劉 林 趙群芬

研究簡(jiǎn)報(bào)

納米氧化鋅對(duì)斑馬魚鰓組織的氧化損傷

劉 林 趙群芬

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院， 寧波 315211）

納米顆粒是指粒徑在1—100 nm， 表面積較大， 具有塊狀顆粒所沒有的特有性質(zhì)。由于納米顆粒具有獨(dú)特的理化性質(zhì)， 近年來(lái)合成和生產(chǎn)納米顆粒的產(chǎn)量大大增加［1］。納米氧化物顆粒在科研和工業(yè)產(chǎn)品的應(yīng)用正在逐年增加， 科學(xué)家預(yù)測(cè)依靠納米技術(shù)創(chuàng)造的產(chǎn)品產(chǎn)生的價(jià)值， 到2015年可能達(dá)到1萬(wàn)億美元［2］。隨著納米顆粒的使用， 它對(duì)人類健康和環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。因此了解納米顆粒的不利影響， 確定對(duì)生物的影響， 確保納米材料的安全使用是十分必要的［3］。

鰓是魚類的呼吸器官， 它直接與水環(huán)境接觸， 是污染物發(fā)揮毒性作用的主要靶器官， 其結(jié)構(gòu)和生理變化可以直接反應(yīng)污染物對(duì)魚的毒害程度［4］。如甲砜霉素能引起松浦鏡鋰（Cyprinus carpio L.）鰓上皮細(xì)胞輕微腫脹， 并隨著給藥劑量的增加， 腫脹現(xiàn)象嚴(yán)重［5］； 重金屬鎘和汞離子能引起鯉鰓組織出現(xiàn)鰓小片頂端充血， 呈球狀或棒狀， 鰓小片彎曲， 上皮腫脹， 甚至出現(xiàn)鰓小片細(xì)胞脫落， 嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)鰓小片解體［6］。納米銅顆粒能引起鰓組織水腫， 鰓絲棒狀化， 鰓絲畸形增長(zhǎng)， 鰓絲溶解等炎癥［7］。

人工合成的納米氧化鋅顆粒（nZnO）應(yīng)用于藥品、牙膏、化妝品、防嗮霜、紡織品和涂料中［8］， 生產(chǎn)和使用時(shí)不可避免的向環(huán)境中釋放， 從而給環(huán)境造成潛在的風(fēng)險(xiǎn)［9］。生物體生活在nZnO污染的環(huán)境中能造成組織的病變， 組織病理能快速和有效檢測(cè)納米顆粒處理對(duì)組織或器官產(chǎn)生的不利影響［10］， 魚體內(nèi)抗氧化酶對(duì)環(huán)境污染物非常敏感， 可作為生物標(biāo)記物評(píng)估水體中污染物的污染程度［11］。水生生物特別是魚類比哺乳動(dòng)物對(duì)納米顆粒的毒害更敏感［10］， 可用于檢測(cè)水體中低濃度的納米顆粒的毒性。鯉暴露于nZnO溶液中21d后， 鰓組織受到不同程度的損傷， 鰓小片上皮細(xì)胞出現(xiàn)腫脹， 并伴有變性、脫落， 浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞一起填滿整個(gè)鰓小片間隙， 使鰓絲呈棍狀［12］； 0.5、5和50 mg/L的nZnO處理鯉14d內(nèi)， 使鰓中SOD、GSH-PX活性升高， 并引起鰓組織的氧化損傷［13］。組織的氧化損傷是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)， 過多的活性氧可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn)多種環(huán)境污染物質(zhì)可以誘導(dǎo)凋亡基因的表達(dá)而對(duì)凋亡產(chǎn)生影響， 如苯并芘能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族的表達(dá)對(duì)Daudi細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響［14］。然而有關(guān)nZnO對(duì)鰓的毒性研究， 大多停留在生理水平檢測(cè)或組織損傷觀察上， 缺少nZnO對(duì)鰓組織毒性機(jī)理的研究。本研究以成年斑馬魚（Danio rerio）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象， 通過nZnO誘導(dǎo)斑馬魚鰓組織損傷、抗氧化酶活性的變化和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的影響， 探討nZnO暴露下對(duì)鰓組織產(chǎn)生氧化脅迫后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響， 對(duì)進(jìn)一步研究納米材料的生態(tài)效應(yīng)和水生態(tài)環(huán)境安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

藍(lán)色斑馬魚購(gòu)于寧波市天勝花鳥市場(chǎng)， 魚齡120d左右， 雌雄各半， 平均體重為（0.36±0.1） g， 平均體長(zhǎng)為（3.00±0.6） cm， 馴養(yǎng)用水為自來(lái)水曝氣12h， 水溫（26±0.5）℃， 光照/黑暗周期為14h︰10h， 每日投喂2次， 馴養(yǎng)7d后用于急性毒理實(shí)驗(yàn)， 為保證試驗(yàn)期間水質(zhì)， 試驗(yàn)期間停止投喂餌料。

nZnO ［（25±2） nm］: 購(gòu)于杭州大洋納米新材料有限公司。RNAiso Plus試劑、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ （Tli RNaseH Plus）試劑購(gòu)于大連TaKaRa公司。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX）測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物研究所。

1.2 方法

選擇健康斑馬魚進(jìn)行毒理實(shí)驗(yàn)， 實(shí)驗(yàn)組nZnO濃度設(shè)為0.05、0.1、5、10、25和50 mg/L， 另設(shè)對(duì)照組， 每組3個(gè)平行， 暴露試驗(yàn)參照GB/T13276—1991， 處理4h、24h和96h后解剖取鰓組織， 部分鰓組織加入RNA保存液（-80℃保存）用于RNA提取。余下鰓組織加入預(yù)冷的勻漿介質(zhì)（0.01 mol/L Tris-HCl、0.001 mol/L EDTA-2Na、0.01 mol/L蔗糖， pH 7.4）研磨， 4℃， 2000—4000 r/min離心10min， 取上清用于抗氧化指標(biāo)測(cè)定。另取處理7、15和30d斑馬魚鰓組織， 固定于10%甲醛中， 用于石蠟切片的制作。

斑馬魚鰓組織形態(tài)學(xué)觀察 取固定于甲醛中的鰓組織， 酒精脫水， 浸蠟、石蠟包埋， 切片機(jī)切片、脫蠟、HE染色， 中性樹膠封片， Nikon顯微鏡觀察并拍照。

鰓組織中抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)樣品中上清液的蛋白含量進(jìn)行測(cè)定； MDA含量、SOD活性、GSH-PX活性測(cè)定均按試劑盒說(shuō)明書操作。

MDA以每mg組織蛋白中MDA的nmol數(shù)表示；SOD以每mg組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位（U）； GSHPX的活力規(guī)定為每毫克蛋白， 每分鐘扣除非酶促反應(yīng)的作用， 使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個(gè)酶活力單位。

鰓組織中凋亡基因的檢測(cè) 根據(jù)GenBank中斑馬魚Bcl-2基因序列、p53基因序列、MDM2基因序列和Bax基因序列， 以斑馬魚β-actin基因?yàn)閮?nèi)參， 設(shè)計(jì)Bcl-2、MDM2、p53、Bax和β-actin基因引物（表 1）。引物由上海生工有限公司完成， 選取處理4、24和96h實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的鰓組織， 參考RNAiso Plus （TakaRa）試劑提取總RNA， A260/A280為1.90左右。根據(jù)PrimescriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （TakaRa）試劑盒將各樣品總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系（20 μL）: SYBR Premix Ex TaqTMⅡ （2×） 10 μL、正向及反向引物各0.8 μL、cDNA模板2 μL、超純水6.4 μL。擴(kuò)增條件為: 預(yù)變性95℃ 3min， 40個(gè)循環(huán)（95℃ 20s， 57℃ 30s， 72℃ 25s）， 反應(yīng)結(jié)束后制備溶解曲線。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔， 為排除假陽(yáng)性結(jié)果， 所有檢測(cè)樣品均包含1個(gè)無(wú)模板的陰性對(duì)照。采用2-ΔΔCt法分析熒光定量結(jié)果［15］。

1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理

數(shù)據(jù)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析（One Way ANOVA）， 顯著性檢測(cè)采用Tukey’s test多重比較； P＜0.05為顯著性差異， P＜0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚鰓組織結(jié)構(gòu)的變化

表 1 目的基因及內(nèi)參基因的引物Tab. 1 Primers of target and internal control genes

圖 1 nZnO對(duì)斑馬魚鰓組織結(jié)構(gòu)的影響Fig. 1 Effect of nZnO on structural change in gill of zebrafish （HE stain×400）

圖 1所示為nZnO處理下斑馬魚鰓組織的結(jié)構(gòu)變化，對(duì)照組鰓絲兩側(cè)排列著鰓小片（a-1、a-2、a-3）， 鰓小片由上皮扁平細(xì)胞和柱狀細(xì)胞構(gòu)成， 上皮細(xì)胞單層扁平細(xì)胞排列在鰓小片表面， 柱狀細(xì)胞在鰓小片內(nèi)側(cè)， 細(xì)胞核呈圓或橢圓形， 對(duì)照組15d時(shí)鰓絲中央靜脈血竇明顯可見（a-2）。與對(duì)照組相比， 最低濃度（0.05 mg/L）組在處理7d出現(xiàn)鰓上皮細(xì)胞脫落（b-1、b-2）， 隨著暴露濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)， 其他實(shí)驗(yàn)組也發(fā)現(xiàn)相似現(xiàn)象（c-2、f-2、f-3、g-3）； 0.1 mg/L組在處理7d就發(fā)現(xiàn)鰓上皮細(xì)胞增生現(xiàn)象（c-1）， 隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)較低濃度（0.05 mg/L）組也觀察到相同現(xiàn)象（b-2）； 低濃度（5 mg/L）組在處理15d 時(shí)出現(xiàn)鰓小片邊際通道擴(kuò)張 （d-2）， 隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)， 0.05 mg/ L組也表現(xiàn)為鰓小片邊際通道擴(kuò)張的現(xiàn)象（b-3）； 其他實(shí)驗(yàn)組還觀察到鰓絲血管擴(kuò)張（c-1）， 淋巴細(xì)胞增多（e-1）， 并伴有部分細(xì)胞壞死形成炎癥聚集（e-1、f-2）， 在高濃度（50 mg/L）組還發(fā)現(xiàn)鰓小片基部細(xì)胞有空泡化（g-2）和大量鰓上皮細(xì)胞脫落鰓絲呈棍狀化的現(xiàn)象（g-3）。

2.2 nZnO對(duì)斑馬魚鰓組織中抗氧化酶活性的影響

nZnO脅迫下斑馬魚鰓中SOD活性的變化 如圖2所示為斑馬魚鰓中SOD活性變化， 處理4h， 實(shí)驗(yàn)組斑馬魚鰓中的SOD活性升高， 且高濃度（25 和50 mg/L）組SOD活性極顯著增加（P＜0.01）， 是對(duì)照組的1.41倍、2.07倍； 處理24h， 低濃度（0.05、0.1和5 mg/L）組， SOD活性高于對(duì)照組， 在其他濃度下， SOD活性均低于對(duì)照組；暴露96h后， 實(shí)驗(yàn)組鰓中SOD活性均低于對(duì)照組。

nZnO脅迫下斑馬魚鰓中MDA含量的變化nZnO暴露下斑馬魚鰓組織中MDA含量變化（圖 3）， 實(shí)驗(yàn)組斑馬魚鰓中MDA含量均高于對(duì)照組， 各個(gè)時(shí)刻下， 處理濃度為10 mg/L組， 鰓中MDA含量達(dá)最大， 分別是對(duì)照組的2.52倍、1.91倍和1.45倍。

圖 2 斑馬魚鰓中SOD活性的變化Fig. 2 Changes of SOD activity in zebrafish gill

圖 3 斑馬魚鰓中MDA含量的變化Fig. 3 Changes of MDA content in zebrafish gill

nZnO脅迫下斑馬魚鰓中GSH-PX活性的影響 從圖 4可見， nZnO脅迫4h后， 鰓中GSH-PX活性被誘導(dǎo)激活，呈上升趨勢(shì)； 在處理24h后， 低濃度（0.05和0.1 mg/ L）組GSH-PX活性升高， 而在其他濃度下， GSH-PX活性均下降； 處理96h， GSH-PX活性下降。

圖 4 斑馬魚鰓中GSH-PX活性的變化Fig. 4 Changes of GSH-PX activity in zebrafish gill

2.3 nZnO對(duì)斑馬魚鰓組織中p53、MDM2、Bax、Bcl-2基因表達(dá)量的影響

nZnO對(duì)斑馬魚鰓中Bcl-2基因的影響 如圖 5所示為在nZnO脅迫下， 斑馬魚鰓組織中Bcl-2基因表達(dá)量的變化， 與對(duì)照組相比， 處理4h， 鰓中Bcl-2基因表達(dá)量均升高， 在濃度為50 mg/L時(shí)Bcl-2基因表達(dá)量最高， 是對(duì)照組的3.95倍； 暴露24h， 低濃度（0.05 和0.1 mg/L）組和高濃度（50 mg/L）組， Bcl-2基因表達(dá)量升高， 而在中濃度（5、10和25 mg/L）組Bcl-2基因表達(dá)量均降低； 處理96h， 除5 mg/ L 組外， 其余各實(shí)驗(yàn)組中Bcl-2基因表達(dá)量均高于對(duì)照組。

圖 5 nZnO對(duì)斑馬魚鰓中Bcl-2基因的影響Fig. 5 Effects of the nZnO of Bcl-2 in zebrafish gill

nZnO對(duì)斑馬魚鰓中Bax基因的影響 由圖 6可見，斑馬魚鰓中Bax基因表達(dá)量的變化， 處理4h， 低濃度組（0.05、0.1和5 mg/L）， Bax基因表達(dá)量升高， 其他濃度組Bax基因表達(dá)量降低； 暴露24h和96h， Bax基因表達(dá)量均升高， 處理24h， 濃度為0.1 mg/L組Bax基因表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）， 是對(duì)照組的2.68倍； 處理96h， 50 mg/L組Bax基因表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01）， 是對(duì)照組的3.95倍。

圖 6 nZnO對(duì)斑馬魚鰓中Bax基因的影響Fig. 6 Effects of the nZnO of Bax in zebrafish gill

nZnO對(duì)斑馬魚鰓中p53基因的影響 圖 7所示為nZnO脅迫下斑馬魚鰓中p53基因表達(dá)量的變化， 處理4、24和96h， 鰓中p53基因的表達(dá)量均高于對(duì)照組， 處理4h，50 mg/L組p53基因的表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01）， 是對(duì)照組的3.79倍， 暴露96h時(shí)濃度為0.1 mg/L 組p53基因的表達(dá)量達(dá)最大， 是對(duì)照組的4.77倍。

圖 7 nZnO對(duì)斑馬魚鰓中p53基因的影響Fig. 7 Effects of the nZnO of p53 in zebrafish gill

nZnO對(duì)斑馬魚鰓中MDM2基因的影響 斑馬魚鰓中MDM2基因表達(dá)量的變化（圖 8）， 實(shí)驗(yàn)組斑馬魚鰓中MDM2基因的表達(dá)量均高于對(duì)照組， 處理4h， 10 mg/L組MDM2基因表達(dá)量達(dá)最大， 是對(duì)照組的6.64倍； 處理24h，濃度為0.1 mg/L組MDM2基因表達(dá)量極顯著升高（P＜ 0.01）， 是對(duì)照組的4.91倍； 暴露96h， 低濃度（0.05 mg/L）組， MDM2基因表達(dá)量最高， 是對(duì)照組的6.98倍。

圖 8 nZnO對(duì)斑馬魚鰓中MDM2基因的影響Fig. 8 Effects of the nZnO of MDM2 in zebrafish gill

3 討論

nZnO能通過皮膚、鰓等組織進(jìn)入到魚體內(nèi)， 從而引起一系列生理生化反應(yīng)， 并且能誘導(dǎo)鰓組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化， 同時(shí)還能引起凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的變化。鰓是魚類的呼吸器官， 也是吸收有毒物質(zhì)的主要場(chǎng)所， 它直接與水環(huán)境接觸， 可以比其他組織更迅速積累污染物， 因此易因水體污染而造成組織損傷。

3.1 nZnO對(duì)斑馬魚鰓組織結(jié)構(gòu)的影響

環(huán)境污染物能造成魚類鰓組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。環(huán)境污染物會(huì)誘導(dǎo)鰓中過多的氧自由基攻擊細(xì)胞膜， 細(xì)胞膜受損， 釋放細(xì)胞內(nèi)含物， 細(xì)胞壞死， 鰓上皮細(xì)胞脫落［16］， 出現(xiàn)鰓小片脫落現(xiàn)象， 甚至鰓絲呈棍狀化［5］。同時(shí)鰓絲血管擴(kuò)張， 物質(zhì)交換能力增加， 從而減輕有毒物質(zhì)對(duì)機(jī)體的損傷。但物質(zhì)交換能力的變化， 會(huì)造成細(xì)胞中液體滯留而導(dǎo)致上皮細(xì)胞水腫［15，6］， 水體中有害物也能誘使鰓中淋巴細(xì)胞增多， 減輕環(huán)境污染物對(duì)鰓的損傷， 鰓中壞死的細(xì)胞能聚集形成炎癥聚集［17，18］。有研究者將鰓組織細(xì)胞受到外界毒物脅迫時(shí)造成的損傷劃分為兩大類: 一是因防御反應(yīng)而產(chǎn)生的損傷， 包括鰓絲上皮細(xì)胞肥大和增生，鰓小片呼吸上皮水腫等； 二是直接造成的損傷， 包括鰓上皮脫落與壞死等［19］。在本研究中， 低濃度（0.05 mg/L）組首先出鰓絲上皮細(xì)胞增生， 上皮細(xì)胞水腫， 并伴有鰓絲上皮細(xì)胞的脫落， 說(shuō)明nZnO可以從多個(gè)途徑對(duì)鰓組織細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用， 造成鰓組織的防御反應(yīng)和直接損傷同時(shí)產(chǎn)生； 隨著濃度的增大， 0.1 mg/L組出現(xiàn)血管擴(kuò)張， 說(shuō)明nZnO能誘導(dǎo)血液流通增大， 物質(zhì)的交換能力增加， 增大物質(zhì)的吸收能力， 來(lái)維持生物體正常的機(jī)能； 高濃度組出現(xiàn)細(xì)胞空泡化現(xiàn)象， 淋巴細(xì)胞增多， 大量上皮細(xì)胞壞死，上皮細(xì)胞脫落呈棍狀化， 說(shuō)明隨著nZnO濃度增大， 能誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的活性氧引起組織損傷。

3.2 nZnO對(duì)斑馬魚鰓組織中抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）是清除超氧陰離子（O2-·）的專一性酶， 在生物體內(nèi)最先與O2-·結(jié)合， 將其分解為H2O2和O2， 是生物體內(nèi)最重要的抗氧化酶之一［20］。大量研究表明， 當(dāng)水生生物受到外來(lái)污染物脅迫時(shí)， 機(jī)體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的SOD清除組織中過多的超氧陰離子， 保護(hù)機(jī)體免受損傷［21］； 然而當(dāng)環(huán)境污染物濃度過高或生物體長(zhǎng)期生活在污染環(huán)境中時(shí)， 生物體的抗氧化系統(tǒng)造成損傷， 甚至?xí)鸾M織中SOD活性的下降［22］。研究者發(fā)現(xiàn)納米鎳能引起羅非魚鰓組織中SOD活力呈先升高后下降的趨勢(shì)［23］；在本研究中實(shí)驗(yàn)組在暴露的起始階段， 斑馬魚鰓組織中SOD活性升高， 清除活性氧自由基， 隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加， 鰓組織抗氧化酶系統(tǒng)紊亂， SOD活性下降， 說(shuō)明隨著nZnO濃度增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)， 鰓組織氧化受到損傷。

MDA是細(xì)胞膜系統(tǒng)受損傷的指標(biāo)之一， 是脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物， 在一定程度上， 根據(jù)MDA含量能評(píng)估組織的受損情況［24］。研究者發(fā)現(xiàn)， nZnO能誘使過多的氧自由基攻擊細(xì)胞膜， 使椎實(shí)螺（Lymnaea luteola L.）［25］和鯉［26］體內(nèi)的MDA含量升高。鰓組織在受到nZnO誘導(dǎo)時(shí)產(chǎn)生過多的自由基， 攻擊細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸， 使細(xì)胞膜破壞， 造成過多的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（MDA）， 本研究結(jié)果顯示， 處理24h內(nèi)， 鰓中MDA含量先升高后下降， 高濃度（25和50 mg/L）組MDA含量低于中濃度（10 mg/L）組， 可能是高濃度組中nZnO沉積造成其毒性下降， 一定濃度范圍內(nèi)的nZnO處理， 使組織中MDA含量逐漸增加， 說(shuō)明隨著處理濃度的增加鰓組織受損程度加重， 而高濃度組nZnO沉積使得魚類不能通過鰓呼吸進(jìn)入到生物體內(nèi)因而造成其毒性下降。

GSH-PX能分解有機(jī)和無(wú)機(jī)形式的過氧化物， 可以催化有機(jī)過氧化物（ROOH）轉(zhuǎn)變?yōu)镽OH， 可以在過氧化氫酶（CAT）含量低或者組織中H2O2產(chǎn)量低的組織中代替CAT清除H2O2， 進(jìn)而防止機(jī)體造成損傷［27］。研究者發(fā)現(xiàn)，沙蠶（Nereis succinea）暴露于2.5 μg/g的納米銀中1d后體內(nèi)的GSH-PX活性升高， 在較高濃度（5和10 μg/g）組GSHPX活性下降， 處理4d后， 沙蠶體內(nèi)的GSH-PX活性均顯著下降（P＜0.05）［28］； 研究者在重金屬鎘（Cd2+）對(duì)尖紫蛤（Sanguinolaria acuta）的鰓毒性中發(fā)現(xiàn)， Cd2+能導(dǎo)致鰓中GSHPX活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)［29］； 生物體能通過適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)體的相關(guān)生理機(jī)能活動(dòng)， 從而增強(qiáng)機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)清除活性氧自由基的能力。本研究中也發(fā)現(xiàn): nZnO處理短時(shí)間內(nèi)（4h）， 使鰓組織中GSH-PX活性升高，是生物體內(nèi)的適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)能， 而隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)鰓中GSH-PX活性的降低， 可能是過多的氧自由基造成斑馬魚抗氧化系統(tǒng)功能損傷， 影響機(jī)體內(nèi)自由基的代謝平衡， 引起魚體的其他生理功能下降。

3.3 nZnO對(duì)斑馬魚鰓組織中p53、MDM2、Bax、Bcl-2基因表達(dá)量的影響

Bcl-2蛋白家族通過調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡通路， 在凋亡信號(hào)引起的細(xì)胞反應(yīng)中起重要作用， 其中Bcl-2和Bax分別屬于Bcl-2家族中的抗凋亡和前凋亡基因［30］， Bcl-2和Bax的比值決定了細(xì)胞凋亡的敏感性［31，32］。研究報(bào)道， 羥基磷灰石納米粒子使組織中Bax/Bcl-2的比值升高， 并推測(cè)Bax/Bcl-2比值的升高可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［33］。也有研究者發(fā)現(xiàn)環(huán)境污染物能改變斑馬魚組織中Bax/Bcl-2的比值， 進(jìn)而介導(dǎo)線粒體細(xì)胞色素c的釋放， 從而引起細(xì)胞凋亡［34］。在本研究中發(fā)現(xiàn)， 處理4h后鰓中Bax/Bcl-2的比值減小， 而在暴露24h、96h后Bax/Bcl-2的比值增大， 說(shuō)明隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，nZnO能誘導(dǎo)鰓組織細(xì)胞發(fā)生凋亡。

p53能通過激活它的下游途徑調(diào)控凋亡， 它能誘導(dǎo)應(yīng)激信號(hào)引起凋亡［35］， 當(dāng)生物受到外界脅迫時(shí)p53的表達(dá)水平則明顯增加。MDM2能負(fù)向調(diào)節(jié)p53誘導(dǎo)凋亡的能力，MDM2還可以降解p53， MDM2可能是p53最重要的抑制因子。有研究報(bào)道， 納米二氧化硅包被氧化錳能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞、L929細(xì)胞中p53基因表達(dá)量升高， 能激活蛋白酶活性從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生［36］。本研究也發(fā)現(xiàn)， 實(shí)驗(yàn)組鰓中p53基因和MDM2基因表達(dá)量升高， 說(shuō)明nZnO能激活氧化應(yīng)激信號(hào)， 使鰓中p53基因和MDM2基因表達(dá)量的升高， 進(jìn)一步驗(yàn)證了nZnO能誘導(dǎo)鰓組織中細(xì)胞發(fā)生凋亡。

p53參與多種生物學(xué)過程， 包括DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控等過程［37］， 當(dāng)組織中活性氧自由基含量過高時(shí)， p53誘導(dǎo)能引起的Bax和PUMA等基因的表達(dá)， 同時(shí)抑制抗氧化酶基因的表達(dá)， 使機(jī)體處于高強(qiáng)度的氧化應(yīng)激狀態(tài)， 最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［38］。p53、Bcl-2、Bax基因的表達(dá)量能作為細(xì)胞凋亡發(fā)生的標(biāo)志物， 這種標(biāo)志物在環(huán)境毒理學(xué)中將發(fā)揮重要作用， 不僅能反應(yīng)環(huán)境污染物早起作用并能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)生物可能的有害影響，而且還能研究污染物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響并揭示污染物致病機(jī)理提供重要的參考價(jià)值［39］。本研究發(fā)現(xiàn)在nZnO脅迫下， 斑馬魚除了鰓組織受到損傷， 抗氧化酶活性發(fā)生變化外， 鰓中p53和MDM2基因的表達(dá)量升高， Bax/Bcl-2比值也發(fā)生變化， 這在以往研究納米材料對(duì)生物的毒性文獻(xiàn)中未見報(bào)道， 說(shuō)明nZnO不僅僅是誘發(fā)斑馬魚鰓組織發(fā)生氧化損傷， 還會(huì)進(jìn)一步引起鰓組織中細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)論

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在一定濃度nZnO脅迫下， 斑馬魚鰓上皮細(xì)胞增生，鰓絲脫落， 部分細(xì)胞空泡化， 鰓絲棍狀化等。nZnO能引起鰓中MDA含量的增加， SOD、GSH-PX活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)， 抗氧化酶活性的變化能調(diào)節(jié)機(jī)體生理平衡， 使其免受氧化脅迫的損傷。nZnO暴露能引起鰓中Bax/Bcl-2的mRNA的表達(dá)量比值升高； p53、MDM2的mRNA表達(dá)量升高， 說(shuō)明nZnO可以誘導(dǎo)鰓組織細(xì)胞凋亡。

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OXIDATIVE DAMAGE RESPONSES ON GILL TISSUES OF ZEBRAFISH WITH EXPOSURE TO ZINC DIOXIDE NANOPARTICLES

LIU Lin and ZHAO Qun-Fen
（School of Marine Sciences， Ningbo University， Ningbo 315211， China）

斑馬魚； nZnO； 鰓組織； 氧化損傷

Zebrafish； Zinc dioxide nanoparticles； Gill tissues； Oxidative damage

X171.5

A

1000-3207（2016）02-0395-08

10.7541/2016.52

2015-05-28；

2015-10-10

水產(chǎn)學(xué)浙江省重中之重（一級(jí)）學(xué)科開放基金（xkzsc1415）資助 ［Supported by the Opening Project of Zhejiang Provincial Top Key Discipline of Fisheries （No. xkzsc1415）］

劉林（1987—）， 男， 河南周口人； 碩士研究生； 主要從事納米材料毒理學(xué)研究。E-mail: liuxiaolin6@126.com

趙群芬， E-mail: zhaoqunfen@nbu.edu.cn