向 導(dǎo)

（湖南省湘西自治州動物疫病預(yù)防控制中心，湖南吉首 416000）

家畜布魯氏菌病的實驗室檢查方法

向 導(dǎo)

（湖南省湘西自治州動物疫病預(yù)防控制中心，湖南吉首 416000）

近年來，布魯氏菌病的發(fā)生形勢嚴(yán)峻，為了掌握湘西州現(xiàn)階段布魯氏菌病疫源和疫病流行規(guī)律，及時發(fā)現(xiàn)疫情隱患，有針對性地開展布魯氏菌病預(yù)防控制工作。對轄區(qū)內(nèi)牛、羊開展抽樣檢測。本次試驗對湘西州的681份樣品進行檢測。首先，用虎紅平板凝集試驗進行初篩，檢出可疑樣品再用試管凝集試驗檢測。

布魯氏菌病 虎紅平板凝集試驗 試管凝集試驗

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人、畜共患傳染病。在家畜中，牛、羊、豬最常發(fā)生，且可由牛、羊、豬傳染人和其他家畜。其特征是生殖器官和胎膜發(fā)炎，引起流產(chǎn)、不育和各種組織的局部病灶。本病廣泛分布于世界各地，我國目前在人、畜間仍有發(fā)生，給畜牧業(yè)和人類的健康帶來嚴(yán)重危害。在對布魯氏菌病診斷中，流行病學(xué)資料，流產(chǎn)、胎兒胎衣的病理損害，胎衣滯留以及不育等都有助于布魯氏菌病的診斷，但確診只有通過實驗室診斷才能得出結(jié)果?？煞譃椴≡瓕W(xué)檢測方法和血清學(xué)檢測方法。其中病原學(xué)檢測方法分為顯微鏡檢查、病原分離鑒定、分子生物學(xué)檢測，血清學(xué)檢測方法分為虎紅平板凝集試驗、全乳環(huán)狀試驗、試管凝集試驗、補體結(jié)合試驗、ELISA試驗。我國目前檢測布魯氏菌病常用的方法是虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗，本次試驗用的是以上兩種方法對湘西州681份樣品進行了檢測。現(xiàn)將試驗結(jié)果分析如下：

1 材料與方法

1.1 材料

待檢樣品采集于湘西州各縣市的規(guī)模養(yǎng)殖場的5月齡以上的羊和8月齡以上的牛樣品，其中牛樣品291份，羊樣品391份，待檢樣品存放于-20 ℃。

1.2 診斷試劑

布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗抗原、陽性血清和試管凝集試驗抗原、血清由湖南省動物疫病預(yù)防控制中心提供，生產(chǎn)廠家是青島易幫生物，虎紅平板凝集試驗抗原批號是20120726、陽性血清批號是20120726，試管凝集試驗抗原批號是20120726、陽性血清批號是20120504。

1.3 實驗方法

1.3.1 準(zhǔn)備工作

（1）血樣采集和血清的制備：將牛、羊保定好采用頸靜脈采血，血樣采好后，用記號筆在離心管上標(biāo)記好編號，一頭牛、羊樣品一個編號，采好后的血樣放置一晚，第二天再離心，析出血清效果好。離心后的血清樣品進行檢測，檢測后需保存的血清樣品放入-20℃保存。

（2）做虎紅平板凝集試驗需準(zhǔn)備的有：潔凈的玻璃板，在玻璃板上用記號筆畫好大概4cm2的方格。

（3）試管凝集試驗的準(zhǔn)備：稀釋液：0.5%石炭酸生理鹽水，檢驗羊血清時用0.5%石炭酸的10%鹽溶液。凝集試驗管、試管架、溫箱、移液器等。

1.3.2 實驗室檢查方法

（1）虎紅平板凝集試驗方法：在玻璃板上各格標(biāo)記受檢血清號，然后用移液槍加相應(yīng)血清0.03ml，再在受檢血清旁滴加抗原0.03ml，用吸管或牙簽類小棒攪動血清和抗原使之均勻混合。再雙手拿起玻璃板稍微來回輕晃數(shù)次，在室溫下4分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。每次試驗還需設(shè)陽性對照、陰性對照。在陽性、陰性對照成立的條件下，受檢血清在4分鐘內(nèi)呈現(xiàn)肉眼可見不同程度的顆粒狀或絮狀的凝集現(xiàn)象可判為陽性，完全不凝集呈均勻粉紅色的判為陰性。

（2）試管凝集試驗方法：本試驗按照＜＜動物布魯氏菌病診斷技術(shù)規(guī)程GB/T18646——2002＞＞進行，羊和牛的受檢血清稀釋方法基本一致，差異是第一管加的稀釋液和受檢血清的量有所不同?，F(xiàn)以羊為例，第一只管標(biāo)記好編號用移液槍加1.15ml；第2～4管加0.5ml稀釋液；然后用吸管吸取受檢血清0.1ml，加入第一管內(nèi)，并混合均勻。充分混勻后吸取該管混合液0.25ml棄去；再取0.5ml合液加入第二管混合均勻，再取第二管混合液0.5ml加至第三管混勻，如此倍比稀釋至第四管，從第四管棄去混勻液0.5ml。稀釋完畢，從第一至第四管的血清稀釋度分別為1：12.5、1：25、1：50、1：100。然后將0.5ml的20倍稀釋的抗原加入各管中，并振搖均勻。羊的血清稀釋度為1：25、1：50、1：100、1：200；牛的稀釋度為1：50、1：100、1：200、1：400。置37-40℃度溫箱24小時，再取出檢查并記錄結(jié)果。每次試驗應(yīng)做比濁管和陽性、陰性、抗原對照。

陽性、陰性對照稀釋和加抗原的方法與受檢血清相同，做抗原對照的目的是觀察抗原是否有自凝現(xiàn)象。每次試驗需配比濁管，作為判定凝集反應(yīng)程度的依據(jù)。

（3）結(jié)果判定：如果試管底部出現(xiàn)點狀或圓盤狀沉淀，則不需要比較清亮度，如果試管底部出現(xiàn)倒傘狀沉淀，則需要比濁管比較液體清亮度。牛1：100血清稀釋，羊1：50血清稀釋出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時，受檢血清判定為陽性。牛1：50血清稀釋，羊1：25血清稀釋出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時，受檢血清判定為可疑反應(yīng)。

2 實驗結(jié)果

通過用虎紅平板凝集試驗對681份牛羊血清樣品進行檢測 ，其中羊血清樣品中檢測出13份出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，用試管凝集試驗檢測出8份陽性。

表1 虎紅平板凝集試驗檢驗結(jié)果（單位：份）

表2 試管凝集試驗檢測結(jié)果（單位：份）

3 討論分析

布魯氏菌病來勢兇猛，并呈擴大蔓延的趨勢，有必要進行布魯氏菌病的長期監(jiān)測。布魯氏菌病的分離受實驗室條件的限制，很難開展分離工作。因此，對血清抗體的檢測是一種簡便易行具有良好的敏感性和特異性的方法。從實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，虎紅平板凝集試驗（RBPT）檢測羊布魯氏菌病，681頭共檢測出陽性13份，而用試管凝集試驗（SAT）則檢測出陽性8份，從試驗結(jié)果可以看出RBPT檢測血清樣品存在假陽性。RBPT敏感性高，特異性低，說明RBPT可用于樣品的初步檢疫的篩選，因RBPT方法簡便易行，成本低廉所以檢測該方法適用于布魯氏菌病的大面積檢疫和流行病學(xué)的調(diào)查。

SAT是我國檢測布魯氏菌病診斷的法定方法。是一種比較經(jīng)典的布魯氏菌病的檢測方法，它可以定性，也可以定量。因而在判定反應(yīng)強度上比RBPT更精確。SAT檢測Igm敏感性較高，可作為布魯氏菌病的早期診斷，同時可用于人畜布魯氏菌菌苗免疫后的機體最早期血清學(xué)抗體的檢測，此法優(yōu)點是判定容易，具有較高的診斷價值。但不能區(qū)分人工免疫和自然感染，而且部分感染的動物抗體滴度達不到檢測水平，因而造成漏診和誤診。

RBPT在使用的時候操作方便，快捷，適用于大規(guī)模的篩選檢疫，但易出現(xiàn)假陽性。SAT特異性高，比較準(zhǔn)確，但操作費時、費力，不適用于大規(guī)模的檢疫。在實際操作過程中，采用這兩種方法，互補優(yōu)劣。先用RBPT篩選，陽性樣品再用SAT檢測做出比較準(zhǔn)確的判斷。通過上述兩種方法，檢測出陽性畜。說明湘西某養(yǎng)羊場確實存在布魯氏菌病的感染，進一步做好檢疫、淘汰、凈化。近年又出現(xiàn)ELISA這種新的檢測方法，本試驗較傳統(tǒng)的SAT試驗敏感性要高許多。這將可能作為標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法進一步推廣。

［1］馮元璋.血清學(xué)技術(shù)在布病診斷上的應(yīng)用研究現(xiàn)狀及評價［J］.仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，1997，10（1）：79-87.

［2］呂燕，顧春燕.平板凝集反應(yīng)和試管凝集反應(yīng)相結(jié)合檢測布魯氏桿菌?。跩］.內(nèi)蒙古畜牧科學(xué)，2002，（4）：29.

［3］徐百萬.動物疫病監(jiān)測技術(shù)手冊［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010.

［4］朱作鋒.2004動物防疫新技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程與管理法規(guī)手冊［M］.北京：光明日報出版社，2004.