鮮孟君，張雙雙，劉建祥，陸孫杰

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物學(xué)研究所 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438)

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擬南芥膜相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子bZIP60活化后與轉(zhuǎn)錄因子MYB7互作共同調(diào)控種子萌發(fā)

鮮孟君，張雙雙，劉建祥，陸孫杰

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物學(xué)研究所 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438)

膜相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要作用.擬南芥膜相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子bZIP60在響應(yīng)生物和非生物脅迫中發(fā)揮功能.本研究發(fā)現(xiàn)bZIP60的非常規(guī)剪接受ABA誘導(dǎo)，bZIP60的突變體zip60在ABA處理后綠色子葉率顯著降低，說明bZIP60負(fù)調(diào)控ABA誘導(dǎo)的種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā).為了進(jìn)一步研究bZIP60在其中的作用，以bZIP60Δ為誘餌蛋白對(duì)cDNA文庫進(jìn)行篩選，最后篩選到24個(gè)可能與bZIP60Δ相互作用的蛋白.體外pull-down實(shí)驗(yàn)證明bZIP60Δ蛋白與其中一個(gè)MYB7蛋白有直接相互作用，熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BiFC)證明bZIP60Δ蛋白與MYB7蛋白在煙草細(xì)胞中具有相互作用.MYB7之前報(bào)道在種子萌發(fā)過程中通過抑制ABI5的表達(dá)來解除ABA對(duì)種子萌發(fā)的抑制.這些實(shí)驗(yàn)表明bZIP60活化后可能通過與MYB7相互作用協(xié)同拮抗ABA信號(hào)，促進(jìn)種子萌發(fā).

ABA； bZIP60； MYB7； 蛋白-蛋白相互作用； 種子萌發(fā)

植物缺乏自主移動(dòng)的能力，容易受到環(huán)境中不利條件的影響.環(huán)境脅迫，特別是高溫、鹽堿、干旱會(huì)影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育.種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)發(fā)育的第一步，當(dāng)環(huán)境條件不利于種子萌發(fā)時(shí)，保持種子的休眠狀態(tài)對(duì)于提高植物生存率有著至關(guān)重要的作用[1].種子從休眠到萌發(fā)的轉(zhuǎn)變是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中最關(guān)鍵的階段，受到很多環(huán)境因素和自身因素的共同作用，包括光照、溫度以及種子中存在的各種激素，其中脫落酸(Abscisic acid， ABA)對(duì)于種子休眠具有重要的作用，ABA能夠促進(jìn)種子中蛋白和脂肪的合成，促進(jìn)種子對(duì)脫水的耐受性，抑制種胚的萌發(fā)，使種子進(jìn)入休眠狀態(tài)[2].ABA除了能促進(jìn)種子發(fā)育和休眠外，也在胚胎發(fā)育、氣孔開閉、逆境抗性等多個(gè)過程中具有重要作用[3].

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是分泌蛋白和膜蛋白修飾和折疊的場(chǎng)所，其中蛋白合成和折疊是一個(gè)非常精細(xì)控制的動(dòng)態(tài)平衡過程.當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白的折疊受到逆境等因素干擾時(shí)，未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白就會(huì)大量積累，細(xì)胞就會(huì)啟動(dòng)一種非常保守的未折疊蛋白應(yīng)答(Unfolded Protein Response， UPR)機(jī)制，調(diào)節(jié)一系列下游基因的表達(dá)，通過提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白折疊能力或加速錯(cuò)誤折疊蛋白降解，幫助細(xì)胞達(dá)到一個(gè)新的平衡狀態(tài)[4-5].對(duì)模式生物擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，植物在轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面上有4條重要的UPR信號(hào)通路：第一條通路是由膜相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子肽酶(membrane-associated transcription factor peptidase)S2P(Site-2 Protease)及其酶切底物bZIP28來介導(dǎo)，第二條是由具有蛋白激酶活性和RNase活性的IRE1及其底物bZIP60來介導(dǎo)，另外兩條是由NAC家族膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子NAC062和NAC089來介導(dǎo)[4-7].

bZIP17是一個(gè)定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的與bZIP28序列非常相似的膜相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，在逆境脅迫(如高鹽，高溫等)下，bZIP17會(huì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上轉(zhuǎn)移到高爾基體中，被定位于高爾基體的S1P(Site-1 Protease)和S2P酶切，產(chǎn)生沒有跨膜域的活化形式進(jìn)入細(xì)胞核中，并且啟動(dòng)下游抗逆基因的表達(dá)[8-9].最近的研究發(fā)現(xiàn)，膜相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子bZIP17在ABA處理時(shí)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，并且其酶切形式在ABA處理后大量增加[10].S2P缺失突變體s2p的種子在萌發(fā)時(shí)對(duì)ABA非常敏感[10].bZIP17的截短形式可以互補(bǔ)s2p突變體對(duì)ABA的敏感性[10].bZIP17酶切活化后能上調(diào)一些ABA信號(hào)通路中的負(fù)調(diào)控因子，從而負(fù)調(diào)控ABA信號(hào)通路，促進(jìn)種子萌發(fā)[10].

bZIP60也是一個(gè)含有跨膜域，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的轉(zhuǎn)錄因子，在逆境脅迫(如高溫，病原菌侵染等)下，bZIP60的mRNA保守的雙莖環(huán)結(jié)構(gòu)被定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的IRE1剪接，并產(chǎn)生閱讀框移碼，從而編碼不含跨膜域的bZIP60蛋白，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄[11-12].過量表達(dá)bZIP60時(shí)，可以增強(qiáng)擬南芥對(duì)鹽脅迫的抗性[13].之前的酵母雙雜交試驗(yàn)證明bZIP60和bZIP17具有相互作用[14]，這提示bZIP60也可能參與到種子萌發(fā)過程，但目前還未見報(bào)道.

本實(shí)驗(yàn)利用擬南芥bZIP60突變體zip60和IRE1A與IRE1B雙突變體ire1a1b研究發(fā)現(xiàn)，在含有ABA的平板上生長(zhǎng)時(shí)，兩種突變體的綠色子葉率明顯比野生型低，bZIP60 mRNA的前體形式(bZIP60U)和剪接形式(bZIP60S)在受到ABA處理后都上調(diào)表達(dá).以bZIP60的截短形式(bZIP60Δ)作為誘餌蛋白進(jìn)行酵母雙雜交篩選cDNA文庫，得到多個(gè)與bZIP60Δ互作的蛋白，其中MYB7與bZIP60Δ的互作用在pull-down、熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)、雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BiFC)中得到進(jìn)一步驗(yàn)證.MYB7在種子萌發(fā)過程中通過抑制ABI5的表達(dá)來解除ABA對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用.這些結(jié)果說明bZIP60可能通過與MYB7和/或bZIP17互作，通過拮抗ABA信號(hào)來促進(jìn)種子萌發(fā).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所使用的植物材料有擬南芥(Arabidopsisthaliana)Columbia生態(tài)型(Col-0)，擬南芥Columbia背景突變體zip60(SALK_050203)，煙草(Nicotianabenthamiana).所使用的菌株有大腸桿菌(Escherichiacoli)TOP10、DH5α、Rosette，農(nóng)桿菌菌株(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101，釀酒酵母菌株(Saccharomycescerevisiae)AH109.所使用的載體有pGADT7、pGBKT7、pXY104、pXY106、JW771、JW772、pETMALc-H、pGEX-4T-1.這些材料均為本實(shí)驗(yàn)室保存.酵母篩庫所用的prey文庫為Mate&PlateTMLibraryArabidopsis(Normalized) Lot#1109396A.

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的平皿培養(yǎng)

同批收獲的WT、zip60、ire1a1b種子用50%(體積比)的酒精消毒5min后，用0.3%的NaClO(體積比)消毒15min后，用滅菌水清洗3次，播種在含1.2%(質(zhì)量濃度)蔗糖和0.75%(質(zhì)量濃度)瓊脂的1/2MS固體培養(yǎng)基上，同時(shí)添加不同濃度的ABA，4℃放置3d后，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，22℃，光16h/暗8h，觀察植物萌發(fā)，統(tǒng)計(jì)出子葉率，進(jìn)行分析.

1.2.2 用ABA處理擬南芥幼苗

擬南芥野生型種子用50%(體積比)的酒精消毒5min后，用0.3%(體積比)的NaClO消毒15min后，用滅菌水清洗3次，播種在1.2%(質(zhì)量濃度)蔗糖和0.75%(質(zhì)量濃度)瓊脂的1/2MS固體培養(yǎng)基上，4℃放置3d后，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，22℃，光16h/暗8h，培養(yǎng)4d，取擬南芥浸泡在純水或者含有不同濃度的ABA的水中，浸泡4h后，用液氮凍后在-80℃保存，待提取總RNA.

1.2.3 擬南芥幼苗總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN)的使用說明提取RNA，總RNA在-80℃保存.總RNA用M-MLV(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，保持在-20℃.

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)(qRT-PCR)

實(shí)時(shí)定量PCR使用的試劑為SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa).定量實(shí)驗(yàn)在Bio-Rad CFX96TM儀器上運(yùn)行，得到數(shù)據(jù)后分析作圖.

1.2.5 誘餌蛋白在酵母中表達(dá)、毒性測(cè)試和自激活檢測(cè)

以bZIP60Δ為誘餌蛋白進(jìn)行篩庫.在篩庫之前，對(duì)誘餌質(zhì)粒pGBKT7-bZIP60Δ在酵母AH109中的表達(dá)進(jìn)行了Western blot檢測(cè)，使用pH=7.4的蛋白提取buffer(0.125mol/L Tris-HCl，0.37mol/L NaCl， 2.5mmol/L EDTA， 1% SDS， 1%β-ME)分別提取轉(zhuǎn)入pGBKT7-bZIP60Δ和pGBKT7空載體的酵母菌株中的總蛋白.使用的Anti-Myc抗體(Sigma)進(jìn)行Western blot檢測(cè).同時(shí)在SD-T、SD-TH和SD-THA平板上對(duì)轉(zhuǎn)入pGBKT7-bZIP60Δ的酵母進(jìn)行了毒性測(cè)試和自激活活性檢測(cè).

1.2.6 酵母雙雜交篩選與bZIP60Δ相互作用的蛋白

將含有誘餌質(zhì)粒的酵母菌株AH109與含有cDNA文庫的Mate&PlateTMLibrary進(jìn)行接合(mating)，在搖床中低速培養(yǎng)20～24h，然后將接合后的菌液在SD/-Trp-Leu-His上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，將在SD/-Trp-Leu-His上的酵母菌落劃線到新的SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上.培養(yǎng)后將在SD/-Trp-Leu-His-Ade上的酵母菌落重新劃線，利用新長(zhǎng)出來的酵母菌落做菌落PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序，對(duì)得到的序列進(jìn)行功能分析和亞細(xì)胞定位分析，信息來自于TAIR網(wǎng)站(http：∥www.Arabidopsis.org/).

1.2.7 酵母雙雜交驗(yàn)證

構(gòu)建含有全長(zhǎng)CDS的pGADT7-MYB7載體，與誘餌質(zhì)粒pGBKT7-bZIP60Δ共轉(zhuǎn)化到AH109中后，涂在SD/-Trp-Leu的酵母平板上，挑取單菌落30℃培養(yǎng)至OD600為0.5，打點(diǎn)在SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-Leu-His-Ade酵母平板上，在30℃倒置培養(yǎng)2d，觀察結(jié)果.

1.2.8 His-MBP-MYB7與GST-bZIP60Δ重組蛋白的表達(dá)和純化

將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體pETMALc-H-MYB7、pGEX-4T-1-bZIP60Δ和pGEX-4T-1空載體分別轉(zhuǎn)化到E.coliRosette中，37℃培養(yǎng)至OD600為1，加入IPTG至終濃度為0.2mmol/L，16℃過夜培養(yǎng)，收集菌體，離心取菌體后加入相應(yīng)的蛋白結(jié)合緩沖液，加入溶菌酶至終濃度0.5mg/mL，冰浴30min，每隔10min 震蕩一次，冰浴后超聲波破碎，運(yùn)行3s，停5s，100次，超聲波破碎完后4℃ 5000r/min離心20min，取上清至新的EP管.其中pETMALc-H-MYB7裂解液中加入Ni-NTA Agarose(Qiagen)，pGEX-4T-1-bZIP60Δ和pGEX-4T-1空載體的裂解液中加入Glutathione-Superflow Resin(Clontech)， 4℃ 孵育3h，4℃ 200r/min離心 1min，去上清，用蛋白結(jié)合緩沖液清洗珠子3次，用洗脫緩沖液洗脫含有His-tag的重組蛋白，洗脫液置于冰上待用.GST-tag純化的蛋白至清洗3次后，準(zhǔn)備下一步做pull-down.

1.2.9 體外pull-down實(shí)驗(yàn)

將純化好的His-MBP-MYB7蛋白適量加入到結(jié)合在Resin上的GST-bZIP60Δ和GST的管子中，4℃孵育2h，4℃下200r/min離心2min去上清，用蛋白結(jié)合緩沖液清洗兩遍，去上清，加入適量的2×SDS loading buffer，95℃加熱10min，洗脫蛋白后進(jìn)行Western blot，用Anti-His抗體(Abmart)檢測(cè)信號(hào).

1.2.10 熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體JW771-MYB7和JW772-bZIP60Δ，空載體JW772分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，30℃搖床震蕩至OD600為1，離心取菌體，用等體積煙草轉(zhuǎn)化緩沖液將菌體懸起后兩兩混合注射到煙草葉片中，溫室培養(yǎng)3d后取葉片，將顯色液(200×Beetle Luciferin， Potassium Salt溶液用水稀釋到1倍)涂抹于煙草葉片的表面，靜置10min后，用植物活體成像儀(LB985)觀察熒光信號(hào).

1.2.11 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BiFC)

將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pXY104-MYB7和pXY106-bZIP60Δ，空載體pXY104分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，30℃搖床震蕩培養(yǎng)至OD600為1，離心取菌體，用等體積煙草轉(zhuǎn)化緩沖液將菌體懸起后兩兩混合注射到煙草葉片中，溫室培養(yǎng)3d后取煙草葉片，用熒光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM A710)觀察相應(yīng)的熒光信號(hào).

2 結(jié)果與分析

2.1 bZIP60在種子萌發(fā)過程中負(fù)調(diào)控ABA信號(hào)

擬南芥bZIP60是UPR通路中的重要轉(zhuǎn)錄因子.有報(bào)道指出bZIP60響應(yīng)高鹽脅迫，過量表達(dá)bZIP60可以提高植物的耐鹽能力[13，15]，鹽脅迫導(dǎo)致ABA的積累[16-17]，這提示bZIP60可能也參與調(diào)控ABA信號(hào)，但目前還沒有其在種子萌發(fā)過程中參與調(diào)控ABA信號(hào)的報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)利用擬南芥bZIP60突變體zip60，和負(fù)責(zé)剪切bZIP60 mRNA的IRE1雙突變體ire1a1b，來研究bZIP60在種子萌發(fā)過程中的作用.野生型擬南芥和zip60、ire1a1b的種子在不含ABA的平板上生長(zhǎng)9d后，3種材料的種子萌發(fā)和生長(zhǎng)情況基本一致(圖1(a))，在含有1.2μmol/L ABA的平板上生長(zhǎng)9d后，發(fā)現(xiàn)bzip60，ire1a1b的生長(zhǎng)狀態(tài)明顯比WT差(圖1(a))，統(tǒng)計(jì)顯示bzip60和ire1a1b的綠色子葉率(η綠色子葉)也明顯比WT低(圖1(b)).用qRT-PCR檢測(cè)在以上兩種平板上生長(zhǎng)的WT苗中bZIP60U和bZIP60S[11]的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在1.2μmol/L ABA平板上生長(zhǎng)時(shí)，bZIP60U和bZIP60S的表達(dá)量都上調(diào)(圖2(a)，(b)).由于在ABA平板上生長(zhǎng)的WT比較小，我們用生長(zhǎng)3d與之同等大小的WT苗作為對(duì)照，qRT-PCR結(jié)果顯示，生長(zhǎng)3d 的WT中bZIP60U和bZIP60S的表達(dá)量基本和生長(zhǎng)9d的WT一致(圖2(a)，(b))，這說明bZIP60U和bZIP60S確實(shí)受ABA誘導(dǎo)表達(dá)，而非受生長(zhǎng)時(shí)期的影響.為了進(jìn)一步驗(yàn)證bZIP60U和bZIP60S是受ABA誘導(dǎo)表達(dá)的，將正常1/2MS平板上生長(zhǎng)4d的WT苗，分別用水、10μmol/L和100μmol/L ABA處理4h，用qRT-PCR檢測(cè)bZIP60U和bZIP60S的表達(dá)情況，結(jié)果顯示bZIP60U和bZIP60S的表達(dá)量隨著ABA濃度的增加而增加(圖2(c)，(d)).這些結(jié)果說明ABA處理可以誘導(dǎo)bZIP60前體mRNA及剪接活化形式mRNA，bZIP60負(fù)調(diào)控ABA對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用而促進(jìn)種子萌發(fā).之前報(bào)道IRE1A和IRE1B調(diào)控了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫下bZIP60的非常規(guī)剪接[11-12]，因?yàn)镮RE1雙突變體ire1a1b與bZIP60突變體zip60有相似表型，因此我們推測(cè)ABA誘導(dǎo)的bZIP60的非常規(guī)剪接同樣受IRE1A和IRE1B的調(diào)控.

2.2 酵母雙雜交篩選與bZIP60Δ互作的蛋白

蛋白間的相互作用和細(xì)胞的各種生理過程緊密相關(guān).為了進(jìn)一步研究bZIP60在負(fù)調(diào)控ABA信號(hào)中的機(jī)制，我們用酵母雙雜交試驗(yàn)篩選cDNA文庫中與之有相互作用的蛋白.全長(zhǎng)的bZIP60是一個(gè)定位在ER膜上的轉(zhuǎn)錄因子，其N端是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活域[11](圖3(a))，為了使bZIP60在酵母雙雜交試驗(yàn)中不定位到ER上并消除其自激活活性，我們截去其跨膜域并破壞其N端的轉(zhuǎn)錄激活域，只將88～217aa的bZIP60構(gòu)建到誘餌載體上，形成pGBKT7-bZIP60Δ(圖3(a)).為了驗(yàn)證bZIP60Δ在酵母中的表達(dá)，通過Western blot檢測(cè)bZIP60Δ，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化pGBKT7-bZIP60Δ的酵母菌可以用Anti-Myc抗體檢測(cè)出一條約45ku的條帶，而轉(zhuǎn)化空載體的酵母菌則沒有這個(gè)蛋白的表達(dá)(圖3(b)).將質(zhì)粒pGBKT7-bZIP60Δ轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109感受態(tài)細(xì)胞中，涂在SD/-Trp平板上，酵母可以正常生長(zhǎng)，形態(tài)正常，說明bZIP60Δ對(duì)酵母的正常生長(zhǎng)沒有毒性作用(圖3(c)).將轉(zhuǎn)化后的酵母涂布在SD/-Trp-His和SD/-Trp-His-Ade篩選平板上，轉(zhuǎn)化空載體和pGBKT7-bZIP60Δ的酵母菌在以上兩種篩選平板上都不能生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)化陽性對(duì)照OsbZIP74(A)[18]的酵母菌可以生長(zhǎng)(圖3(c))，說明bZIP60Δ沒有自激活活性.

將轉(zhuǎn)化pGBKT7-bZIP60Δ的AH109和轉(zhuǎn)化cDNA文庫的Y187(Clontech Mate&PlateTM擬南芥cDNA文庫)進(jìn)行接合(mating)，然后涂布到SD/-Trp-Leu-His選擇培養(yǎng)基上.2～7d后挑取菌落直徑大于1mm的單菌落到SD/-Trp-Leu-His-Ade選擇培養(yǎng)基上.2～4d后挑選在四缺板上生長(zhǎng)的酵母菌落用PCR擴(kuò)增插入片段，并送公司測(cè)序.通過篩選，共得到43個(gè)閱讀框正確的克隆，去除重復(fù)序列后，得到24個(gè)候選基因(表1).在篩選到的候選基因中，MYB7在種子中有較高的表達(dá)，在ABA處理下，MYB7通過抑制ABI5的表達(dá)解除ABA信號(hào)通路對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用，說明MYB7在種子萌發(fā)過程中通過拮抗ABA信號(hào)促進(jìn)種子萌發(fā).bZIP60在種子萌發(fā)過程中負(fù)調(diào)控ABA信號(hào)很可能是通過與MYB7之間的互作來實(shí)現(xiàn)的.為了進(jìn)一步確認(rèn)bZIP60Δ和MYB7在酵母中的相互作用.我們重新構(gòu)建含有MYB7全長(zhǎng)CDS的載體pGADT7-MYB7，分別與對(duì)照空載體和誘餌質(zhì)粒pGBKT7-bZIP60Δ共轉(zhuǎn)到AH109感受態(tài)細(xì)胞中，打點(diǎn)在SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-Leu-His-Ade酵母平板上，30℃倒置培養(yǎng)2d，發(fā)現(xiàn)只有共轉(zhuǎn)化pGADT7-MYB7和pGBKT7-bZIP60Δ的酵母菌能在四缺平板上生長(zhǎng)，而pGADT7-MYB7與空載體共轉(zhuǎn)化的酵母菌則不能(圖3(d))，這表明bZIP60Δ與MYB7在酵母中確實(shí)有相互作用.

基因位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的蛋白推定的功能AT1G13440Glyceraldehyde?3?phosphatedehydrogenaseC2(GAPC2)glyceraldehydes?3?phosphatedehydrogenaseactivity，responsetooxidativestress；glycolysis；gluconeogenesisAT1G17760(CSTF77)proteinbinding；mRNAprocessingAT1G20100UnknownproteinunknownAT1G47380Proteinphosphatase2Cfamilyproteinmetalionbinding，proteinserine/threoninephosphataseactivityAT3G10910DAF?LIKEGene1zincionbindingAT1G62750Snowycotyledon1(SCO1)GTPbinding；seedgermination；translationelongationfactoractivity；chlo?roplastorganizationAT1G68560Alpha?xylosidase1(XYL1)xylancatabolicprocess；alpha?N?arabinofuranosidaseactivity；xylan1，4?be?ta?xylosidaseactivityAT2G16720MYBdomainprotein7(MYB7)responsetoabscisicacidstimulus/jasmonicacidstimulus/gibberellinsstimu?lus/salicylicacidstimulus/cadmiumion/saltstress/ethylenestimulus；tran?scriptionfactoractivityAT2G269304?(cytidine5′?phospho)?2?c?methyl?d?erithritolki?nase(CDPMEK)4?(cytidine5′?diphospho)?2?C?methyl?D?erythritolkinaseactivity，ATPbindingAT3G01280Voltagedependentanionchannel1porinactivity，proteinbinding，voltage?gatedanionchannelactivityAT3G56770Protein＿codingbasichelix?loop?helix(bHLH)DNA?bindingsuperfamilyproteinresponsetochitin；transcriptionfactoractivityAT4G26860Predictedpyridoxalphosphate?dependentenzymepyridoxalphosphatebindingAT4G29060Embryodefective2726(emb2726)translationelongationfactoractivity；embryonicdevelopmentendinginseeddormancyAT4G38620MYBdomainprotein4(MYB4)responsetoauxinstimulus/ethylenestimulus/abscisicacidstimulus/jasmon?icacidstimulus/gibberellinsstimulus/salicylicacidstimulus/cadmiumion/saltstress/UV?B；transcriptionfactoractivityAT5G08280Hydroxymethylbilanesynthase(HEMC)chlorophyllbiosyntheticprocess；hydroxymethylbilanesynthaseactivityAT5G12960Unknownproteinalpha?L?arabinofuranosidaseactivityAT5G15090Voltagedependentanionchannel3(VDAC3)proteinbinding，voltage?gatedanionchannelactivityAT5G22640Embryodefective1211(emb1211)proteinbinding，proteintransporteractivityAT5G28540(BIP1)responsetoheat；proteinfolding；ER?associatedproteincatabolicprocessAT5G42780Homeoboxprotein27(HB27)metalionbinding，proteinbinding，transcriptionfactoractivity，sequence?specificDNAbindingAT5G54430Protein＿codinguniversalstressprotein(USP)fam?ilyprotein，basichelix?loop?helix(bHLH)familyproteinresponsetomoleculeoffungalorigin/stressAT5G55860UnknownproteinunknownAT5G61530RhoGAPfamilyproteinRhoGTPaseactivatoractivity；signaltrasductionAT5G67500Voltagedependentanionchannel2voltage?gatedanionchannelactivity；aniontransport；responsetobacterium

2.3 bZIP60Δ與MYB7相互作用的驗(yàn)證

采用pull-down實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證bZIP60Δ和MYB7間是否具有直接相互作用.將純化好的His-MBP-MYB7蛋白加入結(jié)合在固相上的GST或GST-bZIP60Δ，經(jīng)孵育和清洗后加入適量的2×SDS loading buffer，95℃加熱10min，將蛋白洗脫下來，用Anti-His抗體檢測(cè).結(jié)果表明His-MBP-MYB7和GST-bZIP60Δ共孵育的洗脫液中有強(qiáng)的雜交信號(hào)，而His-MBP-MYB7和GST共孵育的洗脫液中沒有雜交信號(hào)(圖4(a))，說明bZIP60Δ在體外能夠直接與MYB7互作.

為了驗(yàn)證在植物體細(xì)胞中bZIP60Δ和MYB7之間的相互作用，我們進(jìn)一步采用熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn).在熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中，我們構(gòu)建了與熒光素酶N端(nLUC)融合的JW771-MYB7載體和與熒光素酶C端(cLUC)相融合的JW772-bZIP60Δ，將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體以及空載體JW772分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，兩兩混合注射到煙草葉片中，溫室培養(yǎng)3d后取葉片涂上顯色液，用植物活體成像儀觀察熒光信號(hào)，從結(jié)果中可以看到MYB7-nLUC和cLUC-bZIP60Δ在煙草葉表皮細(xì)胞中出現(xiàn)熒光信號(hào)，而MYB7-nLUC和cLUC的組合沒有檢測(cè)到熒光信號(hào)(圖4B).在雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中，我們構(gòu)建了與黃色熒光蛋白C端(cYFP)相融合的pXY104-MYB7和與黃色熒光蛋白N端(nYFP)融合的pXY106-bZIP60Δ，然后與空載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，兩兩混合注射到煙草葉片中，溫室培養(yǎng)3d 后直接取葉片用熒光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)nYFP-bZIP60Δ和MYB7-cYFP共同注射的煙草葉表皮細(xì)胞核中出現(xiàn)強(qiáng)的熒光信號(hào)，而nYFP-bZIP60Δ和cYFP的組合以及nYFP和MYB7-cYFP的組合都沒有檢測(cè)到熒光信號(hào)(圖4(c)).這些實(shí)驗(yàn)證明了在煙草葉片中MYB7和bZIP60Δ可以相互作用.

3 討 論

種子從休眠狀態(tài)到萌發(fā)經(jīng)歷了很多生理生化的變化，受到各種內(nèi)源因素和環(huán)境因素的共同影響，例如溫度、植物激素、光照等.這其中，ABA/GA的平衡狀況起到重要的作用.本研究發(fā)現(xiàn)zip60在含有ABA的平皿上表現(xiàn)出比野生型延遲長(zhǎng)出綠色的子葉，同時(shí)通過酵母雙雜交篩庫，找到一個(gè)互作蛋白MYB7，該蛋白可以通過抑制ABA誘導(dǎo)的種子休眠從而促進(jìn)種子發(fā)芽[19]，通過酵母雙雜交、體外pull-down，雙分子熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)分別證明了bZIP60能夠與MYB7蛋白在植物體外和植物體內(nèi)相互作用，暗示了bZIP60可能與MYB7共同作用，也是種子萌芽過程中ABA信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)控因子.同時(shí)，bZIP60和MYB7的突變體在ABA相關(guān)的種子萌芽的表型上一致，說明這兩個(gè)蛋白可能具有協(xié)同作用.已知MYB7可以間接負(fù)調(diào)控ABA信號(hào)通路中ABI5的表達(dá)，因此，我們推測(cè)bZIP60和MYB7的相互作用可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子MYB7對(duì)下游基因的調(diào)控.

bZIP60是具有跨膜結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，正常條件下無法入核因而不能調(diào)控下游基因表達(dá).當(dāng)植物感應(yīng)到脅迫信號(hào)后，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的IRE1A、IRE1B可以特異性剪切bZIP60 mRNA，使其失丟失編碼跨膜域疏水氨基酸的那一段mRNA序列，隨后剪接形式mRNA翻譯出來的bZIP60可以進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)UPR下游基因響應(yīng)[12].bZIP60響應(yīng)高鹽脅迫，F(xiàn)ujita通過過表達(dá)篩選發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，過表達(dá)全長(zhǎng)bZIP60 cDNA可以提高植物對(duì)高鹽的耐受性[15]，之后Tang也發(fā)現(xiàn)在植物細(xì)胞培養(yǎng)中，這種現(xiàn)象同樣存在[13]，但相關(guān)分子機(jī)理不清楚.本研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期的ABA處理或?qū)⒂啄鄣臄M南芥苗短期ABA處理均能誘導(dǎo)bZIP60的非常規(guī)剪接.已知高鹽脅迫可誘導(dǎo)ABA積累，因此，高鹽脅迫下ABA含量的上升可能導(dǎo)致了bZIP60的活化.

bZIP17也是定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，Liu等發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)去掉跨膜域的bZIP17(bZIP17ΔC)可增強(qiáng)擬南芥對(duì)高鹽的耐受性[20]，而bZIP17突變體bzip17會(huì)表現(xiàn)出對(duì)鹽敏感的表型，鹽脅迫響應(yīng)基因ATHB7、PP2C-LIKE、RD29b等在bzip17突變體中的上調(diào)降低[8].Zhou等發(fā)現(xiàn)S2P通過活化bZIP17負(fù)調(diào)控ABA信號(hào)通路，從而促進(jìn)種子萌芽[10].本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫應(yīng)答中的另一重要調(diào)控因子bZIP60也在去除ABA參與的種子休眠、促進(jìn)種子萌芽中發(fā)揮作用.之前發(fā)現(xiàn)bZIP60和bZIP17具有相互作用[14]，因此S2P-bZIP17通路和IRE1-bZIP60通路可能在調(diào)控種子萌芽中也有互作(crosstalk).種子萌芽過程中如何開啟這兩條通路是一個(gè)有趣的問題，是種子萌芽過程導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生了錯(cuò)誤折疊蛋白的積累，還是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或內(nèi)膜系統(tǒng)膜結(jié)構(gòu)的改變打開了這兩條信號(hào)通路將是今后研究的重點(diǎn).bZIP60的活化受ABA調(diào)控以及bZIP60與MYB7相互作用調(diào)控種子萌發(fā)具有重要意義，這些結(jié)果為我們更好地理解植物種子萌芽的分子機(jī)理提供了參考.

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Membrane-Associated Transcription Factor， bZIP60，Is Activated by ABA and Interacts with MYB7 to Regulate Seed Germination inArabidopsis

XIAN Mengjun， ZHANG Shuangshuang， LIU Jianxiang， LU Sunjie

(State Key Laboratory of Genetic Engineering， Institute of Plant Biology， School of Life Sciences，F(xiàn)udanUniversity，Shanghai200438，China)

Membrane-associated transcription factors(MTFs) exert important roles in the regulation of plant growth， development and stress responses. TheArabidopsismembrane-associated transcription factor bZIP60 plays important roles in ER stress responses inArabidopsisin a manner dependent on the ER-localized IRE1 proteins. In this study， we found that the activation of bZIP60 through unconventional splicing was induced by ABA， and the greening rate of bZIP60 mutantzip60 during seed germination was significantly reduced after ABA treatment comparing to the wild-type control， indicating that bZIP60 negatively regulates seed dormancy. In order to investigate the biological function of bZIP60 for further study， yeast two-hybrid screening with a truncated form of bZIP60(bZIP60Δ ) was performed. Totally 24 potential interactors were found and one of them， MYB7 was focused in the current study. The interaction between bZIP60Δ and MYB7 was confirmed in aninvitropull-down assay. Furthermore， firefly luciferase complementation imaging(split luciferase) assay and bimolecular fluorescence complementation(BiFC) assay demonstrated that bZIP60Δ interacts with MYB7 in plants. MYB7 is known for its role in negatively regulating ABA signaling during seed germination inArabidopsis. Thus， our results suggest that bZIP60 is activated by ABA and interacts with MYB7 to modulate ABA signaling for promoting seed germination inArabidopsis.

ABA； bZIP60； MYB7； protein-protein interaction， seed germination

0427-7104(2016)05-0632-10

2016-01-27

教育部博士點(diǎn)基金(20130071110011)和國(guó)家自然科學(xué)基金(31400223)

鮮孟君(1992—)，女，碩士研究生；劉建祥，男，研究員，通訊聯(lián)系人；陸孫杰，男，助理研究員，通訊聯(lián)系人；E-mail：jianxiangliu@fudan.edu.cn或jiaxinfish@126.com.

Q 37

A