瑪爾江·木坎 艾里米熱·達吾爾夏提

（新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，新疆烏魯木齊 830063）

高效液相色譜法測定畜產品中氟苯尼考的方法研究

瑪爾江·木坎 艾里米熱·達吾爾夏提

（新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，新疆烏魯木齊 830063）

對高效液相色譜法測定畜產品中氟苯尼考的提取溶劑和條件、凈化試劑和步驟等預處理方法和色譜操作條件進行了優(yōu)化，建立了牛肉中氟苯尼考殘留的分析方法。采用乙酸乙酯提取牛肉中的氟苯尼考殘留，經正己烷脫脂和用流動相定容，Waters Xterra . ms C18柱分離，紫外波長224 nm下定量測定。方法的最低檢出限濃度為50ng/kg，線性范圍200～1000ng/kg，回歸系數(shù)r=0.9995，RSD ＜1.5%，平均回收率90.06%。結果表明，該方法簡便快捷，精密度和回收率高，適用于肉制品中氟苯尼考殘留檢測的要求。

氟苯尼考 高效液相色譜 畜產品

氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)F）又名氟甲砜霉素，是甲砜霉素的單氟衍生物，學名稱D（+）-蘇-1-對甲砜基苯基-2-二氯乙?；?3-氟丙醇，是由美國先靈-保雅公司于20世紀80年代末研制開發(fā)的一種新型動物專用氯霉素類廣譜抗生素。

本研究欲在已有文獻的基礎上，對高效液相色譜法測定牛肉中氟苯尼考的預處理方法進行優(yōu)化，旨在建立一種簡單、快速、可靠的提取凈化方法，且方法的檢出限和精密度能滿足國內外進出口食品安全檢測的要求。與同類方法相比高效液相色譜法具有高效、快速、穩(wěn)定、可靠、操作簡便、靈敏度高、線性關系好、精密度高以及不受其他雜質的干擾等優(yōu)點。

樣品中的氟苯尼考在堿性條件下，用乙酸乙酯提取，提取液旋轉蒸發(fā)揮干，殘渣以水溶解，經正己烷溶液分配脫脂。用正己烷脫脂，液相色譜儀檢測氟苯尼考峰面積定量。

1 材料與試劑

安捷倫1200系列高效液相色譜儀；渦旋振蕩器；高速離心機，轉速≥10000r/min；分析天平（XS105）感量0.0001mg；氟苯尼考標準對照品，含量99.3%，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

乙腈（色譜純）；冰醋酸（分析純）；乙酸乙酯（分析純）；氨水（分析純）；無水硫酸鈉（分析純使用前650℃烘干4h）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Waters Xterra.ms C18柱（150mm×4.6mm×5μm）色譜柱，流動相為（乙腈：水：冰醋酸=100：197：3）；檢測波長224nm，流速：1.0ml/min，柱溫：25℃，進樣量：10μl。

2.2 對照品配制及樣品處理

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取氟苯尼考對照品10.07mg至10ml容量瓶內，加流動相溶解并定容至刻度，制成氟苯尼考標準液（1000μg/ml）置于冰箱（-18℃）保存。

2.2.2 樣品的提取

稱?。?.00g±0.01g）試料，置于聚丙烯離心管中，加入25ml乙酸乙酯，0.75ml氨水，3g無水硫酸鈉，均漿提取30s，10000r/ min離心3min，上清液轉移至50ml比容量瓶中，另取一支50ml離心管加入20ml乙酸乙酯，0.60ml氨水，洗滌均漿刀頭10s，洗滌液移入第一支離心管中，用玻璃棒攪動殘渣，渦旋振蕩提取1min，超聲波振蕩提取5min，在10000r/min轉速下離心3min，上清液合并至50ml容量瓶中，再用乙酸乙酯定容至50.0ml。搖勻后移取10.0ml乙酸乙酯提取液于150ml雞心瓶中，45℃減壓旋轉濃縮至干。

2.2.3 樣品的凈化

雞心瓶中的殘渣用2.00ml超純水溶解，渦旋振蕩混勻，超聲5min，加入3ml正己烷渦旋振蕩混合30s，靜置分層，棄掉上層的正己烷，再加3ml正己烷渦旋震蕩混合器30s，靜置分層，移去部分下層的水相于10ml的聚丙烯離心管中，在10000r/min轉速下離心6min，經0.22μm濾膜過濾后，供高效液相色譜儀測定。

2.3 標準曲線的制備及線性范圍

分別從（100μg/ml）氟苯尼考標準儲備液中取20μl，40μl，60μl，80μl，100μl于10ml容量瓶中，用流動相稀釋定容至10.00ml，混勻。使標準溶液中每1ml含氟苯尼考200，400，600，800，1000ng，進樣10μl，以氟苯尼考保留時間定性，各濃度的峰面積繪制標準曲線，結果見表1。結果表明，氟苯尼考標準溶液在200～1000ng/ml范圍內，其峰面積與濃度C呈線性相關，線性方程為y=22.30x-1.89，相關系數(shù)：r=0.99951（圖1）。

表1 200～1000 ng/ml氟苯尼考標液的峰面積

圖1 氟苯尼考的標準曲線圖

2.4 最低檢出限的測定

從空白樣品中分別高濃度依次添加各濃度氟苯尼考標準儲備液后按步驟2.2.2和2.2.3將樣品處理好后進行最低檢出限檢出實驗。

當濃度為50ng/ml時在5.533min時有氟苯尼考的峰出現(xiàn)，峰面積為3.3256；當濃度為40ng/ml時氟苯尼考在規(guī)定的氟苯尼考出峰時間內沒有出現(xiàn)氟苯尼考峰；見下圖2和圖3。結果表明，最低檢測濃度為50ng/ml。

圖2 濃度為50ng/ml時氟苯尼考的色譜圖

圖3 濃度為40ng/ml時氟苯尼考的色譜圖

2.5 精密度和穩(wěn)定性的測定

對同一份同樣濃度（1μg/kg）下連續(xù)進樣十次，每次進樣間隔為10min。記錄峰面積和出峰時間，計算相對標準偏差，結果見表2。

表2 1000ng/kg濃度試樣中氟苯尼考的穩(wěn)定性測定

結果表明，氟苯尼考標液10次測定的RSD%分別為1.06%和0.01%，表明該方法的精密度良好，出峰時間穩(wěn)定。

2.6 回收率實驗

以不含氟苯尼考的牛肉為本底，分別添加1500ng/ml，2000ng/ ml，2500ng/ml三個濃度的氟苯尼考標液，采用乙酸乙酯和氨水為提取溶劑，按實驗步驟2.2.2和2.2.3進行回收率實驗，結果見表3。

表3 不同濃度牛肉中氟苯尼考的回收率測試結果

結果顯示：不同濃度牛肉樣中氟苯尼考的回收率在84.7%～102.3%之間，平均回收率為92.51%。

3 結果與討論

本研究的色譜條件與GB/T 22959-2008的色譜條件有較大的改進。由于色譜柱的性質，流動相中有機溶劑的含量、離子強度以及pH值均會對藥物殘留、溶解性能以及分離效果產生影響。在做此研究時的時候，我先后采取了四種方法來比較出峰情況。分別有：（1）乙腈：水=1：3；（2）乙腈：0.5%磷酸=4：1；甲醇：水=4：1和（4）乙腈：水：冰醋酸=100：197：3。甲醇和乙腈是液相色譜中最常用的兩種有機溶劑，實驗發(fā)現(xiàn)，采用乙腈為流動相，用量較少，靈敏度略高于使用甲醇。而且甲醇-水作流動相時其保留時間比較短，容易被雜質峰干擾。乙腈做流動相不僅有利于降低基線噪音而且乙腈與水配制成的流動相會使柱壓降低，延長了色譜柱的使用壽命。由于流動相的pH值對藥物峰形有很大影響，因此通過加入冰醋酸可以緩沖pH值，改善不同條件下的峰形。

結果表明，氟苯尼考在200～1000ng/ml濃度范圍內的線性關系良好，r=0.9995；用本方法測得了氟苯尼考的最低檢出限為50ng/ml；回收率高，平均回收率為92.5%.該方法精密度高，穩(wěn)定性好，方便快捷，故適用于畜產品中氟苯尼考的殘留檢測。

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瑪爾江·木坎（1963-），女，大學本科，高級獸醫(yī)師，從事抗生素檢驗、飼料及畜產品安全檢測。