雷高，陳志維，潘亞偉，羅德民，詹麗玲，張丁城，方國(guó)芳，黎玉翠，孫朝躍

1.東莞康華醫(yī)院，廣東 東莞 523080 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，廣東 東莞 523808 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006

加味當(dāng)歸補(bǔ)血片對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征大鼠骨骼及雌性激素的影響

雷高1，陳志維2，3，潘亞偉1，羅德民1，詹麗玲2，張丁城1，方國(guó)芳1，黎玉翠3，孫朝躍3

1.東莞康華醫(yī)院，廣東 東莞 523080 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，廣東 東莞 523808 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006

目的：觀察加味當(dāng)歸補(bǔ)血片對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征大鼠骨骼及相關(guān)雌性激素的影響，為臨床防治圍絕經(jīng)期綜合征提供理論依據(jù)。方法：取雌性自然衰老SD大鼠48只，隨機(jī)分為6組，分別為衰老模型組、西藥陽性組、中藥陽性組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組。各給藥組分別灌胃相應(yīng)濃度的藥物，衰老模型組灌胃等體積蒸餾水。連續(xù)給藥4個(gè)月。測(cè)定骨密度、骨小梁面積、骨小梁面積率、骨小梁個(gè)數(shù)、血清雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）、促黃體素（LH）等指標(biāo)。結(jié)果：與衰老模型組比較，西藥陽性組全身骨密度、左股骨頸骨密度、骨小梁面積、骨小梁面積率、骨小梁個(gè)數(shù)、E2水平、子宮系數(shù)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥陽性組全身骨密度、右股骨骨密度、骨小梁面積、骨小梁面積率、骨小梁個(gè)數(shù)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；中藥高劑量組骨小梁面積、骨小梁面積率、骨小梁個(gè)數(shù)、E2水平、LH水平升高，F(xiàn)SH水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；中藥中劑量組全身骨密度、右股骨骨密度、骨小梁面積、骨小梁面積率、骨小梁個(gè)數(shù)、E2水平、LH水平升高，F(xiàn)SH水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；中藥低劑量組E2水平升高，F(xiàn)SH水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論：加味當(dāng)歸補(bǔ)血片能顯著緩解圍絕經(jīng)期綜合征大鼠骨骼和雌性激素的變化，值得臨床應(yīng)用和推廣。

加味當(dāng)歸補(bǔ)血片；圍絕經(jīng)期綜合征；自然衰老SD大鼠；骨密度；骨小梁；雌性激素；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

圍絕經(jīng)期綜合征又稱更年期綜合征，指婦女絕經(jīng)前后出現(xiàn)性激素波動(dòng)或減少所致的一系列以自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為主，伴有神經(jīng)心理癥狀的一組癥候群，常見癥狀有潮熱、失眠、煩躁、耳鳴及骨質(zhì)疏松等[1]。加味當(dāng)歸補(bǔ)血片是由當(dāng)歸、黃芪、淫羊藿3味中藥精制而成，具有補(bǔ)氣生血作用，可用于治療腎氣漸衰，沖任二脈虛憊，陰陽失調(diào)，氣血兩虛而引起的頭昏耳鳴、心悸失眠、煩躁易怒、抑郁焦慮、潮熱汗出等癥狀。本試驗(yàn)采用了11月齡大鼠作為自然衰老模型，在11月齡時(shí)，大鼠已出現(xiàn)排卵不規(guī)則和反復(fù)的假孕，提示其卵巢功能已開始下降，此時(shí)開始給藥，以反映加味當(dāng)歸補(bǔ)血片對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征大鼠的預(yù)防及治療作用。

1　實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥物與試劑加味當(dāng)歸補(bǔ)血片(當(dāng)歸、淫羊藿各500 g，黃芪100 g三味中藥精制而成，每片0.46 g)：廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心提供，批號(hào)20071201。西藥陽性藥倍美力(PREMARIN)片：0.625 mg/片，愛爾蘭惠氏藥廠生產(chǎn)，批號(hào)071207。中藥陽性藥右歸丸：河南省宛西制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)071004。β-內(nèi)啡肽：北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司提供，批號(hào)：081024。卵泡刺激素(批號(hào)025382)、促黃體素(批號(hào) 028520)、雌二醇(批號(hào) 002871) ELISA試劑盒：北京科美雅生物技術(shù)有限公司提供。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器骨密度測(cè)量?jī)x(美國(guó)GE公司生產(chǎn)型號(hào)Lunar Prodigy)，放免 γ 測(cè)量?jī)x(上海日環(huán)儀器廠生產(chǎn)，型號(hào)TSN-695B)，倒置熒光相差數(shù)碼照相顯微鏡(Nikon公司生產(chǎn)，型號(hào)TE2000－S)，全自動(dòng)石蠟切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司生產(chǎn)，型號(hào) KM2255)，石蠟包埋機(jī)(德國(guó)徠卡公司生產(chǎn)，型號(hào)EG1140)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥自然衰老SD大鼠(11月齡)，雌性，SPF級(jí)，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(粵)2003-0002，合格證號(hào)：0031821。取雌性自然衰老大鼠(11月齡)48只，適應(yīng)性飼養(yǎng)15天(即至11.5月齡)時(shí)，隨機(jī)分為衰老模型組、西藥陽性組、中藥陽性組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組，每組8只。所有大鼠灌胃給藥，給藥量按1 mL/100g體重，每天1次。中藥高、中、低劑量組分別灌胃不同濃度的加味當(dāng)歸補(bǔ)血片(研磨后加蒸餾水配制)，相當(dāng)于0.22 g、0.11 g、0.055 g生藥/mL，西藥陽性組灌胃倍美力(研磨后加蒸餾水配制)，為10.42 μg/mL，中藥陽性組灌胃右歸丸(加蒸餾水超聲配制成混懸液)，為0.45 g/mL，衰老模型組給予等體積蒸餾水。連續(xù)給藥4個(gè)月，末次給藥后動(dòng)物禁食12 h。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，計(jì)量資料以(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。

2　檢測(cè)指標(biāo)

2.1骨密度（BMD）測(cè)定麻醉后采用DEXA法測(cè)定大鼠全身骨密度、腰椎骨密度、雙側(cè)股骨頸骨密度以及雙側(cè)股骨骨密度，因?yàn)橐话闱闆r下，隨年齡增長(zhǎng)，股骨頸區(qū)域的骨密度比股骨骨密度下降的更為迅速[2]。

2.2骨小梁面積、骨小梁面積率的測(cè)定及骨小梁計(jì)數(shù)取2-4腰椎，10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，用圖像分析軟件測(cè)定骨小梁面積及骨小梁面積率。每片隨機(jī)觀察椎體三個(gè)視野(放大10倍)，計(jì)算視野內(nèi)骨小梁個(gè)數(shù)，取平均值。

2.3血清雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）、促黃體素（LH）的測(cè)定腹主動(dòng)脈采血，離心取上清液，保存于-20℃冰箱，用放射免疫分析法(RIA法)測(cè)定血清中E2、FSH、LH含量。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4腎上腺、子宮、卵巢、陰道臟器系數(shù)測(cè)定解剖取相應(yīng)臟器，稱重，按如下公式計(jì)算：臟器系數(shù)(%)=臟器濕重(g)/體重(g)×100%。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1各組大鼠骨密度（BMD）結(jié)果比較見表1。與衰老模型組比較，西藥陽性組全身、左股骨頸骨密度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；中藥陽性組和中藥中劑量組全身、右股骨骨密度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3.2各組大鼠骨小梁面積、骨小梁個(gè)數(shù)、骨小梁面積率結(jié)果比較見表2。與衰老模型組比較，西藥陽性組、中藥陽性組及中藥高、中劑量組骨小梁面積、骨小梁面積率、骨小梁個(gè)數(shù)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，中藥低劑量組無顯著差異。

表1　各組大鼠骨密度(BMD)結(jié)果比較(±s)　g/cm2

表1　各組大鼠骨密度(BMD)結(jié)果比較(±s)　g/cm2

與衰老模型組比較，①P＜0.05

組別衰老模型組西藥陽性組中藥陽性組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組n 8 8 8 8 8 8全身0.173±0.014 0.184±0.006①0.187±0.007①0.183±0.011 0.186±0.010①0.181±0.007腰椎0.202±0.026 0.210±0.014 0.212±0.019 0.216±0.026 0.214±0.016 0.221±0.017左股骨頸0.222±0.013 0.238±0.015①0.227±0.013 0.228±0.012 0.228±0.021 0.222±0.022右股骨頸0.226±0.019 0.228±0.014 0.222±0.015 0.228±0.016 0.227±0.020 0.222±0.019左股骨0.205±0.017 0.214±0.010 0.217±0.015 0.209±0.015 0.211±0.020 0.207±0.010右股骨0.202±0.014 0.213±0.012 0.216±0.011①0.213±0.017 0.219±0.033①0.210±0.009

表2　各組大鼠骨小梁面積、骨小梁個(gè)數(shù)、骨小梁面積率結(jié)果比較(±s)

表2　各組大鼠骨小梁面積、骨小梁個(gè)數(shù)、骨小梁面積率結(jié)果比較(±s)

與衰老模型組比較，①P＜0.05，②P＜0.01

組別衰老模型組中藥陽性組西藥陽性組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組n 8 8 8 8 8 8骨小梁面積(μm2) 130811.8±23206.2 244159.6±19986.8②229953.8±21516.3②238970.6±55800.4②186114.0±31058.0①164330.6±47739.3骨小梁個(gè)數(shù)(個(gè)) 17.0±4.2 20.8±3.0①21.1±4.0①22.3±6.4①20.9±4.1①18.6±3.5骨小梁面積率(%) 0.302±0.054 0.564±0.047②0.531±0.048②0.551±0.128②0.429±0.071①0.379±0.110

3.3各組大鼠血清E2、FSH、LH含量結(jié)果比較見表3。與衰老模型組比較，西藥陽性組E2水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；中藥高、中、低劑量組E2水平顯著升高，F(xiàn)SH水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，中藥高、中劑量組LH水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表3　各組大鼠血清E2、FSH、LH含量結(jié)果比較(±s)

表3　各組大鼠血清E2、FSH、LH含量結(jié)果比較(±s)

與衰老模型組比較，①P＜0.05，②P＜0.01

組別衰老模型組西藥陽性組中藥陽性組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組n 8 8 8 8 8 8 E2(pmoL/L) 34.45±13.38 80.69±40.79②44.13±17.94 63.23±19.91②50.69±13.99①59.33±33.53②FSH(IU/L) 6.57±0.58 5.60±0.86 5.71±1.66 4.62±0.46②3.82±1.05②3.80±1.04②LH(IU/L) 8.04±2.03 7.57±1.27 8.45±2.25 9.70±1.43①9.81±1.40①8.19±1.86

3.4各組大鼠腎上腺、卵巢、子宮、陰道系數(shù)結(jié)果比較見表4。與衰老模型組比較，西藥陽性組子宮系數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，其余各給藥組無顯著性差異。

4　討論

圍絕經(jīng)期綜合征又稱更年期綜合征，是婦科多發(fā)病，發(fā)病率達(dá)到87%，嚴(yán)重威脅女性健康[3～4]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采用激素替代療法，雖有緩解圍絕經(jīng)期癥狀等作用，但長(zhǎng)期使用激素會(huì)產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)[5]。中藥復(fù)方在治療圍絕經(jīng)期綜合征上可以發(fā)揮很好的作用，避免了激素的不良反應(yīng)，療效確切，顯示了良好的應(yīng)用前景[6～7]。

表4　各組大鼠腎上腺、卵巢、子宮、陰道系數(shù)結(jié)果比較(±s)

表4　各組大鼠腎上腺、卵巢、子宮、陰道系數(shù)結(jié)果比較(±s)

與衰老模型組比較，①P＜0.01

組別衰老模型組西藥陽性組中藥陽性組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組n 8 8 8 8 8 8腎上腺0.0158±0.0013 0.0179±0.0031 0.0178±0.0038 0.0165±0.0017 0.0160±0.0029 0.0164±0.0028卵巢0.0327±0.0060 0.0399±0.0110 0.0379±0.0073 0.0338±0.0072 0.0387±0.0087 0.0384±0.0111子宮0.2028±0.0381 0.2938±0.0541①0.2161±0.0304 0.2178±0.0341 0.2192±0.0400 0.2087±0.0218陰道0.0804±0.0161 0.0891±0.0164 0.0953±0.0179 0.0900±0.0273 0.0915±0.0184 0.0852±0.0087

圍絕經(jīng)期綜合征病機(jī)與卵巢功能下降、性激素分泌相對(duì)減少、骨質(zhì)結(jié)構(gòu)變化等有關(guān)[8]。從中醫(yī)角度來說，圍絕經(jīng)期綜合征的病位主要以肝、腎為主，病性以陰虛、氣滯、血虛為主，E2水平與血虛有關(guān)，LH和FSH與肝氣滯相關(guān)[9]。研究證明，在圍絕經(jīng)期綜合征發(fā)生過程中，F(xiàn)SH水平會(huì)出現(xiàn)升高，而E2與LH水平則會(huì)下降[10]。圍絕經(jīng)期婦女由于性激素水平下降，同時(shí)失去了性激素對(duì)骨轉(zhuǎn)換的直接抑制以及骨吸收相對(duì)增加，導(dǎo)致骨丟失比較嚴(yán)重，而性激素缺乏是引起骨質(zhì)疏松最重要的危險(xiǎn)因素[11]。加味當(dāng)歸補(bǔ)血片是在當(dāng)歸補(bǔ)血湯的基礎(chǔ)上，依據(jù)中醫(yī)藥理論，加淫羊藿而制成的現(xiàn)代方劑。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，加味當(dāng)歸補(bǔ)血片具有顯著的類雌激素活性，能發(fā)揮雌激素作用卻不會(huì)促進(jìn)乳腺細(xì)胞的增殖，同時(shí)能增強(qiáng)堿性磷酸酶活性，上調(diào)骨骼生長(zhǎng)基因表達(dá)，促進(jìn)骨骼細(xì)胞分化和生長(zhǎng)[12]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加味當(dāng)歸補(bǔ)血片能夠顯著升高衰老大鼠的E2與LH水平，同時(shí)降低FSH水平，說明加味當(dāng)歸補(bǔ)血片可以調(diào)節(jié)衰老大鼠的雌性激素水平；加味當(dāng)歸補(bǔ)血片可增加衰老大鼠的骨密度、骨小梁面積、數(shù)量，從一定程度上減緩衰老大鼠骨質(zhì)疏松，緩解衰老大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)退化。綜上所述，加味當(dāng)歸補(bǔ)血片在治療女性圍絕經(jīng)期綜合征具有廣闊的開發(fā)前景，可以開發(fā)出療效顯著的治療圍絕經(jīng)期綜合征的藥物，但是，其具體的作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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（責(zé)任編輯：馮天保，鄭鋒玲）

Effect of Modified Angelica Blood-enriching Tablets on Bones and Estrogen in Rats with Climacteric Syndrome

LEI Gao，CHEN Zhiwei，PAN Yawei，LUO Demin，ZHAN Liling，ZHANG Dingcheng，F(xiàn)ANG Guofang，LI Yucui，SUN Chaoyue

Objective：To observe the effect of modified angelica blood-enriching tablets on bones and relevant estrogen in rats with climacteric syndrome，and provide theoretical and experimental basis for the clinical treatment of climacteric syndrome.Methods：Took out 48 female natural aging SD rats and divided them into six groups.They were aging model group，western positive medicine group，Chinese positive medicine group，Chinese medicine high dosage group，Chinese medicine middle dosage group，Chinese medicine low dosage group.Each group was given medicine of corresponding dosage respectively for 4 months orally，and aging model group2)，follicle stimulating hormone(FSH)，luteinizing hormone(LH).Results：The general bone mineral density，density of the left femoral bone and left cervical bone，trabecular bone area，rate of trabecular bone area，volume of trabecular bone，E2levels，uterus coefficient of western positive medicine group，comparing with those of aging model group，were increased obviously(P＜0.05).The general bone mineral density，density of the right femoral bone，trabecular bone area，rate of trabecular bone area，volume of trabecular bone of Chinese positive medicine group were raised(P＜0.05，P＜0.01).The trabecular bone area，rate of trabecular bone area，volume of trabecular bone，E2levels and LH levels of Chinese medicine high dosage group were increased，while FSH levels was declined，differences being significance (P＜0.05，P＜0.01).For Chinese medicine middle dosage group，the general bone mineral density，density of the right femoral bone，trabecular bone area，rate of trabecular bone area，volume of trabecular bone，E2levels and LH levels were raised，but FSH levels was decreased(P＜0.05，P＜0.01).Comparing with aging model group，there were significant differences Chinese medicine low dosage group(P＜0.05，P＜0.01)，in which the E2levels was increased，but FSH level was decreased.Conclusion：Modified angelica blood-enriching tablets can obviously relieve the variations in bones and relevant estrogen in rats with climacteric syndrome，and it is worth applying and popularizing clinically.

distilled water of equal volume for 4 months. Measured indexes such as the density of bone，the trabecular bone area，the rate of trabecular bone area，the volume of trabecular bone，serum estradiol(E

Modified angelica blood-enriching tablets；Climacteric syndrome；Natural aging SD rats；Density of bone；Trabecular bone；Estrogen；Animal experiment

R285

A

0256-7415（2016）11-0218-04

10.13457/j.cnki.jncm.2016.11.093

2016-05-26

東莞市醫(yī)療衛(wèi)生單位科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012105102012）

雷高（1946-），男，主任醫(yī)師，研究方向：骨科、顯微外科、脊柱外科。

陳志維，E-mail：vitas_chan@126.com。