郭 靜，李 敏，楊付梅，孫黔云

(1.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藥理與活性篩選中心，貴州 貴陽(yáng) 550002；2.貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州 貴陽(yáng) 550002)

?

補(bǔ)體旁路激活致小鼠急性肺損傷的炎癥病理機(jī)制研究

郭 靜1，李 敏2，楊付梅1，孫黔云1

(1.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藥理與活性篩選中心，貴州 貴陽(yáng) 550002；2.貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州 貴陽(yáng) 550002)

目的 研究補(bǔ)體旁路激活所導(dǎo)致的小鼠肺部急性炎癥的發(fā)生發(fā)展及相關(guān)指標(biāo)的變化，為藥物篩選及干預(yù)研究提供理想的小鼠肺部急性炎癥病理模型。方法 SPF級(jí)昆明小鼠尾靜脈注射眼鏡蛇毒因子(CVF)激活血清補(bǔ)體旁路途徑，根據(jù)注射后取樣時(shí)間不同，分為15 min、30 min、1 h、2 h、6 h組，同時(shí)平行設(shè)置PBS對(duì)照組。取肺組織測(cè)定肺系數(shù)、肺含水量，并行病理切片檢查，肺組織勻漿測(cè)定髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性；制備支氣管肺泡灌洗液(BALF)和血清，測(cè)定BALF中的細(xì)胞數(shù)和蛋白含量，采用ELISA法分別測(cè)定BALF和血清中的IL-6、TNF-α、P-selectin和ICAM-1含量。結(jié)果 小鼠尾靜脈注射CVF后可致肺部炎性細(xì)胞明顯浸潤(rùn)，MPO活性明顯上調(diào)，BALF中細(xì)胞總數(shù)和蛋白濃度明顯增加。BALF和血清中的IL-6、TNF-α、P-selectin水平及血清中ICAM-1的含量均明顯升高，其中，BALF中P-selectin含量在30 min時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)1個(gè)小高峰，IL-6和TNF-α在1 h時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)1個(gè)高峰，在2 h時(shí)間點(diǎn)均無(wú)進(jìn)一步上升，但在6 h時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)均又明顯升高；血清中IL-6和TNF-α含量在1 h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到峰值，隨后濃度降低，P-selectin和ICAM-1水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)上升。而肺系數(shù)、肺含水量及BALF中ICAM-1的含量與PBS組相比無(wú)明顯變化。結(jié)論 補(bǔ)體旁路激活可導(dǎo)致小鼠肺部急性炎癥的發(fā)生，以30 min至1 h的炎癥反應(yīng)最為明顯，該實(shí)驗(yàn)可以為藥物篩選及干預(yù)研究提供理想的動(dòng)物肺部急性炎癥病理模型。

眼鏡蛇毒因子；急性肺損傷；小鼠模型；補(bǔ)體旁路；炎癥；黏附分子；炎性介質(zhì)

補(bǔ)體旁路激活導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)在一系列臨床急危重癥中扮演重要角色[1-2]，其中補(bǔ)體旁路激活導(dǎo)致的肺部急性炎癥較為典型。補(bǔ)體旁路激活可以誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷[3]，但是否能引起小鼠發(fā)生急性肺損傷尚不清楚。天然產(chǎn)物是新藥開(kāi)發(fā)的重要來(lái)源，而絕大多數(shù)分離純化獲得的天然產(chǎn)物樣品無(wú)法滿足大鼠實(shí)驗(yàn)用量的需要。因此，基于大規(guī)模篩選貴州民族藥資源相關(guān)活性成分的需要，我們選用小鼠開(kāi)展補(bǔ)體旁路激活誘導(dǎo)急性肺損傷的研究，以期為藥物篩選及干預(yù)研究提供理想的動(dòng)物肺部急性炎癥病理模型。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠80只，♂♀各半，體質(zhì)量18 g～20 g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證書：SCXK-(軍)-2012-0011。所有的操作和實(shí)驗(yàn)流程均遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。實(shí)驗(yàn)環(huán)境：恒溫(22±2)℃，濕度60%～70%，自由飲水和進(jìn)食。

1.2 試劑與儀器 眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)，為本課題組制備，其分離純化方法同文獻(xiàn)[4]；MPO試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào):20160407)；小鼠IL-6、TNF-α、P-selectin 和ICAM-1 ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào):20160401)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào):20151124)；Revco超低溫冰箱(美國(guó)Thermo公司)；Spectra MAX-190連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；Elix純水系統(tǒng)和Milli Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；5810R 冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；Nikon TS100 倒置顯微鏡(日本Nikon公司)。

2 方法

2.1 分組及給藥 80只昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后稱重，分為空白對(duì)照組(PBS組)、給藥組(CVF組)。給藥組尾靜脈注射25 μg·kg-1的CVF，空白對(duì)照組尾靜脈注射等體積PBS。每組再按給藥后取材時(shí)間的不同分為5組，分別為15 min、30 min、1 h、2 h、6 h 組，每組8只。

2.2 取材及標(biāo)本制備 給藥后15 min、30 min、1 h、2 h、6 h各組摘眼球取血，靜置3 h,4℃ 3 000 r·min-1離心10 min制備血清；然后處死小鼠，開(kāi)胸腔輕輕挑起右肺，以動(dòng)脈夾夾住右肺，暴露氣管，行氣管插管，左肺用1.2 mL 4℃生理鹽水分3次進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，每次0.4 mL,反復(fù)灌洗3次，得BALF,行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)后BALF 3 000 r·min-1離心10 min，取上清液分裝，-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ∮曳畏Q重后，將右肺上葉置于-80℃凍存。右肺中葉稱濕重，然后70℃烘烤48 h至恒重，計(jì)算肺水含量。右肺下葉置于10%甲醛溶液中固定，進(jìn)行病理切片檢查。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 肺系數(shù)、肺含水量及MPO測(cè)定 稱取右肺重量，根據(jù)(右肺重量/小鼠體質(zhì)量)公式，計(jì)算右肺系數(shù)。右肺上葉取出后，-80℃凍存用于MPO測(cè)定，具體方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。右肺中葉稱濕重，然后以70℃烘烤48 h至恒重，根據(jù)公式：(濕重-干重)/ 濕重×100%，計(jì)算肺含水量。

2.3.2 BALF細(xì)胞計(jì)數(shù) BALF回收率約62.5%，行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算計(jì)數(shù)板上5個(gè)大格的細(xì)胞總數(shù)n，按公式：細(xì)胞數(shù)(個(gè)· mL-1)=細(xì)胞總數(shù)n/80×400×104。

2.3.3 BALF蛋白濃度的測(cè)定 取BALF上清液，按照試劑盒說(shuō)明書，采用BCA法檢測(cè)，用酶標(biāo)儀在562 nm測(cè)定吸光度值并計(jì)算BALF中蛋白濃度。

2.3.4 炎癥介質(zhì)和黏附分子的測(cè)定 取BALF上清液和血清，按照試劑盒說(shuō)明書，采用ELISA法檢測(cè)，用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定吸光度值，并計(jì)算IL-6、TNF-α、P-selectin和ICAM-1的含量。

2.3.5 肺組織病理學(xué)檢查 灌洗結(jié)束后，取右肺下葉以10%甲醛溶液固定，制作常規(guī)石蠟病理切片，HE染色，顯微鏡下觀察。

3 結(jié)果

3.1 小鼠肺組織相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè) 與PBS組相比，CVF組小鼠的肺系數(shù)和肺含水量基本無(wú)明顯變化；BALF細(xì)胞數(shù)量和MPO活性均明顯增加(P<0.01)。CVF組間比較BALF細(xì)胞數(shù)量1 h時(shí)間點(diǎn)明顯高于15 min時(shí)間點(diǎn)，而2 h時(shí)間點(diǎn)與1 h相比差異沒(méi)有顯著性，到6 h時(shí)間點(diǎn)BALF細(xì)胞數(shù)量和MPO活性又明顯升高。BALF中蛋白含量升高，在30 min、6 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)(Tab 1)。

3.2 病理組織學(xué)觀察 病理切片結(jié)果顯示，PBS組肺組織結(jié)構(gòu)正常，少見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；CVF組肺組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變，肺組織內(nèi)炎性細(xì)胞明顯浸潤(rùn)，以1 h最為明顯，見(jiàn)Fig 1。

3.3 BALF中炎性介質(zhì)和黏附分子的變化情況 與PBS組比較，CVF各組BALF中IL-6、TNF-α、P-selectin水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)，其中P-selectin水平在30 min時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)1個(gè)小高峰，IL-6和TNF-α的水平在1 h時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)1個(gè)小高峰，隨后各指標(biāo)水平有所降低，至6 h時(shí)間點(diǎn)又明顯上調(diào)。而不同時(shí)間點(diǎn)的ICAM-1含量無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)Fig 2。

3.4 血清中炎性介質(zhì)和黏附分子的變化情況 與PBS組比較，CVF各組血清中IL-6、TNF-α、P-selec-tin、ICAM-1水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)，其中IL-6和TNF-α的水平在1 h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到峰值，隨后含量降低；血清中P-selectin 和ICAM-1的含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)上升，見(jiàn)Fig 3。

Tab 1 Related lung items of mice at different time ±s, n=8)

*P<0.05,**P<0.01vsPBS control group;##P<0.01vs15 min CVF group

Fig 1 Histological examination of lung tissue(×100)

A～E: PBS group, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 6 h respectively; F～J: CVF group, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 6 h respectively

Fig 2 Concentration of inflammatory mediator and adhesion molecule in ±s,n=8)

A:IL-6; B: TNF-α; C: P-selectin; D: ICAM-1. A,B,C,D:*P<0.05,**P<0.01vsPBS control group;##P<0.01vs15 min CVF group;△△P<0.01vs15 min,30 min,1 h and 2 h CVF groups.B:△P<0.05vs1 h and 2 h CVF groups;▲▲P<0.01vs15 min and 30 min CVF groups

4 討論

CVF是來(lái)源于眼鏡蛇毒的一種高效補(bǔ)體激活蛋白，CVF在血清中可與B因子形成具有C3/C5轉(zhuǎn)化酶活性的CVFBb，從而激活補(bǔ)體替代途徑，產(chǎn)生大量C3a、C5a及攻膜復(fù)合物(MAC)[5]，導(dǎo)致炎性細(xì)胞的聚集和活化以及內(nèi)皮細(xì)胞和血小板的炎性活化，CVF激活補(bǔ)體旁路的方式與體內(nèi)病理狀態(tài)下的補(bǔ)體活化高度一致。我們之前的研究表明，通過(guò)尾靜脈注射給予小鼠CVF，在0.02 U·g-1(即10 μg·kg-1)的劑量下短時(shí)間內(nèi)就可以完全激活血清補(bǔ)體[6]。本研究中我們選用25 μg·kg-1的劑量，這一劑量高于前期采用的激活小鼠血清補(bǔ)體的劑量，因此可確切誘導(dǎo)小鼠血清補(bǔ)體旁路的過(guò)度激活。本實(shí)驗(yàn)我們利用CVF開(kāi)展了補(bǔ)體旁路激活致小鼠急性肺損傷的研究，結(jié)果表明補(bǔ)體旁路激活可以導(dǎo)致小鼠肺部急性炎癥的發(fā)生，其中以30 min至1 h的炎癥反應(yīng)最為明顯。

Fig 3 Concentration of inflammatory mediator and adhesion molecule in ±s,n=8)

A:IL-6; B: TNF-α; C: P-selectin; D: ICAM-1.*P<0.05,**P<0.01vsPBS control group;##P<0.01vs15 min CVF group;△△P<0.01vs15 min,30 min,1 h and 2 h CVF groups

研究結(jié)果顯示，補(bǔ)體旁路激活后引起小鼠肺部的炎癥細(xì)胞明顯聚集和浸潤(rùn)，MPO活性明顯上調(diào)，BALF中蛋白含量增加，提示微血管通透性增加。但從病理學(xué)角度來(lái)講，補(bǔ)體旁路激活可以引起小鼠肺部的急性炎癥變化，但損傷癥狀并不明顯。上述結(jié)果表明，在我們?cè)O(shè)置的時(shí)間點(diǎn)，補(bǔ)體旁路過(guò)度激活可以引起小鼠肺部急性炎癥的發(fā)生。而在炎癥發(fā)生的過(guò)程中，肺系數(shù)和肺含水量無(wú)明顯變化，這一結(jié)果可能與補(bǔ)體旁路激活誘導(dǎo)小鼠肺部急性炎癥反應(yīng)的病變程度有關(guān)，也可能與我們實(shí)驗(yàn)設(shè)置的時(shí)間點(diǎn)有關(guān)。

P-selectin和ICAM-1是一類在炎癥啟動(dòng)和發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用的黏附分子。CVF進(jìn)入血液后，通過(guò)激活補(bǔ)體活化內(nèi)皮細(xì)胞，活化的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)選擇素等黏附分子，在血管內(nèi)皮上黏附炎癥細(xì)胞，從而啟動(dòng)炎癥和引發(fā)后續(xù)效應(yīng)。P-selectin主要分布于內(nèi)皮細(xì)胞和血小板，可以介導(dǎo)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞表面滾動(dòng)和最初結(jié)合，啟動(dòng)炎癥的早期反應(yīng)[7]。本研究顯示，CVF組在給藥30 min后,BALF中P-selectin含量即有明顯增加，在血清中隨時(shí)間延長(zhǎng)P-selectin水平也持續(xù)上升，因此P-selectin的提高間接提示了炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)和持續(xù)。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族中的成員之一，可引起炎癥細(xì)胞牢固黏附并跨內(nèi)皮移行至血管外，參與炎癥的發(fā)生發(fā)展[8]，ICAM-1通常在炎癥反應(yīng)數(shù)小時(shí)后才會(huì)出現(xiàn)高峰。我們之前的研究結(jié)果也顯示，補(bǔ)體旁路激活刺激人微血管內(nèi)皮細(xì)胞后的數(shù)小時(shí)內(nèi)ICAM-1就會(huì)出現(xiàn)表達(dá)高峰[9]。在本研究中，未檢測(cè)到注射CVF后BALF中ICAM-1的表達(dá)上調(diào)，但在血清中可以看到ICAM-1含量在1 h時(shí)間點(diǎn)后開(kāi)始明顯增加，其原因尚待進(jìn)一步研究。

IL-6和TNF-α是介導(dǎo)急性期炎癥反應(yīng)重要的炎癥介質(zhì)，廣泛參與了炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)、放大過(guò)程，可激活內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生其他炎癥介質(zhì)和黏附分子，引起急性期反應(yīng)，啟動(dòng)炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10-11]。本研究中，注射CVF后BALF和血清中IL-6和TNF-α的變化模式不同，BALF中IL-6和TNF-α的水平在1 h和6 h時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)雙高峰，血清中IL-6和TNF-α的水平在1 h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到峰值，隨后表達(dá)降低，說(shuō)明肺部中的炎癥反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，而血液中的炎癥效應(yīng)呈一過(guò)性，提示肺部組織是補(bǔ)體旁路激活引發(fā)炎癥效應(yīng)的主要效應(yīng)靶器官之一。在我們測(cè)定的指標(biāo)中，P-selectin、ICAM-1、IL-6和TNF-α雖然在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中分別扮演著不同的角色，但它們共同參與和推動(dòng)了這一急性炎癥的病理變化過(guò)程。

綜上所述，補(bǔ)體旁路激活可以在小鼠肺部引起急性炎癥，主要表現(xiàn)為肺部組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、黏附分子和炎性因子釋放增加，其病理變化以靜脈注射后30 min至1 h最為明顯，呈現(xiàn)出急性肺損傷的早期炎癥病理變化，本研究可以為后續(xù)的模型構(gòu)建和篩選實(shí)驗(yàn)提供明確的參考依據(jù)。

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Inflammatory mechanism of acute lung injury in mice induced by activation of complement alternative pathway

GUO Jing1, LI Min2, YANG Fu-mei1, SUN Qian-yun1

(1.CenterforPharmacologyandDrugScreening,KeyLaboratoryofChemistryforNaturalProducts,GuizhouProvinceandChineseAcademyofSciences,Guiyang550002,China;2.GeneralWard,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang550002,China)

Aim To study the development of acute lung inflammation in mice induced by activation of the complement alternative pathway and the changes of the related indicators, and to provide an ideal pathological model of acute lung inflammation in mice for drug screening and intervention.Methods Cobra venom factor(CVF) was used to activate complement alterna-tive pathway of SPF Kunming mice by intravenous injection. According to different sampling time, the mice were divided into 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 6 h group, and the parallel PBS control groups were set at the same time. Lung coefficient, lung water content, myeloperoxidase(MPO) activity, BALF cell number and protein content were tested. The pathological changes of lung tissue were observed by HE staining. The concentration of IL-6, TNF-α, P-selectin and ICAM-1 in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) and serum were determined by ELISA.Results CVF caused pulmonary inflammatory cell infiltration in mice obviously. Compared with PBS groups, MPO activity of lung tissue, BALF cell and the protein concentration were significantly increased. The contents of IL-6, TNF-α, P-selectin in BALF and serum were increased, and the content of ICAM-1 in serum was also increased. The content of P-selectin in BALF reached the first peak at 30 min point, the content of IL-6 and TNF-α in BALF reached the first peak at 1 h point, but the indicators had no further changes at 2 h point, and all the indicators rose again at 6 h point. The levels of IL-6 and TNF-α in serum reached peak at 1 h point,then the content showed lower levels at the subsequent time points. The levels of P-selectin and ICAM-1 in serum increased along the time. Lung coefficient, lung water content and ICAM-1 of the BALF showed no significant alteration.Conclusion The activation of the complement alternative pathway can lead to acute lung inflammation in mice and the inflammatory response is the most obvious at 30 min to 1 h. The study could provide an ideal pathological model of acute lung inflammation in mice for drug screening and intervention.

cobra venom factor(CVF)；acute lung injury；mouse model；alternative complement pathway；inflammation; adhesion molecules；inflammatory mediator

2016-07-22，

2016-08-22

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 30560035)；貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目[No 黔科合平臺(tái)人才(2016)5625號(hào)]；貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)項(xiàng)目(百層次)[No黔科合人才(2016)4018號(hào)]

郭 靜(1988-)，女，碩士，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail：gjing21@sina.com；

李 敏(1967-)，女，主任醫(yī)師，研究方向：急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制及防治，通訊作者，E-mail：limin_67@hotmail.com；

時(shí)間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.018.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.009

A

1001-1978(2016)11-1521-06

R-332；R322.35；R364.5；R392.11；R392.12； R563.022；R996.3

孫黔云(1968-)，男，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)與新藥發(fā)現(xiàn)，通訊作者，E-mail：sunqy@hotmail.com