劉萍

3578例ANA、dsDNA和ENA抗體譜聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果分析

劉萍

目的探討ANA、dsDNA和ENA抗體譜聯(lián)合檢測(cè)對(duì)自身免疫性疾病的診斷意義。方法收集2011～2014年在我院就診并進(jìn)行ANA、dsDNA和ENA抗體譜聯(lián)合檢測(cè)的患者共3578例，分析檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果以ANA、dsDNA和ENA抗體譜中≥1種抗體檢測(cè)結(jié)果陽性即為陽性標(biāo)本，結(jié)果顯示女性陽性率顯著高于男性（P＜0.01）；ANA、dsDNA和ENA抗體譜聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果陽性可見于多種臨床疾病，以系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）、混合性結(jié)締組織?。∕CTD）、干燥綜合征（SS）多見，其中系統(tǒng)性紅斑狼瘡最常見；在SLE、RA、MCTD、SS檢測(cè)中，ANA對(duì)抗原的檢測(cè)較全面，覆蓋面廣，檢測(cè)陽性率高，但特異性不強(qiáng)；dsDNA在SLE的診斷中具有重要意義，特異性高，但敏感性差；ENA抗體譜檢測(cè)陽性率低，特異性強(qiáng)。三者進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，可以通過互補(bǔ)提高自身抗體的檢出率。結(jié)論自身免疫性疾病患者體內(nèi)存在多種自身抗體，聯(lián)合檢測(cè)ANA、dsDNA和ENA抗體譜有助于自身免疫性疾病的診斷和鑒別。

ANA；dsDNA；ENA抗體譜；自身免疫性疾病

自身免疫性疾病（autoimmune diseases，AID）是由于自身抗原表位反應(yīng)的抗體或自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞參與，由自身免疫反應(yīng)引發(fā)，并導(dǎo)致一系列組織損傷或功能障礙的疾病。目前主要是通過臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查來診斷AID的類型?？购丝贵w（ANA）、抗雙鏈脫氧核糖核酸抗體（dsDNA）、抗核抗體譜IgG（ENA抗體譜）的檢測(cè)是AID的常用實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)。為了進(jìn)一步研究ANA、dsDNA和ENA抗體譜聯(lián)合檢測(cè)對(duì)AID診斷的作用與意義，現(xiàn)對(duì)2011～2014年在本院進(jìn)行ANA、dsDNA和ENA抗體譜聯(lián)合檢測(cè)的3578例患者檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 資料來源2011～2014年在本院就診并進(jìn)行ANA、dsDNA和ENA抗體譜聯(lián)合檢測(cè)的患者共3578例，其中男1862例，女1716例。年齡1～93歲，平均37歲。收集患者的臨床資料和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，以出院診斷作為疾病診斷依據(jù)。

1.2 方法抽取患者空腹靜脈血5 ml（非抗凝管），3000 r/min離心5 min，吸出血清，2～8℃保存。ANA和dsDNA檢測(cè)采用美國Trinity Biotech Plc公司產(chǎn)品，ENA抗體譜采用德國歐盟醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司產(chǎn)品，嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.1 ANA和dsDNA抗體檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）。純化的ANA抗原或dsDNA抗原包被在相應(yīng)的固相微孔內(nèi)，微孔分別加入陰性對(duì)照、校準(zhǔn)品、陽性對(duì)照，用血清稀釋液1∶21稀釋的患者血清100 μl。室溫孵育30 min，洗板5次，每孔加入辣根過氧化酶結(jié)合的山羊抗人抗體結(jié)合物100 μl，洗板5次；每孔加入TMB染色底物液100 μl，室溫避光15 min，每孔加入1N H2SO4終止液100 μl。5 min后用酶標(biāo)儀（美國雷博公司W(wǎng)ellscanMk3）檢測(cè)標(biāo)本450 nm波長的OD值。標(biāo)本的OD值除以校準(zhǔn)品OD值再乘以校正因子（校準(zhǔn)品試劑瓶上有）的積，所得值即為免疫狀態(tài)指數(shù)（ISR）值。ISR值≥1.10，則結(jié)果為陽性。

1.2.2 ENA抗體譜檢測(cè)采用免疫印跡法（IBT），步驟如下：（1）對(duì)膜條進(jìn)行預(yù)處理，然后加入患者血清進(jìn)行溫育30 min，再清洗3遍；（2）加入酶結(jié)合物溫育30 min，再清洗3遍；（3）加入底物溫育10 min，然后用蒸餾水清洗膜條，風(fēng)干后得到檢測(cè)膜條；（4）干透后的檢測(cè)膜條用臺(tái)式掃描儀（Canon LiDE110）掃描，并采用EUROLineScan軟件評(píng)價(jià)結(jié)果；（5）以檢測(cè)膜條字母端第一段區(qū)域?yàn)橘|(zhì)控區(qū)，可見一條黑色質(zhì)控帶，其余膜條包被抗原的部位為白色則結(jié)果為陰性，其余膜條包被抗原的部位出現(xiàn)線性黑色則為陽性；（6）用EUROLineScan軟件根據(jù)EuroimmunAg掃描儀對(duì)膜條的掃描結(jié)果評(píng)價(jià)出陽性程度，“+”越多表示陽性程度越強(qiáng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同組間計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果以ANA、dsDNA、ENA抗體譜中≥1種抗體檢測(cè)結(jié)果陽性即為陽性標(biāo)本，陽性標(biāo)本共855例，其中男性196例，女性659例，男女比例為1∶3.36，女性明顯多于男性。男性標(biāo)本1862例，陽性率為10.5%；女性標(biāo)本1716例，陽性率為38.4%，女性標(biāo)本陽性率顯著高于男性（P＜0.01）。

2.2 陽性標(biāo)本分析ANA、dsDNA和ENA抗體譜聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果陽性可見于多種臨床疾病，如多發(fā)性硬化、低蛋白血癥、淋巴結(jié)腫大原因待查、雙手麻木查因、腦挫裂傷、間質(zhì)性肺炎、2型糖尿病、雷偌綜合癥、免疫性血小板減少、慢性腎衰竭尿毒癥期、血小板減少性紫癜、發(fā)熱待查、肺間質(zhì)纖維化、膽囊結(jié)石伴膽囊炎、消化道出血、溶血性貧血、腹膜后淋巴結(jié)切除術(shù)后、肺部感染、慢性乙型病毒性肝炎（重型）、雙側(cè)胸腔積液、自身免疫性溶血性貧血、風(fēng)濕性心臟病、重度貧血、先天性肝纖維化、幼年特發(fā)關(guān)節(jié)炎等，最常見的有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、混合性結(jié)締組織病、干燥綜合征，這4者均為自身免疫性疾病，其中系統(tǒng)性紅斑狼瘡的例數(shù)遠(yuǎn)多于其他疾?。ū?）。

表1 陽性率排前4位的疾病分布

2.34 種最常見自身免疫性疾病患者ANA、dsDNA、ENA抗體譜檢測(cè)結(jié)果分析從表2可見，在SLE、RA、MCTD、SS這4種患者中，ANA的陽性檢出率最高，dsDNA次之，ENA抗體譜中的各抗體檢出率各不相同。

3 討論

ANA是以自身真核細(xì)胞成分作為靶抗原的一組自身抗體的總稱，泛指各種核成分的抗體，是一種廣泛存在的自身抗體［1］。由于ANA的重要性和復(fù)雜性，目前ANA的檢測(cè)方法繁多，最常用的是間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫印記法，檢測(cè)ANA的標(biāo)準(zhǔn)方法是間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence，IIF）［2］。本研究選擇的是酶聯(lián)免疫吸附法，因?yàn)镮IF作為自身免疫病篩查手段的一個(gè)重要缺陷是其診斷特異性不強(qiáng)［3］，有研究表明大約有20%健康人群的血清用IIF篩查AID會(huì)得出假陽性結(jié)果，其中大部分與血清中的抗DFS70抗體有關(guān)［4-5］。實(shí)際上在多種非自身免疫病甚至健康人群血清中都存在抗DFS70抗體，而AID如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等血清中卻較少出現(xiàn)該抗體［5-7］。此外，Mahler等［8］用IIF技術(shù)檢測(cè)345例抗核糖體P蛋白抗體陽性血清時(shí)，僅得到不足30%的陽性率，提示IIF技術(shù)用于檢測(cè)某些特定自身抗體的敏感性較差。而酶聯(lián)免疫吸附法可用于大批量標(biāo)本測(cè)定，在結(jié)果判斷時(shí)對(duì)操作者經(jīng)驗(yàn)程度要求不高，不受非DNA結(jié)合蛋白影響，可以通過滴度體現(xiàn)出抗體濃度高低。

臨床上女性自身免疫性疾病患者明顯多于男性患者，本研究結(jié)果也是如此。這是因?yàn)榇萍に厥求w液免疫增強(qiáng)劑，而雄激素是天然的免疫抑制劑。因此女性的免疫反應(yīng)強(qiáng)于男性，更容易患一些自身免疫性疾病。雌激素及其代謝產(chǎn)物水平、雌激素受體基因多態(tài)性、雌激素受體介導(dǎo)的信號(hào)通路等，也與自身免疫性疾病密切相關(guān)［9］。

從表2可見，在這4種最常見的自身免疫性疾病中，ANA均有較高的檢測(cè)陽性率，且高于dsDNA和ENA抗體譜，但其特異性較差。原因在于ANA是以自身真核細(xì)胞成分作為靶抗原的一組自身抗體的總稱，是一種廣泛存在的自身抗體，不僅存在于細(xì)胞核內(nèi)，還存在于細(xì)胞漿，細(xì)胞骨架以及細(xì)胞分裂周期，無器官特異性和種屬特異性。因此，ANA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)只能考慮作為自身免疫性疾病的篩查實(shí)驗(yàn)。dsDNA在SLE檢測(cè)中意義較大，具有較高的特異性，其參與了SLE的病理過程。dsDNA與DNA結(jié)合，形成免疫復(fù)合物沉積在腎小球基底膜，dsDNA也可直接作用于腎小球抗原造成SLE患者的腎損害。隨著疾病活動(dòng)的控制，dsDNA滴度可以下降或消失。因此，dsDNA是SLE疾病診斷和治療監(jiān)測(cè)的一個(gè)重要指標(biāo)。dsDNA對(duì)診斷SLE的特異性高，但敏感性差，本研究中，dsDNA的陽性率是68%，存在漏檢，故dsDNA陰性并不能排除SLE。另外，本研究中，ENA抗體譜中的抗核小體和SM檢測(cè)陽性只出現(xiàn)在SLE疾病患者中，亦具有高度特異性，可作為SLE血清學(xué)診斷的標(biāo)志性抗體。但其特異性高，陽性率低，本研究中，抗核小體陽性率為10%，抗SM抗體的陽性率為12%。

表24 種自身免疫性疾病患者ANA、dsDNA、ENA抗體譜檢測(cè)結(jié)果［n（%）］

對(duì)SLE而言，ANA、dsDNA、ENA抗體譜在其診斷中有各自的特點(diǎn)，聯(lián)合檢測(cè)可減少因單項(xiàng)實(shí)驗(yàn)發(fā)生的漏檢誤診情況，起到互補(bǔ)作用。RA疾病患者和SLE疾病患者有許多相似的臨床癥狀，例如關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、晨僵等。RA作為自身免疫性疾病，在本研究的檢測(cè)中ANA的檢測(cè)亦有較高的陽性率（51%），dsDNA檢測(cè)的陽性率是25%，但ENA抗體譜檢測(cè)除SSA檢測(cè)有少量陽性（6%）外，其余皆為全陰。這對(duì)RA的鑒別診斷有重要作用。

在MCTD疾病患者的檢測(cè)中，ANA的檢測(cè)陽性率為47%，dsDNA檢測(cè)的陽性率較低（8%）。另外，ENA抗體譜中的JO-1抗體只在MCTD患者的檢測(cè)中表達(dá)出陽性，這對(duì)MCTD的鑒別診斷有重要作用。

本研究在SS疾病檢測(cè)中，ANA以及ENA抗體譜中SSA檢測(cè)的陽性率達(dá)到了100%，dsDNA檢測(cè)的陽性率是30%，三者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)其診斷和鑒別具有重要意義。

SLE、RA、MCTD、SS作為臨床較常見自身免疫性疾病，在其檢測(cè)中，ANA對(duì)抗原的檢測(cè)較全面，覆蓋面廣，檢測(cè)陽性率高，但特異性不強(qiáng)。dsDNA在 SLE的診斷中具有重要意義，特異性高，但敏感性差。而ENA抗體譜檢測(cè)陽性率低，但特異性強(qiáng)。三者進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，可以通過互補(bǔ)提高自身抗體的檢出率。因此，在臨床應(yīng)用時(shí)，同時(shí)進(jìn)行ANA、dsDNA和ENA抗體譜聯(lián)合檢測(cè)，將有助于自身免疫性疾病的篩查、診斷和鑒別，同時(shí)減輕患者負(fù)擔(dān)。

［1］吳希國，劉秀珍，馬越.173例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者ANA、ENA和dsDNA抗體的聯(lián)合檢測(cè)分析［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012，22（4）:781-782.

［2］Peterson LK，Wells D，shaw L，et al.Novel method for quantitative ANA measurement using near-infrared imaging［J］.J Immunol Methods，2009，349:l-8.

［3］Fritzler MJ.The antinuclear antibody test:last or lasting gasp［J］. Arthritis&Rheumatism，2011，63（1）:19-22.

［4］Watanabe A，Kodera M，Sugiura K.Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers［J］.Arthritis Rheumatism，2004，50（3）: 892-900.

［5］Mahler M，Parker T，Peebles CL，et al.Anti-DFS70/LEDGF antibodies are more prevalent in healthy individuals compared to patients with systemic autoimmune rheumatic diseases［J］.J Rheumatol，2012，39（11）:2104-2110.

［6］GanapathyV，CasianoCA.Autoimmunitytothenuclear autoantigen DFS70（LED-GF）:What exactly are the autoantibodies trying to tell us［J］.Arthritis Rheum，2004，50（3）:684-688.

［7］Daniels T，Zhang J，Gutierrez I，et al.Antinuclear autoantibodies in prostate cancer:immunity to LEDGF/p75，a survival protein highly expressed in prostate tumors and cleaved during apoptosis［J］. Prostate，2005，62（1）:14-26.

［8］Mahler M，Jennifer TN，Schulte-Pelkum J，et al.Limited reliability of the indirect immunofluorescence technique for the detection of anti-Rib-P antibodies［J］.Arthritis Research&Therapy，2008，10（6）: 131-138.

［9］周衛(wèi)，邢艷.雌激素及其受體與自身免疫性疾?。跩］.國際免疫學(xué)雜志，2010，33（1）:34-37.

R 446.61

A

1004-0188（2016）05-0559-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.05.036

2015-12-24）

510010廣州，廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院檢驗(yàn)科