陳方方 胡 霞

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830011)

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腦缺血模型大鼠腦組織Slit2蛋白表達與血管新生的相關(guān)性

陳方方 胡 霞

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830011)

目的 探討大鼠腦缺血后Slit2同源物2(Slit2)蛋白與血管新生的相關(guān)性。方法 將36只SD雄性大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型1 d組和模型3 d組，每組12只。采用線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型，并于第1、3天分別進行行為學(xué)評分。取腦組織，采用Western印跡方法檢測缺血腦組織中Slit2及其受體Robo1蛋白以及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達。利用CD50標記大鼠新生血管內(nèi)皮細胞，計數(shù)新生血管密度(MVD)。結(jié)果 模型組大鼠缺血腦組織中Slit2蛋白、VEGF的表達以及MVD均明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)，且在模型1 d組和模型3 d組中Slit2蛋白、VEGF的表達和MVD均明顯升高；而與假手術(shù)組相比，Robo1的表達也在造模第1天顯著升高(P<0.01)，但第3天其表達卻出現(xiàn)下降，但仍明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦組織中Slit2蛋白的表達與VEGF及MVD呈正相關(guān)(r=0.981、0.944，P<0.01)。結(jié)論 在腦缺血模型大鼠腦組織中Slit2蛋白的表達升高，推測Slit2蛋白可能與大鼠腦缺血后血管的新生密切相關(guān)。

腦缺血；Slit2蛋白；血管新生

腦缺血發(fā)生后，缺血區(qū)域通過加快新生血管的形成改善局部腦血流供應(yīng)進而挽救缺血半暗帶內(nèi)瀕臨死亡的神經(jīng)細胞，促進神經(jīng)功能的恢復(fù)，對腦缺血的預(yù)后發(fā)揮重要作用。Slit2同源物2(Slit2)蛋白是由神經(jīng)系統(tǒng)中線的神經(jīng)細胞分泌的一種糖蛋白，是Robo1蛋白配體〔1,2〕。研究發(fā)現(xiàn)〔3～5〕，Slit2/Robo1信號通路可能通過導(dǎo)向血管內(nèi)皮頂端細胞的遷移影響新生血管的分支與延伸，在血管的形成過程中發(fā)揮重要的作用，與腫瘤以及各種組織的血管新生也存在密切聯(lián)系。本文通過檢測Slit2，Robo1，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達以及新生血管密度(MVD)，探討腦缺血模型中Slit2蛋白表達與血管新生的關(guān)聯(lián)并推測其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 成年雄性SD大鼠36只，7周齡，體重250～280 g，平均268 g，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。動物合格編號SCXK(豫)2015-0012。

1.2 模型制備及行為學(xué)評分 采用線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型。10%水合氯醛麻醉大鼠，沿頸正中部行3～4 cm的切口，鈍性分離肌肉，暴露頸總動脈以及頸內(nèi)、頸外動脈并分離，結(jié)扎頸外動脈，在距離頸內(nèi)、頸外動脈分叉2 cm處剪一小口，并輕輕插入線栓，直至遇到阻力為止，結(jié)扎固定線栓，縫合切口。術(shù)后2 h后根據(jù)Longa〔6〕評分法對大鼠進行行為學(xué)評分，1～3分為合格，納入實驗。評分為0和4分的剔除實驗。

將36只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型1 d組和模型3 d組，每組12只，假手術(shù)組除不插線外，其余操作同模型組，分別于術(shù)后第1天和第3天頸椎脫臼處死大鼠。

1.3 Western印跡檢測缺血腦組織中Slit2、Robo1以及VEGF的表達 取損傷區(qū)的腦組織，剪碎，加入裂解液，置冰上勻漿并4℃裂解30 min，14 000 r/min離心5 min，取上清凍存。用二甲基喹啉(BCA)法測定蛋白濃度，取適量上清，加入十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，煮沸5 min，在100 V電壓下電泳2 h，轉(zhuǎn)至聚偏氟丙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)漂洗3次加入二抗孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光顯影定影。采用Bandscan5.0軟件進行灰度值分析，Slit2、Robo1以及VEGF蛋白的灰度值與內(nèi)參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)灰度值的比值作為目的蛋白的表達水平。

1.4 MVD的檢測 大鼠麻醉后，經(jīng)心臟灌注生理鹽水，待兩側(cè)上肢和肺部變白后，再用4%多聚甲醛灌注至雙上肢僵硬，取出腦組織，并置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋并切片。切片脫蠟水化后，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗(5 min，3次)，抗原修復(fù)15 min，37℃血清封閉0.5 h后加一抗(CD50)，4℃孵育過夜，加二抗37℃孵育30 min，加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)37℃溫箱孵育30 min后，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，封片。鏡下觀察并參照Weidner 等〔7〕的方法進行微血管計數(shù):在低倍視野下找到血管密度最高處，再在400倍視野下，以呈棕色單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇且與鄰近的微血管或其他結(jié)締組織分開者為一個微血管，在熱點處選取4 個不同區(qū)域進行微血管計數(shù)，計算MVD，單位為個/視野。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件，采用單因素方差分析和t檢驗比較各組大鼠缺血腦組織中Slit2蛋白、VEGF和Robo1的表達以及MVD；相關(guān)性用Pearson軟件進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 Slit2蛋白的表達 模型組缺血腦組織中Slit2蛋白的表達顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，且模型3 d組Slit2蛋白的表達較模型1 d組明顯升高(P<0.01)。見表1，圖1。

2.2 Robo1蛋白的表達 與假手術(shù)組比，模型1 d組和模型3 d組中Robo1蛋白的表達均明顯升高(P<0.01)，術(shù)后第1天升高最為顯著(P<0.05)，然而第3天后其表達卻下降明顯。見表1，圖2。

2.3 VEGF的表達 模型1 d組和模型3 d組的大鼠腦缺血組織中VEGF的表達均高于假手術(shù)組(P<0.01)，GAPDH作為內(nèi)參照，見表1，圖3。

2.4 各指標相關(guān)性分析 Slit2蛋白的表達與VEGF、MVD具有顯著的正相關(guān)(r=0.981、0.944，P<0.01)。

表1 大鼠缺血腦組織中各指標比較±s,n=12)

與假手術(shù)組比較:1)P<0.05，與模型1 d組比較：2)P<0.01

圖1 Slit2蛋白在腦缺血組織中的表達

圖2 Robo1蛋白在腦缺血組織中的表達

圖3 VEGF在腦缺血組織中的表達

3 討 論

Slit/Robo信號通路可以通過充當(dāng)一些軸突的導(dǎo)向抑制因子或軸突支化和延長誘導(dǎo)因子在細胞遷移、炎性反應(yīng)、腫瘤發(fā)生及器官發(fā)育等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用〔8～10〕。Wang 等〔11〕首次提出，Slit2蛋白作為誘導(dǎo)劑在體內(nèi)通過與人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)上與Robo1受體特異性結(jié)合，促進內(nèi)皮細胞的定向遷移和血管形成。后來通過R5阻斷Robo1在雞胚尿囊絨膜血管生成實驗證明Slit2/Robo1對新生血管的形成是必不可少的，內(nèi)皮細胞在血管生成刺激物的刺激下可以生成新的血管，如在VEGF等刺激下內(nèi)皮細胞發(fā)生定向遷移，游走并聚合于血管生成刺激因子區(qū)域，形成管腔結(jié)構(gòu)逐漸形成血管網(wǎng)。在子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)研究中，學(xué)者們也發(fā)現(xiàn)Slit2 蛋白過表達能夠增加微血管密度和病變大小〔12〕。Rama 等〔13〕通過敲除小鼠Slit 及Robo 蛋白的各亞型，發(fā)現(xiàn)Slit2可以選擇性地結(jié)合Robo1 和Robo2受體進而誘發(fā)新生小鼠視網(wǎng)膜及眼部新生血管性疾病。Jones 等〔14〕通過細胞生物學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，Slit2 通過細胞表面形成的Robo4-paxillin復(fù)合體阻斷胞內(nèi)Arf6 的激活，抑制脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜血管疾病病理性血管生成。報道指出，EphA2缺陷的內(nèi)皮細胞Slit2 蛋白表達升高，抑制Slit2 蛋白活性可以促進體內(nèi)以及體外培養(yǎng)細胞中VEGF 誘導(dǎo)的血管生成〔15〕。但Altay等〔16〕通過TNFα誘導(dǎo)小鼠腦缺血和全心缺血模型，在對Slit蛋白調(diào)節(jié)腦血管炎癥的研究中指出內(nèi)源性Slit蛋白腦血管炎癥應(yīng)答反應(yīng)起負調(diào)控作用；而外源Slit通過降低大腦微循環(huán)中細胞因子及局部缺血誘導(dǎo)的白細胞的募集反應(yīng)參與調(diào)節(jié)腦血管炎癥反應(yīng)。

Robo1作為Slit2蛋白受體，VEGF作為誘導(dǎo)新生血管產(chǎn)生的最主要細胞因子，MVD可直接代表血管新生程度。本研究提示Slit2蛋白與缺血腦組織的血管新生密切相關(guān)，推測可能是Slit2蛋白通過增加VEGF的表達從而間接增強缺血腦組織的血管新生，或者是Slit2蛋白協(xié)同VEGF直接參與缺血腦組織的血管新生進程。模型組在造模第1天Robo1的表達急劇升高，這可能與細胞受損后的應(yīng)激以及Robo1介導(dǎo)的炎癥細胞趨化黏附有關(guān)；而在第3天時Robo1的表達有所下降，但仍高于假手術(shù)組，可能是隨著缺血腦組織炎癥反應(yīng)的緩和使得Robo1的表達水平下降，但Slit2蛋白表達升高仍需要高水平的Robo1來發(fā)揮Slit2蛋白介導(dǎo)的血管新生作用。

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〔2016-03-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

陳方方(1977-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病方面的研究。

R743

A

1005-9202(2016)19-4719-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.021