郭 琪鄭凌凌沈 偉宋立榮

（1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所， 中國(guó)科學(xué)院藻類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430072； 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049）

研究簡(jiǎn)報(bào)

不同二氧化碳濃度培養(yǎng)對(duì)兩株柵藻碳固定速率及油脂積累的影響

郭 琪1，2鄭凌凌1沈 偉1宋立榮1

（1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所， 中國(guó)科學(xué)院藻類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430072； 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049）

人類在利用化石燃料的過程中會(huì)導(dǎo)致大量有害溫室氣體CO2的排放， 促進(jìn)全球氣候變暖。微藻可通過光合作用固定CO2， 同時(shí)大量的微藻生物質(zhì)還能作為生物能源的原料［1］， 因此， 越來越多的研究關(guān)注于微藻生物固碳以達(dá)到降低碳排放的目的。利用微藻光合作用進(jìn)行CO2固定是一種能量節(jié)約型和環(huán)境友好型技術(shù)手段［2］。

在利用微藻進(jìn)行CO2生物固定以及生物燃料生產(chǎn)時(shí)，研究微藻的CO2固定能力、CO2對(duì)微藻的生長(zhǎng)以及油脂積累的影響等都是十分重要的。國(guó)內(nèi)外利用微藻進(jìn)行生物固碳已有大量報(bào)道， 夏建榮等［3］通過研究極大螺旋藻的生長(zhǎng)， 發(fā)現(xiàn)添加高濃度CO2有利于提高螺旋藻產(chǎn)量；Morais等［4］研究發(fā)現(xiàn)4株微藻Chlorella kessleri、C. vulgaris、Scenedesmus obliquus 和Spirulina sp. 在6% CO2濃度下達(dá)到最大生長(zhǎng)速率； Tang等［5］的研究結(jié)果顯示S.obliquus 在10% CO2濃度條件下具有最大生長(zhǎng)速率和碳固定速率； Fulke等［6］的研究結(jié)果表明Chlorella sp. 生長(zhǎng)和油脂積累的最適CO2濃度為3%； 李愛芬等［7］研究發(fā)現(xiàn)通入0.5% CO2促進(jìn)了核粉油球藻的生長(zhǎng)以及不飽和脂肪酸的積累； 另外， Chiu等［8］的研究報(bào)道則顯示Nannochloropsio culata 生長(zhǎng)的最適CO2濃度為2%， 當(dāng)CO2濃度超過一定范圍（＞5% CO2）， 會(huì)對(duì)微藻生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。工業(yè)排放廢氣中CO2濃度往往高達(dá)10%—15%， 甚至更高［9］， 因此欲利用微藻進(jìn)行CO2固定實(shí)現(xiàn)減排， 藻種的選取顯得極為重要。

前期經(jīng)過初步篩選獲得了油脂含量較高的柵藻Scenedesmus sp. FACHB-1545和Scenedesmus sp. FACHB-1600， 在此基礎(chǔ)上， 探究了它們?cè)诓煌珻O2濃度下的生長(zhǎng)、CO2固定以及油脂積累情況， 為篩選評(píng)價(jià)高效固碳且富含生物油脂的優(yōu)良微藻種質(zhì)資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種來源及培養(yǎng)

柵藻Scenedesmus sp. FACHB-1545和Scenedesmus sp. FACHB-1600藻種來自中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)。培養(yǎng)基BG-11［10］（去除Na2CO3， 以同等Na+摩爾濃度的NaCl代替， 排除外源碳源的影響）， 光照強(qiáng)度150 μmol/（m2·s）， 持續(xù)光照培養(yǎng)， 溫度為（25±1）℃。

采用長(zhǎng)60 cm、內(nèi)徑2.6 cm的柱狀光反應(yīng)器培養(yǎng)， 通入氣體濃度設(shè)置為10% CO2、5% CO2和空氣， 每組三個(gè)平行， 氣體流量為400 mL/min。初始接種濃度為A680=0.2， 培養(yǎng)周期為18d。

1.2 生物量測(cè)定

生物量以藻細(xì)胞干重（DW）來表示， 接種后， 每3天取V mL藻液， 用GF/C濾膜（Whatman， UK）抽濾， 濾膜提前烘干至恒重并記錄重量為W0（g）， 然后將濾有藻細(xì)胞的濾膜置于105℃， 24h烘干至恒重， 并再次稱重記錄重量為Wt（g）。

生物量X （g/L）計(jì)算公式即為: X （g/L）=1000×［Wt（g）-W0（g）］/V （mL）

生物量產(chǎn)率P ［mg/（L·d）］=1000×（X1-X0）/（t1-t0）

比生長(zhǎng)速率μ （/d）=（lnX1-lnX0）/（t1-t0）

其中， X1、X0分別為t1、t0時(shí)間下的生物量。

1.3 CO2固定速率測(cè)定

Rco2=Cc×P×（Mco2/Mc）， Cc表示微藻細(xì)胞中的含碳量， P是生物量產(chǎn)率， Mco2和Mc分別表示CO2分子和C元素的分子量。參考Chisti［11］的微藻生物質(zhì)的分子式CO0.48H1.83N0.11P0.01， Cc約為51.37%， 計(jì)算CO2固定速率=1.88×生物量產(chǎn)率［mg/（L·d）］。

1.4 油脂提取

取一定體積的藻液離心收集， 并凍干至藻粉。參考Bigogno等［12］的方法提取油脂: 稱取干燥的藻粉W1（g）（50 mg≤W1≤100 mg）， 經(jīng)10%的二甲亞楓-甲醇溶液（v/v）和正己烷︰乙醚混合液（1︰1， v/v）抽提得到上層有機(jī)相， 氮?dú)獯蹈蓾饪s后， 轉(zhuǎn)移濃縮液到已稱重為W2（g）的玻璃瓶中， 再經(jīng)氮?dú)獯蹈芍梁阒兀?稱重玻璃瓶質(zhì)量W3（g）。

總脂百分含量（% DW）=［（W3-W2）/W1］×100%

油脂產(chǎn)率［mg/（L·d）］=生物量產(chǎn)率×總脂百分含量

1.5 脂肪酸組成

參照Lee 等［13］的方法進(jìn)行。取1 mg提取的總脂樣品，進(jìn)行脂肪酸甲酯化反應(yīng)， 經(jīng)NaCl飽和溶液和正己烷萃取得到上層有機(jī)相， 氮?dú)獯蹈珊螅?用正己烷定容至1 mL， 待氣相色譜檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示， 數(shù)據(jù)采用Origin 8和SPSS 18.0分析軟件進(jìn)行分析， 各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性差異分析利用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行， 顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同CO2濃度對(duì)兩株柵藻生長(zhǎng)的影響

如圖 1所示， 兩株柵藻Scenedesmus sp. FACHB-1545和Scenedesmus sp. FACHB-1600在較高CO2濃度（5%和10% CO2）培養(yǎng)下生長(zhǎng)良好， 生長(zhǎng)速率明顯快于空氣組。第18天， Scenedesmus sp. FACHB-1545的最大生物量達(dá)到5.973 g/L （5% CO2）， Scenedesmus sp. FACHB-1600的最大生物量達(dá)到5.503 g/L （10% CO2）， 分別是空氣組的2.3倍和1.6倍； 此外， 兩株柵藻Scenedesmus sp. FACHB-1545和Scenedesmus sp. FACHB-1600均在10% CO2下獲得最大生物量產(chǎn)率和最大比生長(zhǎng)速率， 最大生物量產(chǎn)率分別為0.818和1.146 g/（L·d）， 最大比生長(zhǎng)速率分別為1.298和1.415 /d 。

2.2 不同CO2濃度對(duì)兩株柵藻碳固定速率的影響

如圖 2所示， 相比空氣組， 兩株柵藻Scenedesmus sp. FACHB-1545和Scenedesmus sp. FACHB-1600在較高濃度的CO2（5%和10%）下均表現(xiàn)出更高的固碳速率， 并且隨著碳濃度的升高， 藻株的碳固定速率隨之升高。Scenedesmus sp. FACHB-1545在10% CO2濃度下達(dá)到最大碳固定速率， 稍高于5% CO2培養(yǎng)組， 分別為1.538和1.378 g/（L·d）， 兩者都顯著高于空氣組［0.271 g/（L·d）；P＜0.05］。藻株Scenedesmus sp. FACHB-1600也在10% CO2下有最大碳固定速率， 為2.155 g/（L·d）， 顯著高于空氣組［0.381 g/（L·d）； P＜0.05］。

圖 1 兩株柵藻在不同CO2濃度培養(yǎng)下的生物量濃度（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Fig. 1 Biomass of the two strains of Scenedesmus under different CO2concentrations （Mean±SD）

2.3 不同CO2濃度對(duì)兩株柵藻油脂積累及脂肪酸組成的影響

CO2濃度的增加與柵藻Scenedesmus sp. FACHB-1545和Scenedesmus sp. FACHB-1600總脂含量并無顯著相關(guān)性（表 1）。Scenedesmus sp. FACHB-1545的油脂產(chǎn)率隨著CO2濃度的升高而增加， 在5% CO2濃度和10% CO2濃度時(shí)獲得的油脂產(chǎn)率分別為101.132和101.857 mg/（L·d）， 兩者都顯著高于空氣組的油脂產(chǎn)率［52.5 mg/（L·d）；P＜0.05］； 而Scenedesmus sp. FACHB-1600則在5% 的CO2濃度下油脂產(chǎn)率最大， 為104.163 mg/（L·d）， 在10% CO2濃度時(shí)的油脂產(chǎn)率次之， 為86.729 mg/（L·d）， 而空氣組最低， 為68.912 mg/（L·d）。

兩株藻Scenedesmus sp. FACHB-1545Scenedesmus sp. FACHB-1600的脂肪酸組成主要成分為C16-C18脂肪酸， 在3個(gè)CO2濃度下， C16-C18含量占脂肪酸組成的85% 以上。Scenedesmus sp. FACHB-1545的不飽和脂肪酸相對(duì)含量達(dá)到82%以上， 而Scenedesmus sp. FACHB-1600的不飽和脂肪酸相對(duì)含量則達(dá)到91%以上，符合生物柴油的性質(zhì)， 這兩株柵藻具備生產(chǎn)生物柴油的潛力（表 2）。

3 討論

CO2是微藻光合作用的碳源， 對(duì)大多數(shù)微藻來說， 最適CO2濃度通常在0.038%—10%［14］。通入合適濃度的CO2可以促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)， 當(dāng)CO2濃度超過一定范圍時(shí)，其生長(zhǎng)可能會(huì)受到抑制。Cheng等［15］研究發(fā)現(xiàn)Chlorella vulgaris 在通入1% CO2時(shí)生長(zhǎng)良好， 但CO2濃度超過1%時(shí)其生長(zhǎng)會(huì)受到影響； Lee等［16］的研究發(fā)現(xiàn)Chlorella pyrenoidosa能夠在5% CO2濃度下較好的生長(zhǎng)， 當(dāng)CO2濃度高于5% 時(shí)， 生長(zhǎng)也會(huì)受到抑制； 還有些藻株能夠在富含高濃度CO2的煙道氣（10%—15%）中生長(zhǎng)， 但是固碳速率和生物量產(chǎn)率卻不及較低CO2濃度培養(yǎng)［17］。Tang等［5］對(duì)Scenedesmus obliquus SJTU-3和Chlorella pyrenoidosa SJTU-2的研究發(fā)現(xiàn)， 這兩株微藻在10%的CO2濃度下生長(zhǎng)最快， 最大生物量濃度分別為1.84和1.55 g/L； Anjos等［18］發(fā)現(xiàn)通氣速率為36 mL/min時(shí)， 隨著CO2濃度的增加（2%—6%）， Chlorella vulgaris p12的最大生物量濃度和生物量產(chǎn)率增加了近45%。

圖 2 兩株柵藻在不同CO2濃度培養(yǎng)下的CO2固定速率（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Fig. 2 CO2fixation rate of the two strains of Scenedesmus under different CO2concentrations （Mean±SD）

表 1 兩株柵藻在不同CO2濃度培養(yǎng)下的總脂含量和油脂產(chǎn)率（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Tab. 1 The total lipid and lipid productivity of the two strains of Scenedesmus under different CO2concentrations （Mean±SD）

本文研究的兩株柵藻Scenedesmus sp. FACHB-1545和Scenedesmus sp. FACHB-1600在10% CO2濃度下均具有最大生物量產(chǎn)率， 這與Tang等［5］的結(jié)果相似， 由于本實(shí)驗(yàn)采用的柱狀光生物反應(yīng)器， 促進(jìn)了藻株在培養(yǎng)過程中的光利用率、營(yíng)養(yǎng)鹽利用率等， 最大生物量可高達(dá)5.973和5.503 g/L， 明顯高于Tang等［5］所得到的最大生物量濃度。此外， Scenedesmus sp. FACHB-1545和Scenedesmus sp. FACHB-1600在5%和10% CO2濃度下具有很好的固定碳的能力， 在10%濃度下固碳速率最高。Cervantesa等［19］研究Scenedesmus obtusiusculus 在不同CO2條件培養(yǎng)下也有相似結(jié)果， 該藻株在10% CO2下表現(xiàn)出最大CO2固定速率為970 g/（m3·d）； Wang等［20］研究了海洋硅藻Chaetoceros muelleri 在不同CO2濃度下的變化， 發(fā)現(xiàn)C. muellleri 在10% CO2下具有最大CO2固定速率0.428 g/（L·d）， 而本研究中的兩株藻的最大固碳速率分別為1.538和2.155 g/（L·d）， 固碳速率具有明顯優(yōu)勢(shì)， 表明它們是進(jìn)行生物固碳的潛在優(yōu)質(zhì)藻種資源。因CO2的固定還會(huì)受如pH、光強(qiáng)、氣體流速、CO2補(bǔ)給速率等條件的影響［20］， 后期還需針對(duì)這些因素深入研究藻種的固碳速率，進(jìn)一步挖掘固碳潛力。

表 2 兩株柵藻在不同CO2濃度培養(yǎng)下的脂肪酸組成Tab. 2 The fatty acid composition of the two strains of Scenedesmus under different CO2concentrations

評(píng)價(jià)微藻生物柴油生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)可行性， 需綜合考慮微藻生物量產(chǎn)率、總脂含量以及油脂產(chǎn)率等參數(shù)。近來有一些研究報(bào)道指出， 在一定范圍內(nèi)CO2濃度的升高可以促進(jìn)油脂的積累。徐芳等［21］研究Nannochloropsis sp.時(shí)發(fā)現(xiàn)， CO2濃度的升高會(huì)降低總脂肪酸含量； Chiu等［8］研究N. oculata NCTU-3時(shí)發(fā)現(xiàn)， CO2濃度為2% 時(shí)油脂含量最高， 但是CO2濃度在2%—15% 時(shí)， 油脂含量有降低趨勢(shì)。本研究中的藻株Scenedesmus sp. FACHB-1545和 Scenedesmus sp. FACHB-1600， 在通入較高濃度的CO2培養(yǎng)時(shí)， 都獲得了高于空氣組的油脂產(chǎn)率， 并且差異顯著（P＜0.05）， 這表明我們篩選的兩株柵藻在較高濃度CO2下能夠很好的積累油脂。油脂產(chǎn)率是結(jié)合了生物量和總脂含量的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)， 能夠更好地衡量藻株的產(chǎn)油能力［22］， 特別是在一些藻種的室外大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)， 參考油脂產(chǎn)率來衡量藻株的產(chǎn)油潛力更加具有實(shí)際意義。

本文結(jié)果顯示， 通過適當(dāng)提高CO2濃度可以促進(jìn)兩株柵藻Scenedesmus sp. FACHB-1545和Scenedesmus sp. FACHB-1600的生長(zhǎng)、CO2固定和油脂產(chǎn)率， 藻種具有高效固碳且富含生物油脂的優(yōu)勢(shì)。從應(yīng)用角度看， 室內(nèi)篩選的優(yōu)良藻株能否推廣到戶外大規(guī)模生產(chǎn)， 還需考察藻株的其他一些性能如抗逆性、抗污染能力、采收性能等［20］， 本文研究的兩株柵藻， 尚需開展進(jìn)一步戶外試驗(yàn)，以確定其是否能真正進(jìn)行戶外生產(chǎn)。

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EFFECTS OF DIFFERENT CO2CONCENTRATION ON CO2FIXATION AND LIPID ACCUMULATION OF TWO STRAINS OF SCENEDESMUS SP.

GUO Qi1，2， ZHENG Ling-Ling1， SHEN Wei1and SONG Li-Rong1
（1. Key Laboratory of Algal Biology， Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430072， China； 2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

柵藻； 生物量產(chǎn)率； CO2固定速率； 油脂產(chǎn)率

Scenedesmus sp.； Biomass productivity； CO2fixation rate； Lipid productivity

10.7541/2016.55

Q949.9

A

1000-3207（2016）02-0414-05

2015-04-01；

2015-08-21

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 ［Supported by National High-tech R&D Program of China （2014AA022001）］

郭琪（1990—）， 女， 湖北仙桃人； 碩士； 從事產(chǎn)油微藻固碳研究。 E-mail: guoqi900520@163.com

宋立榮， E-mail: lrsong@ihb.ac.cn