K562細胞為研究對象，通過小分子干擾RNA(siRNA)技術(shù)，建立Shp2表達沉默模型，探究ATPR在誘導(dǎo)K562細胞分化過程中Shp2所起的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 ATPR(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院)；ATRA( 美國Sigma公司)；RPMI-1640培養(yǎng)液(上海碧云天公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；瑞氏-吉姆薩染液(生產(chǎn)批號：20150717，南京建成生物科技研究所)；CCK-8(批號：BB150091)、細胞周期檢測試劑盒(批號：88150071)(上海貝博生物公司)；TRIzol(美國Ambion公司)；Lipofectamine 2000、Shp2引物及RARs引物(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Q-PCR試劑盒(美國Vazyme公司)；siRNA(蘇州吉瑪基因股份有限公司)；抗β-actin、抗Shp2、抗RARα、抗RARβ抗體(美國Immunoway公司)；抗RARγ抗體(美國Santa公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) K562細胞由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院李曉峰饋贈，使用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中生長，取對數(shù)期生長的細胞進行試驗。

1.3 ATPR對K562細胞增殖及Shp2表達的影響

1.3.1 CCK-8法測定ATPR對K562細胞生長增殖的影響 將K562細胞接種至96孔培養(yǎng)板中，濃度為5×104/ml，體積為100 μl。實驗分組為：空白組、溶劑對照組(含0.02%無水乙醇)、ATRA組(10-5mol/L)、ATPR組(10-4～10-9mol/L)，每孔的終體積為200 μl，分別在24、48、72 h時加入10 μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測定吸光度(absorbance，A)值。

1.3.2 Q-PCR法檢測K562細胞中Shp2 mRNA表達 將K562細胞接種至細胞培養(yǎng)瓶中，濃度為1×105/ml，實驗分組為：空白組(RPMI-1640培養(yǎng)液)、溶劑對照組(0.02%無水乙醇)、ATRA組(10-5mol/L)及ATPR組(10-5mol/L)。72 h后，抽提細胞RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)abmEVAGreen 2×PCR MasterMix 實驗方法，以β-actin為內(nèi)參，上機進行檢測。

1.3.3 Western blot法檢測K562細胞中Shp2蛋白表達 實驗按1.3.2分組處理72 h后，提取總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度決定上樣量，依次進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，Shp2小鼠抗兔單克隆抗體(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，辣根酶標記的山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)室溫下孵育2 h。洗滌、顯影，根據(jù)蛋白條帶測定光密度值，表示Shp2蛋白的表達強度。

1.4 制備并篩選沉默K562細胞內(nèi)Shp2的siRNA最佳序列

1.4.1 siRNA序列設(shè)計與制備 在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找Shp2 mRNA全序列，從Shp2編碼區(qū)中尋找符合設(shè)計原則的靶序列，從而合成Shp2-siRNA序列。Shp2-siRNA 3條序列為：PTPN-Homo-438上游引物：5′-GUUGACAAGAGGAGUUGUTT-3′，下游引物：5′-AUCAACUCCUCUUGUCAACTT-3′；PTPN-Homo-948上游引物：5′-GACAGAUCUUGUGGAACAUTT-3′，下游引物：5′-AUGUUCCACAAGAUCUGUCTT-3′；PTPN-Homo-1493上游引物：5′-CUGAUGAGUAUGCUCUAAATT-3′，下游引物：5′-UUUAGAGCAUACUCAUCAGTT-3′。

1.4.2 siRNA轉(zhuǎn)染及分組 轉(zhuǎn)染前，收集細胞，每孔接種5×105個細胞于6孔板中。實驗分為：空白組、每條siRNA與Lipo按照1 ∶0.08、1 ∶0.06、1 ∶0.05、1 ∶0.04各分4組，配制不同比例siRNA-Lipo混合物。將siRNA-Lipo混合液加到培養(yǎng)瓶中，再加4 ml Opti-MEM培養(yǎng)基，搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.3 熒光強度觀察轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染后，培養(yǎng)6 h后，利用激發(fā)波長為480 nm、發(fā)射波長為520 nm的藍激發(fā)光，采用熒光倒置顯微鏡觀察K562細胞質(zhì)中綠色熒光強度。

1.4.4 Western blot法檢測沉默后Shp2的蛋白表達 提取轉(zhuǎn)染后各組K562細胞的總蛋白，根據(jù)蛋白濃度決定上樣量，依次進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育Shp2一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜后，其后操作同1.3.3。

1.5 Shp2轉(zhuǎn)染沉默后ATPR對K562細胞誘導(dǎo)分化的影響

1.5.1 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后細胞增殖狀況 實驗分組：空白組(RPMI-1640培養(yǎng)液)、ATRA組(10-5mol/L)、ATPR組(10-5mol/L)、Shp2沉默不加藥組(siRNA-Lipo)、siRNA-Lipo+ATRA組以及siRNA-Lipo+ATPR組。實驗方法同1.3.1。

1.5.2 細胞形態(tài)學(xué)觀察 將K562細胞接種于6孔板中，細胞濃度為1×105/ml，實驗分組同1.5.1。藥物處理72 h后，收集細胞，PBS洗滌2～3次，用PBS重懸、混勻，滴加在載玻片上，自然風干，依次滴加瑞氏-吉姆薩染液A液和B液，流水沖洗、干燥，觀察并拍攝(×400)油鏡下的細胞。

1.5.3 細胞周期和DNA倍體分析 將K562細胞接種于6孔板中，細胞濃度為1×105/ml，實驗分組同1.5.1。藥物處理72 h后，收集細胞，洗滌，加入75%冰乙醇2 ml，-20 ℃固定1 h或4 ℃過夜(起固定作用)。用200～500 μl冷PBS重懸細胞，加入Rnase A溶液20 μl，37 ℃水浴30 min，然后加入400 μl PI染液，輕輕混勻后避光4 ℃孵育30 min～1 h，使用BD FACSVerseTM流式細胞儀檢測結(jié)果。

1.5.4 細胞表面分化抗原檢測 將K562細胞接種于6孔板中，細胞濃度為1×105/ml，實驗分組同1.5.1。72 h后收集細胞，用PBS調(diào)整各組細胞密度為1×106個/ml，加入CD235a-PE單克隆抗體，充分渦旋后，避光4 ℃孵育20 min，使用流式細胞儀檢測結(jié)果。

1.5.5 Q-PCR法檢測K562細胞中RARs mRNA表達 將K562細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，細胞濃度為4×105/ml，實驗分組同1.5.1，72 h后，按TRIzol說明書提取K562細胞的RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，根據(jù)Q-PCR試劑盒說明書按比例進行上樣，以β-actin為內(nèi)參，上機進行檢測。引物序列見表1。

1.5.6 Western blot法檢測RARα、RARγ蛋白的表達 將K562細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，細胞濃度為4×105/ml，實驗分組同1.5.1，提取各處理組K562細胞的總蛋白，并進行定量。根據(jù)蛋白濃度決定上樣量，依次進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，并孵育相應(yīng)一抗，4 ℃過夜。隨后操作同1.3.3。

表1 Q-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 ATPR對K562細胞增殖及Shp2表達的影響

2.1.1 ATPR對K562細胞增殖的影響 溶劑對照組的A490值與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明無水乙醇(0.02%)作為藥物溶劑對細胞活性無影響。顯微鏡下觀察加藥后各組細胞顯示，ATPR(10-4mol/L)作用于K562細胞時細胞形態(tài)發(fā)生皺縮，細胞出現(xiàn)大面積凋亡；其他各組ATPR作用24 h時對K562細胞增殖無影響，作用48、72 h后，細胞發(fā)生不同程度的抑制增殖作用。10-5mol/L ATPR作用72 h時K562細胞增殖抑制最明顯(P<0.01)。見表2。

2.1.2 ATPR作用于K562細胞72 h后Shp2 mRNA表達變化 K562細胞在ATPR(10-5mol/L)作用72 h后，與溶劑對照組比較，其 Shp2 mRNA的表達明顯下降(F=87.23,P<0.01)。見圖1。

2.1.3 ATPR作用于K562細胞72 h后Shp2蛋白表達變化 Western blot結(jié)果顯示，與溶劑對照組比較，ATPR(10-5mol/L)作用72 h后K562細胞中Shp2蛋白表達降低(F=75.36,P<0.01)。見圖2。

圖1 ATPR對K562細胞中Shp2 mRNA的表達影響

A：空白組；B：溶劑對照組；C：ATRA(10-5mol/L)組；D：ATPR(10-5mol/L)組；與溶劑對照組比較：**P<0.01

圖2 ATPR對K562細胞中Shp2蛋白的表達影響

A：空白組；B：溶劑對照組；C：ATRA(10-5mol/L)組；D：ATPR(10-5mol/L)組；與溶劑對照組比較：*P<0.05,**P<0.01

2.2 篩選Shp2 siRNA與Lipofectamine 2000最佳濃度和比例

2.2.1 熒光法測定各條Shp2-siRNA 轉(zhuǎn)染效率 本與溶劑對照組比較：*P<0.05,**P<0.01

表2 ATPR對K562細胞增殖的影響

圖3 siRNA/Lipo 2000不同比例濃度對siRNA-FAM進入細胞的影響 ×40

A：PTPN-Homo-438；B：PTPN-Homo-948；C：PTPN-Homo-1493；D：空白組；1：siRNA ∶Lipo=1 ∶0.08；2：siRNA ∶Lipo=1 ∶0.06；3：siRNA ∶Lipo=1 ∶0.05；4：siRNA ∶Lipo=1 ∶0.04

研究中設(shè)計合成的siRNA其3′端為FAM熒光標記?？瞻捉M(siRNA/Lipo 2000比例為0 μl ∶0 μl)幾乎無熒光表達，當siRNA/Lipo 2000為其他比例時熒光倒置顯微鏡下均能觀察到不同程度熒光。通過比較各組熒光程度顯示PTPN-Homo-438組和PTPN-Homo-1493組熒光表達較多。見圖3。

2.2.2 各條siRNA序列轉(zhuǎn)染對K562細胞中Shp2蛋白表達的影響 結(jié)果顯示：K562細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后，與空白組比較，Shp2的蛋白質(zhì)表達下降，與其他各組比較，PTPN-Homo-438組下降明顯，PTPN-Homo-438/Lipo 2000比值為1 ∶0.05時，Shp2蛋白表達低于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

2.3 Shp2基因轉(zhuǎn)染沉默后ATPR對K562細胞分化的影響

2.3.1 轉(zhuǎn)染沉默Shp2基因后ATPR對K562細胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染24 h后，各組細胞生長無明顯變化，48 h時ATPR組與空白組比較細胞增殖降低(P<0.01)，siRNA-Shp2+ATPR組細胞生長較ATPR組增加，72 h后ATPR組與空白組比較細胞增殖明顯降低(P<0.01)，siRNA-Shp2+ATPR組細胞生長比ATPR組顯著增多(P<0.01)，而siRNA-Shp2+

圖4 不同siRNA序列轉(zhuǎn)染對siRNA-Shp2蛋白表達的影響

A：PTPN-Homo-438；B：PTPN-Homo-948；C：PTPN-Homo-1493；D：空白組；1：siRNA ∶Lipo=1 ∶0.08；2：siRNA ∶Lipo=1 ∶0.06；3：siRNA ∶Lipo=1 ∶0.05；4：siRNA ∶Lipo=1 ∶0.04；與空白組比較：**P<0.01

ATPR組與siRNA-Lipo組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖5。

圖5 轉(zhuǎn)染沉默Shp2基因后加ATPR對細胞增殖的影響

A：空白組；B：ATRA(10-5mol/L)組；C：ATPR(10-5mol/L)組；D：siRNA-Lipo組；E：siRNA-Lipo+ATRA組；F：siRNA-Lipo+ATPR組；與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01；與ATRA組比較：#P<0.05；與ATPR組比較：△P<0.05

2.3.2 Shp2基因轉(zhuǎn)染沉默后ATPR對細胞形態(tài)學(xué)影響 ATPR(10-5mol/L)對K562細胞作用72 h后形態(tài)學(xué)變化見圖6。結(jié)果顯示：空白組出現(xiàn)細胞呈圓形、體積較大、核/質(zhì)比例大、核圓形等特點。用藥組的細胞出現(xiàn)細胞和細胞核體積縮小、核質(zhì)比例縮小、核偏于一側(cè)等細胞分化程度成熟的形態(tài)學(xué)狀態(tài)。然而siRNA-Shp2+ATPR組染色后倒置顯微鏡所呈現(xiàn)的細胞狀態(tài)跟空白組較為相似，并沒有出現(xiàn)明顯的細胞開始分化所表現(xiàn)出的現(xiàn)象。

圖6 ATPR作用72 h后K562細胞的形態(tài)學(xué)變化 ×400

A：空白組；B：ATRA(10-5mol/L)組；C：ATPR(10-5mol/L)組；D：siRNA-Lipo組；E：siRNA-Lipo+ATRA組；F：siRNA-Lipo+ATPR組

2.3.3 Shp2基因轉(zhuǎn)染沉默后K562細胞周期及DNA倍體分析 細胞周期分析結(jié)果顯示，ATRA(10-5mol/L)和ATPR(10-5mol/L)組作用于K562細胞72 h后，與空白組比較，S期細胞所占百分比明顯下降，G0/G1期細胞百分比上升。當Shp2基因轉(zhuǎn)染沉默后，siRNA-Shp2+ATPR組與siRNA-Lipo組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=183.559，P>0.05)，siRNA-Shp2+ATPR組與ATPR組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=42.397，P<0.05)。 見圖7。

2.3.4 Shp2基因轉(zhuǎn)染沉默后細胞表面分化抗原CD235a表達改變 CD235a抗原為血型糖蛋白A(glycophorin A)抗原，是紅系特異抗原。ATPR處理K562細胞72 h后，與空白組比較，結(jié)果顯示CD235a表達上升(P<0.01)。當Shp2基因轉(zhuǎn)染沉默后，siRNA-Lipo+ATPR組與ATPR組比較，CD235a 表達變化明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=342.071，P<0.01)。見圖8。

2.3.5 Shp2基因轉(zhuǎn)染沉默后K562細胞中RARs mRNA的表達變化 當K562細胞經(jīng)過ATPR(10-5mol/L)作用72 h后，與空白組比較，RARα的mRNA表達下降，而RARγ的mRNA表達上升。當Shp2基因轉(zhuǎn)染沉默后，siRNA-Lipo+ATPR組細胞的RARα和RARγ mRNA表達與siRNA-Lipo之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(FRARα=2.908、FRARγ=0.727,P>0.05)，而siRNA-Lipo+ATPR組與ATPR組比較，其RARα和RARγ組的mRNA表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(FRARα=17.355、FRARγ=44.145,P<0.01)。見圖9。

2.3.6 Shp2基因轉(zhuǎn)染沉默后K562細胞中RARα、RARγ蛋白的表達變化 與空白組比較，ATPR(10-5mol/L)組RARα的蛋白表達下降(F=83.183,P<0.05)，RARγ的蛋白表達上升(F=124.307,P<0.01)。然而當Shp2基因轉(zhuǎn)染沉默后，siRNA-Lipo+ATPR組細胞RARα和RARγ蛋白表達與siRNA-Lipo之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(FRARα=3.012、FRARγ=4.165,P>0.05)，而siRNA-Lipo+ATPR組與ATPR組比較，其RARα和RARγ組的蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(FRARα=29.580、FRARγ=40.790,P<0.01)。見圖10。

3 討論

慢性粒細胞性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一類影響血液及骨髓的惡性腫瘤，其特點是產(chǎn)生不成熟的白細胞，這些白細胞聚集于骨髓，致使骨髓的造血被抑制；并且能夠通過血液在全身擴散。90%以上CML患者有費城染色體(Ph)，(t9;22)(q34;q11)染色體易位并形成BCR/ABL融合基因，從而致使疾病產(chǎn)生[10]。研究[11]顯示，Shp2參與BCR / ABL 信號通路，與費城染色體陽性白血病的發(fā)生密切相關(guān)。本研究以K562細胞為研究對象，通過Q-PCR和Western blot法檢測證實，當ATPR作用于K562細胞時，其Shp2的表達明顯降低，說明K562細胞被ATPR作用過程中，Shp2可能發(fā)揮著作用。為了進一步證實Shp2在ATPR誘導(dǎo)K562細胞分化過程中的作用，本研究通過小分子干擾RNA(siRNA)技術(shù)建立Shp2表達沉默模型來進行研究。熒光法和Western blot法結(jié)果表明：PTPN-Homo-438與Lipo比例為1 ∶0.05時Shp2蛋白表達最低，故選用此條件進行轉(zhuǎn)染。

A：空白組；B：ATRA(10-5mol/L)組；C：ATPR(10-5mol/L)組；D：siRNA-Lipo組；E：siRNA-Lipo+ATRA組；F：siRNA-Lipo+ATPR組；與空白組比較：**P<0.01；與ATRA組比較：#P<0.05；與ATPR組比較：△P<0.05

圖8 ATPR對K562細胞表面分化抗原CD235a表達的影響

A：空白組；B：ATRA(10-5mol/L)組；C：ATPR(10-5mol/L)組；D：siRNA-Lipo組；E：siRNA-Lipo+ATRA組；F：siRNA-Lipo+ATPR組；與空白組比較：**P<0.01；與ATRA組比較：##P<0.01；與ATPR組比較：△△P<0.01

課題組前期研究[12]證實ATPR對K562細胞具有誘導(dǎo)分化作用，然而當Shp2被轉(zhuǎn)染沉默后，CCK-8檢測結(jié)果表明：靶向沉默Shp2基因6 h后加入ATPR，用藥72 h后，siRNA-Shp2+ATPR組與ATPR組相比細胞生長顯著增多，表明ATPR作用后，siRNA-Shp2+ATPR組細胞增殖明顯高于ATPR組。形態(tài)學(xué)變化可作為細胞分化程度的重要指標[13], 并且能夠反映出誘導(dǎo)分化劑的誘導(dǎo)分化能力。瑞氏染色后結(jié)果顯示K562細胞被ATPR作用72 h后，細胞形態(tài)學(xué)趨向于分化成熟方向, 然而siRNA-Shp2+ATRA組和siRNA-Shp2+ATPR組形態(tài)學(xué)變化沒有ATPR組明顯，當Shp2被轉(zhuǎn)染沉默后，ATPR誘導(dǎo)K562細胞分化的形態(tài)學(xué)變化減弱。

圖9 ATPR作用72 h后K562細胞RARs mRNA表達量的變化

A：空白組；B：ATRA(10-5mol/L)組；C：ATPR(10-5mol/L)組；D：siRNA-Lipo組；E：siRNA-Lipo+ATRA組；F：siRNA-Lipo+ATPR組；與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01；與ATRA組比較：##P<0.01；與ATPR組比較：△△P<0.01

圖10 ATPR作用72 h后K562細胞RARs蛋白表達量的變化

A：空白組；B：ATRA(10-5mol/L)組；C：ATPR(10-5mol/L)組；D：siRNA-Lipo組；E：siRNA-Lipo+ATRA組；F：siRNA-Lipo+ATPR組；與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01；與ATRA組比較：##P<0.01；與ATPR組比較：△P<0.05，△△P<0.01

細胞S期比例高是惡性腫瘤細胞的周期分布特點之一，分化后細胞G0/G1期比例升高[14]。根據(jù)細胞周期結(jié)果顯示：ATPR作用72 h后，K562細胞中G0/G1期比例升高，S期細胞比例降低。當Shp2基因被沉默后，siRNA-Shp2+ATPR組細胞周期變化與ATPR組比較有明顯差異，說明Shp2對ATPR作用K562細胞有影響。CD235a抗原為血型糖蛋白A抗原，是紅系特異抗原，可作為ATPR誘導(dǎo)K562細胞分化的重要標志[15]，流式結(jié)果顯示，ATPR處理K562細胞72 h后，與空白組比較，CD235a表達上升，證實K562細胞可被ATPR誘導(dǎo)向紅系分化。當Shp2基因轉(zhuǎn)染沉默后，siRNA-Shp2+ATPR組的CD235a 表達變化相較于ATPR組明顯降低，說明當Shp2被轉(zhuǎn)染沉默后，ATPR誘導(dǎo)K562細胞分化作用降低。

研究[16]顯示，維甲酸類藥物是通過與細胞內(nèi)的維甲酸受體結(jié)合，調(diào)節(jié)體內(nèi)生理過程。RARs在不同的細胞中的分布有差異，因此 ATPR 在各種細胞中刺激的RARs亞型也不一樣。前期實驗[12]結(jié)果顯示，當ATPR誘導(dǎo)K562細胞分化過程中，RARɑ表達下降，RARγ表達上升，RARβ表達沒有明確變化。根據(jù)Western blot和Q-PCR結(jié)果顯示：當轉(zhuǎn)染沉默Shp2后，siRNA-Shp2+ATPR組的RARα和RARγ的表達變化與siRNA-SHP2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而siRNA-Shp2+ATPR組與ATPR組比較，RARα和RARγ的表達變化明顯，提示K562細胞在被ATPR通過RARs作用的過程中，Shp2可能參與著作用。

綜上所述，PTPN-Homo-438可有效沉默Shp2基因的表達； ATPR可顯著抑制K562細胞增殖并致使其分化程度上升；然而當Shp2被轉(zhuǎn)染沉默后，ATPR對K562細胞抗增殖和誘導(dǎo)分化作用明顯降低甚至消失，提示Shp2可能是介導(dǎo)抗白血病作用的主要環(huán)節(jié)。

[1] Brown G, Hughes P. Retinoid differentiation therapy for common types of acute myeloid leukemia[J].Leuk Res Treatment, 2012, 2012: 939021.

[2] Sanz M A,Montesinos P. How we prevent and treat differentiation syndrome in patients with acute promyelocytic leukemia[J]. Blood,2014,123(18):2777-82.

[3] 沈 娟, 陳飛虎, 石靜波, 等. 維甲酸衍生物的合成及其抗腫瘤活性研究[J].中國新藥雜志, 2009, 18(11): 86-9.

[4] Qiu W,Wang X,Romanov V, et al.Structural insights into Noonan/LEOPARD syndrome-related mutants of protein-tyrosine phosphatase SHP2(PTPN11)[J].BMC Structural Biology,2014,14:10.

[5] Digilio M C,Conti E,Sarkozy A,et al.Grouping of multiple lentigines/LEOPARD and Noonan syndromes on the PTPN11 gene[J].Am J Hum Genet,2002,71(2):389-94.

[6] Nabinger S C,Chan R J.Shp2 function in hematopoietic stem cell biology and leukemogenesis[J].Curr Opin Hematol,2012,19(4):273-9.

[7] Chen L,Chen W,Mysliwski M,et al.Mutated Ptpn11 alters leukemic stem cell frequency and reduces the sensitivity of acute myeloid leukemia cells to Mcl1 inhibition[J].Leukemia,2015,29(6):1290-300.

[8] Loh M L, Vattikuti S, Schubbert S,et al.Mutations in PTPN11 implicate the SHP2 phosphatase in leukemogenesis[J].Blood,2004,103(6):2325-31.

[9] Broxmeyer H E,Etienne-Jnlan M,Gotoh A,et al.Hematopoietic colony formation from human growth factor-dependent TF1 cells and human cord blood myeloid progenitor cells depends on SHP2 phosphatase function[J].Stem Cells Dev,2013,22(6):998-1006.

[10]Sun W T,Xiang W,Ng B L，et al.Inhibition of isoprenylcysteine carboxylmethyltransferase augments BCR-ABL1 tyrosine kinase inhibition induced apoptosis in chronic myeloid leukaemia[J].Exp Hematol,2016 ,44(3):189-93.e2.

[11]Chen J,Yu W M.Daino H,et al.SHP2 phosphatase is required for hematopoietic cell transformation by Bcr-Abl[J].Blood,2007,109(2):778-85.

[12]阮晶晶, 陳飛虎, 徐 佼, 等. 4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯對K562細胞分化和細胞周期的影響[J].中國藥理學(xué)通報, 2009, 25(9): 1238-43.

[13]吳 菲, 陳飛虎, 洪凡青, 等. ATPR對ECA-109、PANC-1、Hela細胞增殖及分化的影響[J].中國癌癥雜志, 2012, 22(4): 257-63.

[14]Bastie J N, Balitrand N,Guillemot I, et al.Cooperative action of 1a,25-dihydroxyvitamin D3 and retinoic acid in NB4 acute promyelocytic leukemia cell differentiation is transcriptionally controlled[J]. Exp Cell Res, 2005, 310(2): 319-30.

[15]陳 晶, 李 歡, 安 娜, 等. TBLR1-RARɑ融合基因?qū)562細胞向紅系分化的影響[J].中國實驗血液學(xué)雜志,2015,23(6):1702-8.

[16]Dawson H D,Collins G,Pyle R, et al. The Retinoic Acid Receptor-alpha mediates human T-cell activation and Th2 cytokine and chemokine production[J]. BMC Immunol, 2008,9：16.

Effect of Shp2 gene silencing on the 4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate inducing differentiation of K562 cells

Ding Ran,Wang Jingjing,Ge Jinfang,et al

(SchoolofPharmacy,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032)

Objective To investigate the effect of protein tyrosine phosphatase Shp2 on 4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate (ATPR) induced differentiation of K562 cells. Methods K562 cells were cultured and treated with ATPR at different concentrations. The proliferation of K562 cells was evaluated using CCK-8.The mRNA and protein expressions of Shp2 were detected by Q-PCR and Western blot .Lipofectamine 2000 transfection reagent was used to transfect the small interfering RNA (siRNA) in K562 cells.Using CCK-8 assay to detect the proliferation of K562 cells. Morphologic changes were observedviaWright-Giemsa staining. Using FCS to observe the expression of an exclusive cell surface antigen CD235a and the distribution of cell cycle on K562 cells.The mRNA and protein expressions of retinoic acid receptors (RARα and RARγ) were detected by Q-PCR and Western blot, respectively. Results The best inhibitory effect reached the peak at 72 h. The expressions of Shp2 remarkably decreased. Detected through fluorescence microscope and Western blot, the PTPN-Homo-438 and the concentration ratio of the siRNA and Lipo was 1 ∶0.05. The gene silencing efficacy was the best. Compared with the ATPR group, the proliferation of K562 cells were not inhibited by treatment with ATPR (10-5mol/L) .The percentage of cells in G0/G1 phase was decreased while S-phase cells were increased, and the expression level of the maturation specific cell surface marker CD235a decreased in K562 cells. Q-PCR and Western blot results showed that RARα mRNA and protein expressions of siRNA+ATPR group were significantly increased than ATPR group. RARγ mRNA and protein expressions of siRNA+ATPR group were decreased than ATPR group. Conclusion The effect of ATPR induced differentiation of K562 cells might be involved with the Shp2 gene.

4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate; Shp2; K562 cells; inducing differentiation; retinoic acid receptor

時間：2016-8-10 11:04:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.003.html

2016-06-12接收

國家科技部“重大新藥創(chuàng)新”科技重大專項(編號：2011ZX09401-021)

安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230032

丁 然，男，碩士研究生；

陳飛虎，男，教授，博士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail：cfhchina@sohu.com

R 593.22；R 392.3；R 392.5；R 967；R 979.5

A

1000-1492(2016)10-1403-08

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.003