趙 莉柯 浩步志高鮑恩東*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095；2.中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所國家重點實驗室生物技術(shù)六室，黑龍江哈爾濱 150001；3.丹阡市農(nóng)業(yè)委員會，江蘇丹阡 212300）

抗雞lgMμ鏈單克隆抗體的制備及生物學(xué)特性鑒定

趙 莉1，2，3柯 浩1步志高2鮑恩東1*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095；2.中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所國家重點實驗室生物技術(shù)六室，黑龍江哈爾濱 150001；3.丹阡市農(nóng)業(yè)委員會，江蘇丹阡 212300）

以原核表達(dá)雞IgM μ鏈蛋白免疫BALB/c小鼠，取3次免疫后的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)ELISA篩選克隆，獲得2株分泌抗雞IgM μ鏈單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株（1H2、1D10）。這2株雜交瘤細(xì)胞株連續(xù)傳代4個月，并經(jīng)液氮凍存5個月后復(fù)蘇培養(yǎng)，仍能穩(wěn)定地分泌特異性McAb。1H2、1D10腹水ELISA效價分別為1：106、1：107，亞類鑒定均為IgG1κ型。間接ELISA檢測顯示，這兩株單抗均與雞血清中的天然IgM發(fā)生特異性反應(yīng)，可用于雞血清中IgM的快速檢測，對于各種傳染病的早期診斷具有重要意義。

原核表達(dá)雞IgM μ鏈蛋白 單克隆抗體 雞血中的天然IgM

IgM是機體初次體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的免疫球蛋白，其在血清中的含量會在首次接觸抗原的幾天內(nèi)達(dá)到高峰，然后通過免疫球蛋白類轉(zhuǎn)換作用轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG而使其含量逐漸下降［1-2］。由于記憶B細(xì)胞并不大量分泌IgM，所以IgM的升高預(yù)示近期機體內(nèi)有抗原出現(xiàn)。因此IgM在動物疾病的早期診斷方面發(fā)揮著重要作用。由于目前各類傳染病危害嚴(yán)重，迫切需要一種有效的早期診斷試劑進(jìn)行快速診斷以控制病情，淘汰感染畜禽，減少損失。為此，本試驗利用原核表達(dá)雞IgM μ鏈蛋白免疫BALB/c小鼠，以期獲得能夠穩(wěn)定分泌抗雞IgM μ鏈單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb）的雜交瘤細(xì)胞株，為進(jìn)一步建立快速靈敏的抗雞IgM μ鏈診斷試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 6周齡健康雌性的BALB/c小鼠 購自北京維通利華實驗動物公司。

1.1.2 細(xì)胞株和免疫原 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株和大腸桿菌表達(dá)的雞IgMμ鏈蛋白 均由中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所生物技術(shù)六室提供。

1.1.3 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基購自GiBco公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、PEG4000、HT、HAT、酶標(biāo)二抗均購自Sigma公司；IgG抗體亞類試劑盒購自Southern Biotech公司；Hyclone血清購自Hyclone公司；Toyopearl HW-55凝膠層析柱填料購自北京惠德易科技有限責(zé)任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物免疫 選取6只健康雌性的BALB/c小鼠，以雞IgM μ鏈蛋白免疫4次。免疫方式為腹腔和后腿肌肉注射，免疫劑量為10 μg/只，免疫間隔為3周，初次免疫用弗氏完全佐劑乳化抗原，第2、3次免疫用弗氏不完全佐劑乳化抗原，第4次直接腹腔注射加強免疫，3d后取脾進(jìn)行細(xì)胞融合［3］。

1.2.2 飼養(yǎng)細(xì)胞制備 融合前一天，取8周齡健康BALB/c小鼠一只，拉頸處死，75%酒精中浸泡5 min后，將10 ml不完全1640培養(yǎng)液無菌注入小鼠腹腔，輕揉2 min，然后吸出已含腹腔巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)液，1000 rpm /min離心10 min；棄上清，用HAT培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個細(xì)胞/ml；加至96孔板（100 μl/孔），置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞制備 用不完全1640培養(yǎng)液收集處于對數(shù)生長期的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，1000 rpm/min離心10 min；棄上清，用不完全1640培養(yǎng)液懸浮沉淀，計數(shù)備用。

1.2.4 免疫鼠脾細(xì)胞的制備 取免疫小鼠一只，摘眼球采血并處死；無菌取脾，去除脂肪和被膜，在不完全1640培養(yǎng)液中用剪刀剪碎，200目銅網(wǎng)過濾，收集脾細(xì)胞，1000 rpm/min離心10 min；棄上清，用不完全1640培養(yǎng)液懸浮沉淀，計數(shù)備用。

1.2.5 細(xì)胞融合 按常規(guī)方法［4］進(jìn)行。將SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：5的比例混勻于融合管中，1000 rpm/min離心10 min；棄上清，輕拍融合管底部，使兩種細(xì)胞均勻分散；在1 min內(nèi)加入1 ml 37℃預(yù)熱的融合劑，隨即由慢到快加入20 ml不完全1640培養(yǎng)液終止融合反應(yīng)，室溫靜置20 min；1000 rpm/min離心10 min；棄上清，用HAT培養(yǎng)液輕輕懸浮，加至鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中（100 μl/孔），置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.6 陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選及McAb化 采用常規(guī)飽和硫酸銨鹽析法從雞血清中獲得IgM粗提制品，再用Toyopearl HW-55凝膠層析柱分離純化［5-6］，以純化的天然IgM作為包被抗原，間接ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清，篩選抗體分泌陽性的雜交瘤細(xì)胞。陽性孔采用有限稀釋法連續(xù)進(jìn)行亞克隆篩選，直至克隆細(xì)胞生長孔均為陽性為止。選取McAb陽性孔，擴增培養(yǎng)，液氮中凍存。

1.2.7 McAb抗體的亞型鑒定 按試劑盒操作說明，利用間接ELISA法，以雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗，分別以酶標(biāo)抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA以及酶標(biāo)抗κ、λ為二抗進(jìn)行亞型鑒定。

1.2.8 腹水制備及效價測定 將0.5 ml無菌弗氏不完全佐劑注射到10周齡雌性BALB/c小鼠腹腔；一周后再注入1.5×106個雜交瘤細(xì)胞；7～10 d后，當(dāng)小鼠腹部明顯膨脹時抽取腹水，1500 rpm /min離心10 min，除去沉淀和表面脂肪層，收集上清，分裝，-20℃保存。同時利用間接ELISA法測定其效價，以P/N≥2.1 時McAb的最高稀釋倍數(shù)為此McAb的效價。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細(xì)胞的選育

試驗結(jié)果顯示，細(xì)胞融合率達(dá)90%左右。采用間接ELISA法檢測有細(xì)胞克隆生長的培養(yǎng)孔，獲得6株陽性雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)有限稀釋法連續(xù)3次亞克隆，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清陽性率達(dá)100%時，得到了2株雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)體外連續(xù)培養(yǎng)數(shù)代，其分泌抗體的能力不變，分別命名為1H2、1D10。

2.2 雞血清中IgM的純化

凝膠層析柱洗脫曲線和SDS-PAGE電泳顯示，雞血清中的IgM和IgG已得到較好分離，提純的IgM達(dá)到了較高的純度（圖1、圖2）。

圖1 雞血清中免疫球蛋白的洗脫曲線

圖3 間接ELISA檢測單抗腹水效價

2.3 雜交瘤細(xì)胞分泌McAb穩(wěn)定性測定2株雜交瘤細(xì)胞經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)4個月及液氮凍存5個月后復(fù)蘇培養(yǎng)，用間接ELISA法檢測培養(yǎng)上清，OD490nm值沒有明顯變化，表明這2株雜交瘤細(xì)胞株能非常穩(wěn)定地分泌特異性McAb。

2.4 McAb效價測定

間接ELISA檢測方法顯示，1H2、1D10腹水抗體效價分別為1：1×106和1：1×107（圖3）；亞型鑒定結(jié)果表明，McAb 1H2、1D10均為IgG1κ亞型。

3 討論

IgM重鏈恒定區(qū)在種間是高度保守的，而且在恒定區(qū)還具有同種型決定簇。本試驗采用原核表達(dá)技術(shù)，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)雞IgM μ鏈蛋白，并以其作為免疫原制備McAb，打破了從血清中純化IgM制備McAb的常規(guī)方法。結(jié)果證明該方法同樣行之有效。而且本試驗制備的抗雞IgM μ鏈McAb可以通過Protein G 親和層析純化，將提純后的McAb進(jìn)行HRP標(biāo)記［7］，可以為進(jìn)一步的研究簡化步驟。

一般雞群均接種過菌（疫）苗，而常規(guī)血清學(xué)診斷檢測的抗體都為IgG，因此只有當(dāng)所測的抗體滴度高于疫苗接種產(chǎn)生的抗體滴度時才能作出診斷。而抗雞IgM μ鏈McAb可以作為免疫診斷試劑通過雙夾心ELISA檢測病原微生物特異性的IgM，為傳染性疾病的早期快速診斷提供了新且簡便的途徑。抗雞IgM μ鏈McAb還可以用于檢測組織部位中含有IgM的細(xì)胞以及對外周血中具有IgM表面抗原受體的細(xì)胞進(jìn)行定量，并且可以通過與B細(xì)胞膜表面抗原結(jié)合，在體內(nèi)外從分子水平上研究B細(xì)胞抗原提呈特點，從而為顯著降低疫苗接種劑量、提高機體免疫能力等方面的探索提供了新的實驗手段。

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趙莉（1982-），女，江蘇泰州人，碩士生，獸醫(yī)師。

鮑恩東