瑪爾江·木坎 艾里米熱·達(dá)吾爾夏提

（新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，新疆烏魯木齊 830063）

高效液相色譜法測(cè)定畜產(chǎn)品中氟苯尼考的方法研究

瑪爾江·木坎 艾里米熱·達(dá)吾爾夏提

（新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，新疆烏魯木齊 830063）

對(duì)高效液相色譜法測(cè)定畜產(chǎn)品中氟苯尼考的提取溶劑和條件、凈化試劑和步驟等預(yù)處理方法和色譜操作條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了牛肉中氟苯尼考?xì)埩舻姆治龇椒?。采用乙酸乙酯提取牛肉中的氟苯尼考?xì)埩?，?jīng)正己烷脫脂和用流動(dòng)相定容，Waters Xterra . ms C18柱分離，紫外波長(zhǎng)224 nm下定量測(cè)定。方法的最低檢出限濃度為50ng/kg，線性范圍200～1000ng/kg，回歸系數(shù)r=0.9995，RSD ＜1.5%，平均回收率90.06%。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便快捷，精密度和回收率高，適用于肉制品中氟苯尼考?xì)埩魴z測(cè)的要求。

氟苯尼考 高效液相色譜 畜產(chǎn)品

氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)F）又名氟甲砜霉素，是甲砜霉素的單氟衍生物，學(xué)名稱(chēng)D（+）-蘇-1-對(duì)甲砜基苯基-2-二氯乙?；?3-氟丙醇，是由美國(guó)先靈-保雅公司于20世紀(jì)80年代末研制開(kāi)發(fā)的一種新型動(dòng)物專(zhuān)用氯霉素類(lèi)廣譜抗生素。

本研究欲在已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)高效液相色譜法測(cè)定牛肉中氟苯尼考的預(yù)處理方法進(jìn)行優(yōu)化，旨在建立一種簡(jiǎn)單、快速、可靠的提取凈化方法，且方法的檢出限和精密度能滿足國(guó)內(nèi)外進(jìn)出口食品安全檢測(cè)的要求。與同類(lèi)方法相比高效液相色譜法具有高效、快速、穩(wěn)定、可靠、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、線性關(guān)系好、精密度高以及不受其他雜質(zhì)的干擾等優(yōu)點(diǎn)。

樣品中的氟苯尼考在堿性條件下，用乙酸乙酯提取，提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干，殘?jiān)运芙?，?jīng)正己烷溶液分配脫脂。用正己烷脫脂，液相色譜儀檢測(cè)氟苯尼考峰面積定量。

1 材料與試劑

安捷倫1200系列高效液相色譜儀；渦旋振蕩器；高速離心機(jī)，轉(zhuǎn)速≥10000r/min；分析天平（XS105）感量0.0001mg；氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，含量99.3%，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

乙腈（色譜純）；冰醋酸（分析純）；乙酸乙酯（分析純）；氨水（分析純）；無(wú)水硫酸鈉（分析純使用前650℃烘干4h）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters Xterra.ms C18柱（150mm×4.6mm×5μm）色譜柱，流動(dòng)相為（乙腈：水：冰醋酸=100：197：3）；檢測(cè)波長(zhǎng)224nm，流速：1.0ml/min，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：10μl。

2.2 對(duì)照品配制及樣品處理

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取氟苯尼考對(duì)照品10.07mg至10ml容量瓶?jī)?nèi)，加流動(dòng)相溶解并定容至刻度，制成氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)液（1000μg/ml）置于冰箱（-18℃）保存。

2.2.2 樣品的提取

稱(chēng)取（2.00g±0.01g）試料，置于聚丙烯離心管中，加入25ml乙酸乙酯，0.75ml氨水，3g無(wú)水硫酸鈉，均漿提取30s，10000r/ min離心3min，上清液轉(zhuǎn)移至50ml比容量瓶中，另取一支50ml離心管加入20ml乙酸乙酯，0.60ml氨水，洗滌均漿刀頭10s，洗滌液移入第一支離心管中，用玻璃棒攪動(dòng)殘?jiān)?，渦旋振蕩提取1min，超聲波振蕩提取5min，在10000r/min轉(zhuǎn)速下離心3min，上清液合并至50ml容量瓶中，再用乙酸乙酯定容至50.0ml。搖勻后移取10.0ml乙酸乙酯提取液于150ml雞心瓶中，45℃減壓旋轉(zhuǎn)濃縮至干。

2.2.3 樣品的凈化

雞心瓶中的殘?jiān)?.00ml超純水溶解，渦旋振蕩混勻，超聲5min，加入3ml正己烷渦旋振蕩混合30s，靜置分層，棄掉上層的正己烷，再加3ml正己烷渦旋震蕩混合器30s，靜置分層，移去部分下層的水相于10ml的聚丙烯離心管中，在10000r/min轉(zhuǎn)速下離心6min，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后，供高效液相色譜儀測(cè)定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性范圍

分別從（100μg/ml）氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中取20μl，40μl，60μl，80μl，100μl于10ml容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋定容至10.00ml，混勻。使標(biāo)準(zhǔn)溶液中每1ml含氟苯尼考200，400，600，800，1000ng，進(jìn)樣10μl，以氟苯尼考保留時(shí)間定性，各濃度的峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)溶液在200～1000ng/ml范圍內(nèi)，其峰面積與濃度C呈線性相關(guān)，線性方程為y=22.30x-1.89，相關(guān)系數(shù)：r=0.99951（圖1）。

表1 200～1000 ng/ml氟苯尼考標(biāo)液的峰面積

圖1 氟苯尼考的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4 最低檢出限的測(cè)定

從空白樣品中分別高濃度依次添加各濃度氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液后按步驟2.2.2和2.2.3將樣品處理好后進(jìn)行最低檢出限檢出實(shí)驗(yàn)。

當(dāng)濃度為50ng/ml時(shí)在5.533min時(shí)有氟苯尼考的峰出現(xiàn)，峰面積為3.3256；當(dāng)濃度為40ng/ml時(shí)氟苯尼考在規(guī)定的氟苯尼考出峰時(shí)間內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)氟苯尼考峰；見(jiàn)下圖2和圖3。結(jié)果表明，最低檢測(cè)濃度為50ng/ml。

圖2 濃度為50ng/ml時(shí)氟苯尼考的色譜圖

圖3 濃度為40ng/ml時(shí)氟苯尼考的色譜圖

2.5 精密度和穩(wěn)定性的測(cè)定

對(duì)同一份同樣濃度（1μg/kg）下連續(xù)進(jìn)樣十次，每次進(jìn)樣間隔為10min。記錄峰面積和出峰時(shí)間，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 1000ng/kg濃度試樣中氟苯尼考的穩(wěn)定性測(cè)定

結(jié)果表明，氟苯尼考標(biāo)液10次測(cè)定的RSD%分別為1.06%和0.01%，表明該方法的精密度良好，出峰時(shí)間穩(wěn)定。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

以不含氟苯尼考的牛肉為本底，分別添加1500ng/ml，2000ng/ ml，2500ng/ml三個(gè)濃度的氟苯尼考標(biāo)液，采用乙酸乙酯和氨水為提取溶劑，按實(shí)驗(yàn)步驟2.2.2和2.2.3進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同濃度牛肉中氟苯尼考的回收率測(cè)試結(jié)果

結(jié)果顯示：不同濃度牛肉樣中氟苯尼考的回收率在84.7%～102.3%之間，平均回收率為92.51%。

3 結(jié)果與討論

本研究的色譜條件與GB/T 22959-2008的色譜條件有較大的改進(jìn)。由于色譜柱的性質(zhì)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的含量、離子強(qiáng)度以及pH值均會(huì)對(duì)藥物殘留、溶解性能以及分離效果產(chǎn)生影響。在做此研究時(shí)的時(shí)候，我先后采取了四種方法來(lái)比較出峰情況。分別有：（1）乙腈：水=1：3；（2）乙腈：0.5%磷酸=4：1；甲醇：水=4：1和（4）乙腈：水：冰醋酸=100：197：3。甲醇和乙腈是液相色譜中最常用的兩種有機(jī)溶劑，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用乙腈為流動(dòng)相，用量較少，靈敏度略高于使用甲醇。而且甲醇-水作流動(dòng)相時(shí)其保留時(shí)間比較短，容易被雜質(zhì)峰干擾。乙腈做流動(dòng)相不僅有利于降低基線噪音而且乙腈與水配制成的流動(dòng)相會(huì)使柱壓降低，延長(zhǎng)了色譜柱的使用壽命。由于流動(dòng)相的pH值對(duì)藥物峰形有很大影響，因此通過(guò)加入冰醋酸可以緩沖pH值，改善不同條件下的峰形。

結(jié)果表明，氟苯尼考在200～1000ng/ml濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，r=0.9995；用本方法測(cè)得了氟苯尼考的最低檢出限為50ng/ml；回收率高，平均回收率為92.5%.該方法精密度高，穩(wěn)定性好，方便快捷，故適用于畜產(chǎn)品中氟苯尼考的殘留檢測(cè)。

［1］中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典一部［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010：159-160.

［2］陳曉慧，劉明春，焦陽(yáng).氟苯尼考的研究新進(jìn)展及其應(yīng)用［J］.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2006，10（4）：51.

［3］張鳳清，王巖松，范世華，等.高效液相色譜法測(cè)定動(dòng)物肌肉組織中氯霉素、甲風(fēng)霉素和氟苯尼考?xì)埩袅浚跩］.食品科學(xué)，2010，31（8）：248-251.

［4］張立軍，江瑞，奇敏，等.高效液相色譜法檢測(cè)肉中氟苯尼考?xì)埩簦跩］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17（3）：438-439.

［5］郭霞，張素霞，沈建忠，等.與牛肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留的高效液相色譜檢測(cè)［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2006，36（9）：743-747.

瑪爾江·木坎（1963-），女，大學(xué)本科，高級(jí)獸醫(yī)師，從事抗生素檢驗(yàn)、飼料及畜產(chǎn)品安全檢測(cè)。