瑪爾江·木坎 艾里米熱·達(dá)吾爾夏提
(新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所,新疆烏魯木齊 830063)
高效液相色譜法測定畜產(chǎn)品中氟苯尼考的方法研究
瑪爾江·木坎 艾里米熱·達(dá)吾爾夏提
(新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所,新疆烏魯木齊 830063)
對(duì)高效液相色譜法測定畜產(chǎn)品中氟苯尼考的提取溶劑和條件、凈化試劑和步驟等預(yù)處理方法和色譜操作條件進(jìn)行了優(yōu)化,建立了牛肉中氟苯尼考?xì)埩舻姆治龇椒?。采用乙酸乙酯提取牛肉中的氟苯尼考?xì)埩簦?jīng)正己烷脫脂和用流動(dòng)相定容,Waters Xterra . ms C18柱分離,紫外波長224 nm下定量測定。方法的最低檢出限濃度為50ng/kg,線性范圍200~1000ng/kg,回歸系數(shù)r=0.9995,RSD <1.5%,平均回收率90.06%。結(jié)果表明,該方法簡便快捷,精密度和回收率高,適用于肉制品中氟苯尼考?xì)埩魴z測的要求。
氟苯尼考 高效液相色譜 畜產(chǎn)品
氟苯尼考(florfenicol,F(xiàn)F)又名氟甲砜霉素,是甲砜霉素的單氟衍生物,學(xué)名稱D(+)-蘇-1-對(duì)甲砜基苯基-2-二氯乙酰基-3-氟丙醇,是由美國先靈-保雅公司于20世紀(jì)80年代末研制開發(fā)的一種新型動(dòng)物專用氯霉素類廣譜抗生素。
本研究欲在已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)高效液相色譜法測定牛肉中氟苯尼考的預(yù)處理方法進(jìn)行優(yōu)化,旨在建立一種簡單、快速、可靠的提取凈化方法,且方法的檢出限和精密度能滿足國內(nèi)外進(jìn)出口食品安全檢測的要求。與同類方法相比高效液相色譜法具有高效、快速、穩(wěn)定、可靠、操作簡便、靈敏度高、線性關(guān)系好、精密度高以及不受其他雜質(zhì)的干擾等優(yōu)點(diǎn)。
樣品中的氟苯尼考在堿性條件下,用乙酸乙酯提取,提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干,殘?jiān)运芙猓?jīng)正己烷溶液分配脫脂。用正己烷脫脂,液相色譜儀檢測氟苯尼考峰面積定量。
安捷倫1200系列高效液相色譜儀;渦旋振蕩器;高速離心機(jī),轉(zhuǎn)速≥10000r/min;分析天平(XS105)感量0.0001mg;氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品,含量99.3%,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。
乙腈(色譜純);冰醋酸(分析純);乙酸乙酯(分析純);氨水(分析純);無水硫酸鈉(分析純使用前650℃烘干4h)。
2.1 色譜條件
Waters Xterra.ms C18柱(150mm×4.6mm×5μm)色譜柱,流動(dòng)相為(乙腈:水:冰醋酸=100:197:3);檢測波長224nm,流速:1.0ml/min,柱溫:25℃,進(jìn)樣量:10μl。
2.2 對(duì)照品配制及樣品處理
2.2.1 對(duì)照品溶液的制備
精密稱取氟苯尼考對(duì)照品10.07mg至10ml容量瓶內(nèi),加流動(dòng)相溶解并定容至刻度,制成氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)液(1000μg/ml)置于冰箱(-18℃)保存。
2.2.2 樣品的提取
稱?。?.00g±0.01g)試料,置于聚丙烯離心管中,加入25ml乙酸乙酯,0.75ml氨水,3g無水硫酸鈉,均漿提取30s,10000r/ min離心3min,上清液轉(zhuǎn)移至50ml比容量瓶中,另取一支50ml離心管加入20ml乙酸乙酯,0.60ml氨水,洗滌均漿刀頭10s,洗滌液移入第一支離心管中,用玻璃棒攪動(dòng)殘?jiān)?,渦旋振蕩提取1min,超聲波振蕩提取5min,在10000r/min轉(zhuǎn)速下離心3min,上清液合并至50ml容量瓶中,再用乙酸乙酯定容至50.0ml。搖勻后移取10.0ml乙酸乙酯提取液于150ml雞心瓶中,45℃減壓旋轉(zhuǎn)濃縮至干。
2.2.3 樣品的凈化
雞心瓶中的殘?jiān)?.00ml超純水溶解,渦旋振蕩混勻,超聲5min,加入3ml正己烷渦旋振蕩混合30s,靜置分層,棄掉上層的正己烷,再加3ml正己烷渦旋震蕩混合器30s,靜置分層,移去部分下層的水相于10ml的聚丙烯離心管中,在10000r/min轉(zhuǎn)速下離心6min,經(jīng)0.22μm濾膜過濾后,供高效液相色譜儀測定。
2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性范圍
分別從(100μg/ml)氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中取20μl,40μl,60μl,80μl,100μl于10ml容量瓶中,用流動(dòng)相稀釋定容至10.00ml,混勻。使標(biāo)準(zhǔn)溶液中每1ml含氟苯尼考200,400,600,800,1000ng,進(jìn)樣10μl,以氟苯尼考保留時(shí)間定性,各濃度的峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表1。結(jié)果表明,氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)溶液在200~1000ng/ml范圍內(nèi),其峰面積與濃度C呈線性相關(guān),線性方程為y=22.30x-1.89,相關(guān)系數(shù):r=0.99951(圖1)。
表1 200~1000 ng/ml氟苯尼考標(biāo)液的峰面積
圖1 氟苯尼考的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
2.4 最低檢出限的測定
從空白樣品中分別高濃度依次添加各濃度氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液后按步驟2.2.2和2.2.3將樣品處理好后進(jìn)行最低檢出限檢出實(shí)驗(yàn)。
當(dāng)濃度為50ng/ml時(shí)在5.533min時(shí)有氟苯尼考的峰出現(xiàn),峰面積為3.3256;當(dāng)濃度為40ng/ml時(shí)氟苯尼考在規(guī)定的氟苯尼考出峰時(shí)間內(nèi)沒有出現(xiàn)氟苯尼考峰;見下圖2和圖3。結(jié)果表明,最低檢測濃度為50ng/ml。
圖2 濃度為50ng/ml時(shí)氟苯尼考的色譜圖
圖3 濃度為40ng/ml時(shí)氟苯尼考的色譜圖
2.5 精密度和穩(wěn)定性的測定
對(duì)同一份同樣濃度(1μg/kg)下連續(xù)進(jìn)樣十次,每次進(jìn)樣間隔為10min。記錄峰面積和出峰時(shí)間,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見表2。
表2 1000ng/kg濃度試樣中氟苯尼考的穩(wěn)定性測定
結(jié)果表明,氟苯尼考標(biāo)液10次測定的RSD%分別為1.06%和0.01%,表明該方法的精密度良好,出峰時(shí)間穩(wěn)定。
2.6 回收率實(shí)驗(yàn)
以不含氟苯尼考的牛肉為本底,分別添加1500ng/ml,2000ng/ ml,2500ng/ml三個(gè)濃度的氟苯尼考標(biāo)液,采用乙酸乙酯和氨水為提取溶劑,按實(shí)驗(yàn)步驟2.2.2和2.2.3進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表3。
表3 不同濃度牛肉中氟苯尼考的回收率測試結(jié)果
結(jié)果顯示:不同濃度牛肉樣中氟苯尼考的回收率在84.7%~102.3%之間,平均回收率為92.51%。
本研究的色譜條件與GB/T 22959-2008的色譜條件有較大的改進(jìn)。由于色譜柱的性質(zhì),流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的含量、離子強(qiáng)度以及pH值均會(huì)對(duì)藥物殘留、溶解性能以及分離效果產(chǎn)生影響。在做此研究時(shí)的時(shí)候,我先后采取了四種方法來比較出峰情況。分別有:(1)乙腈:水=1:3;(2)乙腈:0.5%磷酸=4:1;甲醇:水=4:1和(4)乙腈:水:冰醋酸=100:197:3。甲醇和乙腈是液相色譜中最常用的兩種有機(jī)溶劑,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),采用乙腈為流動(dòng)相,用量較少,靈敏度略高于使用甲醇。而且甲醇-水作流動(dòng)相時(shí)其保留時(shí)間比較短,容易被雜質(zhì)峰干擾。乙腈做流動(dòng)相不僅有利于降低基線噪音而且乙腈與水配制成的流動(dòng)相會(huì)使柱壓降低,延長了色譜柱的使用壽命。由于流動(dòng)相的pH值對(duì)藥物峰形有很大影響,因此通過加入冰醋酸可以緩沖pH值,改善不同條件下的峰形。
結(jié)果表明,氟苯尼考在200~1000ng/ml濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好,r=0.9995;用本方法測得了氟苯尼考的最低檢出限為50ng/ml;回收率高,平均回收率為92.5%.該方法精密度高,穩(wěn)定性好,方便快捷,故適用于畜產(chǎn)品中氟苯尼考的殘留檢測。
[1]中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典一部[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2010:159-160.
[2]陳曉慧,劉明春,焦陽.氟苯尼考的研究新進(jìn)展及其應(yīng)用[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2006,10(4):51.
[3]張鳳清,王巖松,范世華,等.高效液相色譜法測定動(dòng)物肌肉組織中氯霉素、甲風(fēng)霉素和氟苯尼考?xì)埩袅浚跩].食品科學(xué),2010,31(8):248-251.
[4]張立軍,江瑞,奇敏,等.高效液相色譜法檢測肉中氟苯尼考?xì)埩簦跩].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2007,17(3):438-439.
[5]郭霞,張素霞,沈建忠,等.與牛肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留的高效液相色譜檢測[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2006,36(9):743-747.
瑪爾江·木坎(1963-),女,大學(xué)本科,高級(jí)獸醫(yī)師,從事抗生素檢驗(yàn)、飼料及畜產(chǎn)品安全檢測。