石 超，王亞倩，邵駿驊，霍克克

(復旦大學 生命科學學院 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438)

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結(jié)核分枝桿菌ICL抑制CTBP1表達并促進細胞凋亡

石 超，王亞倩，邵駿驊，霍克克

(復旦大學 生命科學學院 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438)

異檸檬酸裂合酶(Isocitrate Lyase, ICL)參與乙醛酸循環(huán)，是結(jié)核分枝桿菌能在宿主體內(nèi)潛伏的關(guān)鍵因素之一.為了探索ICL在結(jié)核菌與宿主相互作用中的地位，首先通過酵母雙雜交技術(shù)在人淋巴細胞cDNA文庫中篩選得到一個新的ICL相互作用蛋白CTBP1(C Terminal Binding Protein 1).然后分別采用GST pull-down和Co-IP實驗證實了這兩個蛋白在體外和體內(nèi)與ICL相互作用的特異性.通過使ICL在HEK293T細胞中過表達，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性CTBP1在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達都受到了抑制，同時導致細胞增殖減緩、凋亡加快，并出現(xiàn)G2/M期阻滯等改變.這些結(jié)果表明，結(jié)核菌ICL在參與介導細胞凋亡、影響宿主細胞活性的過程中起著重要的作用.

結(jié)核分枝桿菌； ICL； CTBP1； 蛋白質(zhì)相互作用； 細胞凋亡

結(jié)核病(Tuberculosis)是嚴重威脅人類健康的三大傳染病之一，雖然抗生素的發(fā)現(xiàn)一度抑制了結(jié)核病的蔓延，但耐單藥、耐多藥和泛耐藥結(jié)核菌的出現(xiàn)，讓它重新成為當代醫(yī)學的一個巨大挑戰(zhàn)[1]，它的耐藥性轉(zhuǎn)變也成為科研人員的重點研究對象[2].結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)(簡稱結(jié)核菌)是結(jié)核病的致病菌.結(jié)核菌的特點之一在于它感染宿主之后能成功逃避宿主的免疫攻擊，能以持續(xù)感染或休眠狀態(tài)繼續(xù)存活，當宿主免疫功能下降時，潛伏的病菌就可能被重新激活，發(fā)展成為活動性結(jié)核病[3].

結(jié)核菌在感染宿主初期被巨噬細胞吞噬，其所處的生存環(huán)境極端惡劣——低養(yǎng)分，低氧，低pH環(huán)境，存在各種抗菌物質(zhì).隨著糖分的消耗，結(jié)核菌的三羧酸循環(huán)下調(diào)，產(chǎn)能下降.此時，乙醛酸循環(huán)就可以作為一種回補途徑為結(jié)核菌繼續(xù)提供能量[4].脂肪酸經(jīng)過β-氧化分解為乙酰CoA，乙酰CoA進入乙醛酸循環(huán)，生成了草酰乙酸和琥珀酸，這一過程可以為三羧酸循環(huán)補充一些中間產(chǎn)物.三羧酸循環(huán)的產(chǎn)能原料是糖，而乙醛酸循環(huán)則用脂肪酸替代，這就為結(jié)核菌在不利的細胞環(huán)境中生存提供了可能.

異檸檬酸裂合酶(Isocitrate Lyase, ICL)是乙醛酸循環(huán)中第一個關(guān)鍵酶，能夠催化異檸檬酸裂解為乙醛酸和琥珀酸.前人的研究表明，當三羧酸循環(huán)被抑制時，如果ICL也被抑制，結(jié)核菌就很難繼續(xù)存活[5].在結(jié)核菌感染過程中，其ICL基因的mRNA表達上調(diào)[6].研究人員在小鼠的肺部、人類的肺部肉芽腫和壞死肉芽腫的淋巴細胞區(qū)發(fā)現(xiàn)，ICL的mRNA大幅增加[7].還有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核菌的PhoP突變株的毒性變?nèi)酰琅f持留在受感染小鼠體內(nèi)，因為這個突變株有更高的ICL表達水平[8].同時，ICL也可能是結(jié)核菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性的重要因素[9].這些研究結(jié)果都提示ICL對結(jié)核菌持續(xù)感染宿主具有重要的意義，但是其作用機制仍未完全清楚.

為了研究ICL在結(jié)核菌持續(xù)感染宿主細胞過程中的作用機理，本文以ICL為誘餌，通過酵母雙雜交方法篩選人淋巴細胞cDNA文庫，得到若干與之發(fā)生相互作用的蛋白，其中CTBP1(C Terminal Binding Protein 1)引起了我們的關(guān)注，CTBP1作為轉(zhuǎn)錄輔助因子在機體細胞生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用.本文對結(jié)核菌ICL和宿主細胞CTBP1的相互作用及其對細胞功能的影響進行了初步的探討.

1 材料與方法

1.1 材料

SfiⅠ限制性內(nèi)切酶和dNTP Mix購自TaKaRa 公司.Ligation High購自TOYOBO公司.EasyTaq DNA Ploymerase，EasyPfu DNA Ploymerase購自北京全式金公司.3-氨基-1，2，4-三唑(3-AT)，PEG3350購自Sigma 公司.X-gal，HEPES，Nodient P-40，IPTG，PMSF 為 Amresco 公司產(chǎn)品.蛋白酶抑制劑(protease inhibitor cocktail tables, complete EDTA-free)購自Roche公司.PVDF膜和化學發(fā)光底物檢測試劑購自Millipore公司.Opti-MEM購自Gibco公司.Lipofectamine 2000脂質(zhì)體和TRIzol購自Invitrogen 公司.

Protein G beads購自GE公司.Glutathione Sepharose 4B 購自Pharmacia Biotech 公司.Ni-NTA Agrose珠子購自Qiagen公司.鼠抗Myc和鼠抗Flag的單克隆抗體是北京全式金公司產(chǎn)品.鼠抗 GAPDH 的單克隆抗體購自Abmart公司.鼠抗GFP的單克隆抗體，兔抗 CTBP1 的單克隆抗體，HRP 交聯(lián)的羊抗兔二抗購自ProteinTech公司.HRP 交聯(lián)的兔抗鼠二抗購自Rockland 公司.逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)購自 Promega 公司.DMEM，F(xiàn)BS和ANNEXIN-FITC/PI凋亡試劑盒均購自上海索萊寶公司.

GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)和人淋巴細胞cDNA 文庫購自Clontech 公司.原核細胞表達載體 pGEX-5x-1 來自 Pharmacia Biotech，pET-28a來自 Novagen 公司；哺乳動物表達載體 pEF-Flag 和 pCMV-Myc 購自Invitrogen公司，pEGFP-C1、pDsRed-C1載體購自 Clontech 公司.用于轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株 TOP10 和表達菌株BL21(DE3)，哺乳動物細胞系 HEK293T 細胞株均為本實驗室保存.引物由上海杰李公司合成.

1.2 酵母雙雜交篩選和回轉(zhuǎn)驗證

本實驗采用Clontech公司的GAL4酵母雙雜交系統(tǒng).將ICL基因構(gòu)建到誘餌載體pGBKT7，并對pGBKT7-ICL進行自激活檢測，步驟為：將AH109酵母菌接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基，30℃震蕩過夜，次日轉(zhuǎn)接種子液到新的培養(yǎng)基，震蕩活化，直至OD600到0.6；離心收集菌體，用無菌水洗滌1次，0.1mol/L的LiAc洗滌2次，而后每個轉(zhuǎn)化依次加入240μL 50% PEG3350、36μL 1mol/L LiAc、5μL ssDNA(10 mg/mL)、1μg pGBKT7-ICL質(zhì)粒，完全混勻后進行水浴，30℃水浴30min，42℃水浴25min，30℃水浴1 h，離心收集菌體，用無菌水重懸混勻后涂布相應(yīng)的缺陷平板；30℃恒溫培養(yǎng)3d，然后檢測ADE2、HIS3和LacZ報告基因的活性.

通過自激活檢測后，對轉(zhuǎn)入了pGBKT7-ICL質(zhì)粒的AH109酵母菌進行培養(yǎng)，接入培養(yǎng)基并震蕩過夜，次日轉(zhuǎn)接活化；洗滌并收集菌體，再向收集的菌體中依次加入9.6mL 50% PEG3350、1440μL 1mol/L LiAc、200μL預變性的ssDNA、20μg人淋巴細胞文庫質(zhì)粒，完全混勻并水浴，最后用6～7mL無菌水重懸，混勻后涂布效率平板和缺陷平板；30℃恒溫培養(yǎng)3d，檢測ADE2、HIS3和LacZ報告基因的活性，得到陽性克?。怀樘彡栃钥寺〉慕湍纲|(zhì)粒，測序并進行BLAST比對，找到相關(guān)基因信息.回轉(zhuǎn)驗證時，選擇篩庫得到的“獵物基因”與誘餌克隆質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母，檢測報告基因被激活的情況驗證兩者之間的相互作用.

1.3 GST pull-down實驗

將ICL克隆構(gòu)建到原核表達載體pGEX-5x-1得到pGEX-5x-1-ICL，CTBP1克隆構(gòu)建到pET-28a載體得到pET-28a-CTBP1，以pGEX-5x-1空載體質(zhì)粒為對照，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3).將轉(zhuǎn)化子單菌落分別接種在含0.2mmol/L IPTG的LB培養(yǎng)基中，在30℃誘導培養(yǎng)4h，離心收集菌體.分離GST融合蛋白用PBS重懸，分離His融合蛋白用裂解緩沖液(50mmol/L sodium phosphate，300mmol/L NaCl，10mmol/L imidazole，pH 8.0)懸浮，超聲破碎細胞壁取上清，破壁前加入PMSF和蛋白酶抑制劑, 破壁后立即加入20% Triton X-100，并在冰上放置 30min.用Glutathione Sepharose 4B珠子結(jié)合沉淀細胞裂解液上清中的GST融合蛋白；用Ni-NTA珠子結(jié)合裂解液上清中的His融合蛋白，并用200μL洗滌緩沖液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 20mmol/L 咪唑, pH 8.0)洗滌珠子3次, 再用60μL 洗脫緩沖液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 250mmol/L 咪唑, pH 8.0)洗脫得到純化的His融合蛋白.將結(jié)合有GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B懸浮在500μL NETN緩沖液(100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl，0.5% NonidetP-40，1mmol/L PMSF)中，加入50μL純化好的His融合蛋白，4℃結(jié)合過夜，沉淀用Buffer H(20mmol/L HEPES，50mmol/L KCl，20% Glycerol，0.1% Nonidet P-40，0.007%β-巰基乙醇)洗滌3次.最終沉淀用anti-His單克隆抗體進行Western blot檢測.

1.4 免疫共沉淀實驗

分別構(gòu)建哺乳動物表達重組質(zhì)粒pEGFP-ICL和pCMV-Myc-CTBP1，將這2個重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)HEK293T細胞株，同時以pEGFP-ICL和pCMV-Myc空載體共轉(zhuǎn)染的細胞作為陰性對照.轉(zhuǎn)染后在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)24h，收獲并裂解細胞，在裂解上清中加入Protein G Agarose親和凝膠珠子，混勻后震蕩1h進行預沉淀，而后取上清加入2μg anti-Myc抗體，4℃震蕩1h后再加入Protein G Agarose親和凝膠珠子在4℃震蕩過夜，沉淀用anti-GFP和anti-Myc的單克隆抗體進行Western blot檢測.

1.5 細胞內(nèi)基因表達檢測

將pEGFP-ICL質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞，培養(yǎng)24～48h后用PBS洗滌，加入TRIzol 1mL，靜置15min后吹勻收集細胞，漩渦震蕩混勻.加入 0.2mL三氯甲烷，劇烈搖動10 s，室溫放置1min.4℃離心收集上清，轉(zhuǎn)移至另一新的RNase-free離心管中，并加入等體積的無水乙醇，轉(zhuǎn)入帶有2mL收集管的mini-spin 離心柱，室溫離心洗滌2次，將離心柱轉(zhuǎn)移至一新的1.5mL RNase-free離心管中，用適量DEPC水洗脫收集總RNA.

將1μg 總 RNA 加入微量離心管中并于70℃溫育10min，短暫離心后置于冰上，選用逆轉(zhuǎn)錄引物建立反轉(zhuǎn)錄體系，42℃溫育30min，85℃加熱10min.每個樣品取2μL作為模板，以待測基因的 RT-PCR專用引物為引物，在實時熒光定量 PCR 儀中進行反應(yīng)，每個基因進行 3個平行反應(yīng)，并使用 GAPDH 作為內(nèi)對照，相對定量地檢測CTBP1基因的表達情況.

1.6 流式細胞儀測定細胞周期

HEK293T細胞轉(zhuǎn)染24～48h后收獲，用PBS洗1次，并用PBS重懸制成單細胞懸液，快速加入-20℃ 預冷的75%乙醇，4℃固定1h或-20℃固定過夜.固定好的細胞用含0.1% FBS的PBS洗滌3次，得到的細胞沉淀用含50μg/mL的PI和50μg/mL的RNase A的PBS重懸，室溫避光反應(yīng)20min.200目(約74μm)尼龍網(wǎng)過濾，上機(FACS Calibur, Becton-Dickinson)做細胞周期檢測.

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡

HEK293T細胞轉(zhuǎn)染24～48h后用EDTA-free的胰酶消化，用PBS洗滌2次，加入200μL的Binding Buffer懸浮細胞，再加入10μL Annexin V-FITC和10μL PI，混合均勻，室溫避光反應(yīng)15min，1h 內(nèi)上流式細胞儀做凋亡檢測.

1.8 細胞生長曲線實驗

細胞轉(zhuǎn)染24h后，按每孔2000個細胞(培液200μL)轉(zhuǎn)接到96孔板；每個檢測樣本設(shè)置4～7個檢測組，每個檢測組設(shè)6個重復孔.待3h左右細胞基本貼壁后觀察細胞狀態(tài)和數(shù)目，舍去明顯不與Control同步的重復孔，然后用顯色劑顯色反應(yīng)，以后每隔24h重復顯色實驗，持續(xù)4～7d.顯色劑顯色反應(yīng)：每孔加20μL MTT Stock，繼續(xù)孵育4h后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入100μL DMSO，待結(jié)晶完全溶解后用酶標儀測定490 nm處的吸光度值.

2 結(jié) 果

2.1 酵母雙雜交檢測ICL與CTBP1的相互作用

本文采用Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)，對ICL的相互作用蛋白進行了篩選.首先，通過自激活檢測確定誘餌克隆質(zhì)粒pGBKT7-ICL不存在自激活，然后用誘餌質(zhì)粒篩選人淋巴細胞cDNA文庫.初篩共得到30個陽性克隆，抽提質(zhì)粒后測序，經(jīng)BLAST比對，發(fā)現(xiàn)其中有CTBP1基因.將CTBP1的全長編碼序列構(gòu)建到“獵物”載體，得到pGADT7-CTBP1，與pGBKT7-ICL質(zhì)粒共轉(zhuǎn)酵母菌株AH109進行回轉(zhuǎn)驗證.結(jié)果顯示ICL與CTBP1在酵母體內(nèi)存在相互作用，可以激活報告基因(圖1).

2.2 ICL與CTBP1在體外和體內(nèi)都存在相互作用

為了排除酵母細胞內(nèi)其他因素介導產(chǎn)生假陽性的可能，我們采用GST pull-down和Co-IP技術(shù)分別驗證ICL與CTBP1在體外和體內(nèi)條件下的相互作用.

用GST pull-down技術(shù)進行體外驗證時，構(gòu)建pGEX-5x-1-ICL和pET28a-CTBP1兩個原核表達質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進行表達并獲得純化的融合蛋白.將純化好的蛋白進行體外結(jié)合，用anti-His抗體進行Western blot檢測，結(jié)果如圖2所示.GST-ICL存在時能檢測到6×His-CTBP1蛋白的條帶，而僅有GST蛋白時，無法檢測到到6×His-CTBP1，這表明ICL與CTBP1在體外存在特異性的相互作用.用Co-IP技術(shù)檢測ICL與CTBP1在細胞環(huán)境中的相互作用時，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pEGFP-ICL和pCMV-Myc-CTBP1，并將pEGFP-ICL分別與pCMV-Myc-CTBP1或與pCMV-Myc空載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，進行免疫共沉淀實驗.結(jié)果顯示，結(jié)合有Myc-CTBP1的凝膠珠子可以將GFP-ICL免疫共沉淀下來，并被anti-GFP抗體檢測到(圖3，泳道1)；而只結(jié)合了Myc蛋白的凝膠珠子則無法將GFP-ICL免疫共沉淀下來(圖3，泳道2).這表明ICL與CTBP1確實可以在細胞內(nèi)發(fā)生特異性的蛋白間的直接相互作用.

2.3 ICL抑制內(nèi)源CTBP1的表達

為了研究結(jié)核菌ICL與宿主CTBP1蛋白相互作用的生物學意義，我們首先分析了ICL表達對宿主內(nèi)源CTBP1表達的影響.通過使用不同劑量的pEGFP-ICL質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，然后抽提轉(zhuǎn)染細胞的總RNA進行實時定量RT-PCR實驗，檢測細胞內(nèi)CTBP1基因的表達變化，結(jié)果如圖4(見第600頁)所示.隨著ICL表達量的增加，在一定程度上降低了內(nèi)源CTBP1的mRNA表達水平.

進而，我們又分析了ICL對內(nèi)源CTBP1蛋白表達的影響.通過檢測不同劑量pEGFP-ICL質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞內(nèi)GFP-ICL蛋白和內(nèi)源CTBP1蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)隨著ICL表達量的增加，GFP-ICL融合蛋白的表達水平也相應(yīng)提高，但內(nèi)源CTBP1蛋白表達量卻逐漸減少(圖5，見第600頁).這一現(xiàn)象提示，ICL的表達可降低內(nèi)源CTBP1的蛋白水平，降低的程度與ICL的表達水平密切相關(guān).兩個實驗的結(jié)果提示，結(jié)核菌ICL對宿主CTBP1在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上都有抑制作用，但更多地是表現(xiàn)在翻譯水平上的抑制.

2.4 CTBP1的過表達及Knock-down細胞株的構(gòu)建

為了觀察ICL與CTBP1相互作用對細胞的影響，首先需要構(gòu)建CTBP1的過表達細胞株和低表達細胞株.我們用不同劑量的pCMV-Myc-CTBP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞作為CTBP1的過表達實驗組，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染不同劑量的pCMV-Myc-CTBP1質(zhì)粒均可以實現(xiàn)CTBP1的高水平表達(圖6(a)).

同時，用4條針對CTBP1基因的shRNA質(zhì)粒分別等量轉(zhuǎn)入HEK293T細胞作為CTBP1的低表達組，利用抗CTBP1抗體檢測轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)CTBP1的蛋白表達水平.結(jié)果可見每條shRNA都對CTBP1基因的表達產(chǎn)生了一定抑制，其中shRNA95的抑制效果最明顯(圖6(b)).因此，在后續(xù)的實驗中均以轉(zhuǎn)染shRNA95的細胞作為CTBP1的低表達株.

2.5 ICL與CTBP1的相互作用抑制細胞增殖

為了研究ICL與CTBP1相互作用對細胞的生物學效應(yīng)，我們用MTT法分別檢測了ICL過表達組、CTBP1高表達組和CTBP1低表達組的細胞增殖情況.細胞轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)接到96孔板，完成顯色反應(yīng)并測得490 nm處的吸光度值，共測定0h，24h，48h和72h 4個時間點的數(shù)據(jù).實驗結(jié)果顯示，結(jié)核菌ICL過表達組的細胞增殖受到抑制(圖7(a))，CTBP1高表達組的細胞增殖加快(圖7(b))，而被RNA干擾后的CTBP1低表達組細胞增殖減緩(圖7(c)).結(jié)合2.3節(jié)的結(jié)果，提示ICL在細胞內(nèi)對CTBP1的表達有抑制作用，而兩者的互作可抑制細胞增殖.

2.6 ICL與CTBP1的相互作用導致細胞G2/M期阻滯

為了分析ICL與CTBP1相互作用對細胞周期的影響，我們又利用流式細胞儀對ICL過表達組、CTBP1高表達組和CTBP1低表達組進行了細胞周期檢測，通過FlowJo 7.6軟件分析，統(tǒng)計各實驗組處于不同細胞時期的頻率(圖8).

結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達ICL組的G2/M期細胞增多(12.93%→22.28%，P=6.5×10-4)(圖8(a))；CTBP1高表達組的G2/M期頻率減小(22.09%→12.58%，P=1.5×10-2)(圖8(b))；被RNA干擾后的CTBP1低表達組與過表達ICL組的情況相似，也是G2/M期細胞的比率增多(8.97%→20.74%，P=7.9×10-4)(圖8(c)).這些結(jié)果提示，ICL與CTBP1的相互作用在一定程度上導致了細胞G2/M期的阻滯.

2.7 ICL與CTBP1的相互作用促進細胞凋亡

由于細胞的G2/M期是DNA合成后期，在G2/M期發(fā)生阻滯，表明DNA受到損傷或是復制出現(xiàn)了問題，因此細胞就會停留在這個時期對DNA進行損傷修復；如果DNA損傷和復制的問題無法解決，細胞就可能啟動凋亡程序.

為了檢測細胞周期變化后細胞凋亡情況的變化，我們使用Annexin V：PI 雙染色法進行凋亡檢測，結(jié)果如圖9所示.ICL過表達會增加細胞的凋亡率(7.05%→10.99%，P=2.0×10-2)；CTBP1高表達會降低凋亡率(10.82%→5.63%，P=8.8×10-3)；CTBP1低表達會增加凋亡率(6.68%→14.72%，P=2.1×10-3).第一組ICL過表達和第三組CTBP1低表達的實驗結(jié)果一致，都是加速細胞凋亡.這個結(jié)果進一步印證了2.5節(jié)的結(jié)果，即ICL與CTBP1的相互作用會加快細胞凋亡，從而表現(xiàn)出細胞增殖減緩的現(xiàn)象.

3 討 論

本文利用結(jié)核菌的ICL為誘餌篩選人淋巴細胞cDNA酵母雙雜交文庫時，發(fā)現(xiàn)ICL與CTBP1的蛋白相互作用，并通過GST pull-down和Co-IP實驗，驗證了它們在體外和體內(nèi)相互作用的特異性. ICL作為乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵代謝酶，常見于微生物和高等植物中，但未曾在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，因此從理論上來說，ICL的靶向藥物對人體毒副作用較低[10].自2000年結(jié)核菌ICL的晶體結(jié)構(gòu)被解析以來，針對ICL的研究有很大進展，科研人員發(fā)現(xiàn)了ICL對結(jié)核菌持續(xù)感染的影響[5-8]，并以ICL作為藥物靶標篩選出大量的潛在抑制劑[11].

CTBP1蛋白屬于CTBP蛋白家族，該蛋白家族在發(fā)育過程中和成熟組織中廣泛轉(zhuǎn)錄和表達.脊椎動物有2個CTBP基因，分別是CTBP1和CTBP2，CTBP1和CTBP2聯(lián)系緊密，且在進化上高度保守.CTBP1通過RNA的差異性剪接得到CTBP1-L和CTBP1-S兩種蛋白；CTBP2則通過選擇不同的啟動子轉(zhuǎn)錄并編碼CtBP2-L、CtBP2-S和 RIBEYE 3種蛋白[12].CTBP蛋白分布在細胞質(zhì)和細胞核中，根據(jù)CTBP在細胞內(nèi)的不同定位，其功能也存在差異.在細胞質(zhì)中，CTBP1與有絲分裂過程中的中心體變化有關(guān)[13]，CTBP1-S參與高爾基體的分裂[14]，而CTBP1與RIBEYE對中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的帶狀突觸及傳統(tǒng)化學突觸的形成有重大影響[15-16].在細胞核中，CTBP蛋白家族最為人知的功能就是作為轉(zhuǎn)錄輔抑制因子調(diào)控與DNA特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)錄抑制因子，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性[17-18].

在機體層面，CTBP被發(fā)現(xiàn)和腫瘤發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[19-20].CTBP在肝細胞癌中能夠介導抑制 E-cadherin 等粘附分子，促進上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[21].EMT會促使腫瘤惡化，因為腫瘤細胞間的黏附分子被抑制，使腫瘤細胞獲得較高的遷徙、侵襲、抗凋亡能力.同時，CTBP具有拮抗凋亡及“失巢凋亡”(Anoikis)的功能.失巢凋亡是指細胞與細胞外基質(zhì)或相鄰細胞脫離接觸后發(fā)生的程序性死亡[22].多種腫瘤抑制因子以CTBP蛋白作為靶標，通過介導CTBP蛋白的降解誘導細胞凋亡和/或細胞周期阻滯[23-26].

我們在細胞學實驗中發(fā)現(xiàn)，當ICL過表達時，細胞內(nèi)源CTBP1的mRNA和蛋白量都有一定程度的降低，這個結(jié)果表明ICL能夠抑制CTBP1的表達.在此基礎(chǔ)上，我們又通過MTT細胞活性檢測、細胞周期和細胞凋亡檢測的3組實驗，進一步發(fā)現(xiàn)在ICL過表達的細胞內(nèi)，細胞增殖速度明顯降低，細胞周期發(fā)生了G2/M期阻滯，同時細胞凋亡速度加快.這些結(jié)果表明，ICL與CTBP1的蛋白相互作用能夠抑制內(nèi)源CTBP1的表達，從而引發(fā)細胞周期阻滯，誘導宿主細胞凋亡.

結(jié)核菌侵入宿主后，首先是被巨噬細胞吞噬.結(jié)核菌與巨噬細胞之間的相互作用是結(jié)核菌在體內(nèi)生存和發(fā)展的關(guān)鍵因素之一.巨噬細胞吞噬結(jié)核菌后，會啟動TNF-α介導的細胞凋亡.巨噬細胞發(fā)生凋亡，清除被吞噬的病菌，防止結(jié)核菌在體內(nèi)擴大感染.而結(jié)核菌為了生存則力圖抑制巨噬細胞的凋亡，以保護受感染的細胞，為其提供有利于生長和繁殖的空間.當這兩者的斗爭使巨噬細胞的凋亡達到某種平衡時，活動性結(jié)核菌就發(fā)展成為潛伏性的結(jié)核菌，藏匿在巨噬細胞中，等待“再激活”的時機[27-28].因為結(jié)核菌感染與巨噬細胞凋亡之間存在密切聯(lián)系，而ICL作為結(jié)核菌的重要成分之一也對凋亡存在影響，因此以ICL作為切入點，深入研究其對細胞凋亡的影響，將有利于進一步揭示結(jié)核菌潛伏感染的機制.

在過去的二十多年中，ICL作為一個抗結(jié)核菌藥物的潛在靶標受到眾多關(guān)注.研究人員探究了ICL在基礎(chǔ)代謝途徑中的作用，并用各種方法篩選出ICL的酶抑制劑，尋找抑制結(jié)核菌活性的辦法.本文則從結(jié)核菌ICL與宿主蛋白相互作用的角度出發(fā)，發(fā)現(xiàn)了一個新的ICL相互作用蛋白CTBP1，繼而通過研究ICL對宿主細胞的影響，發(fā)現(xiàn)了ICL能夠抑制CTBP1表達并誘導宿主細胞凋亡.本文的研究結(jié)果為更深入了解ICL的功能并最終揭示結(jié)核菌感染的分子機制提供了新的實驗依據(jù).

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SHI Chao, WANG Yaqian, SHAO Junhua, HUO Keke

(State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China)

Lyase isocitrate involves in the glyoxylae cycle, and is one of the key factors that helpMycobacteriumtuberculosisincubate in host cells. In order to explore the effect of ICL on host cells, yeast two hybrid screening was used to screen the cDNA library of Human lymphocyte, and CTBP1 was found to be interacted with ICL. The interaction between ICL and CTBP1 was verified by GST pull-down and Co-IP experiments. In cells with high expression of ICL, endogenous CTBP1 was inhibited on both transcription level and protein level. When CTBP1 was inhibited, the cellular states also changed, as cell proliferation slowed down, cell apoptosis accelerated, G2/M phase blocked. The experimental results showed that ICL can mediate cell apoptosis and affect the activity of host cells. Our results provides new clues to study the mechanism of Mycobacterium tuberculosis’ infection.

Mycobacteriumtuberculosis; ICL; CTBP1; protein interaction; cell apoptosis

0427-7104(2016)05-0596-09

2016-01-07

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(2013CB531603)，國家科技重大專項(62008ZX10003-006)

石 超(1989—)，女，碩士研究生；霍克克，男，教授，通訊聯(lián)系人，E-mail：kkhuo@fudan.edu.cn.

Q 71

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