李強(qiáng)，黃麗杰（河南省食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心/鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州450000）

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定保健品中雌二醇和黃體酮的含量

李強(qiáng)，黃麗杰△
（河南省食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心/鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州450000）

目的建立測(cè)定某品牌減肥參茶（樣品1）、某品牌排毒養(yǎng)顏口服液（樣品2）中非法添加雌二醇和黃體酮含量的方法。方法采用Agilent C18柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），以乙腈-水（70∶30）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm；柱溫30℃。結(jié)果雌二醇在5.7～57.2 μg/mL時(shí)線(xiàn)性關(guān)系良好（r=0.999 5），黃體酮在0.57～22.70 μg/mL時(shí)線(xiàn)性關(guān)系良好（r=0.999 6）；雌二醇和黃體酮的平均加樣回收率（n=6）分別為98.51%、99.37%。樣本1中雌二醇、黃體酮含量分別為47.32、166.85 μg/g；樣品2中雌二醇、黃體醇含量分別為54.71、392.56 μg/g。結(jié)論高效液相色譜方法簡(jiǎn)便、快速，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為保健品中雌二醇和黃體酮含量測(cè)定的方法。

色譜法，高壓液相；雌二醇；孕酮；營(yíng)養(yǎng)保健品

激素是具有高度生物活性的物質(zhì)，在極低的濃度下就可起作用[1]。雌激素主要由卵巢和胎盤(pán)產(chǎn)生，除了防治疾病，還用以豐乳、美容、治療痤瘡等[2]。雌二醇常用于治療女性性功能疾病、更年期綜合征等[3]。黃體酮是由卵巢黃體分泌的一種天然孕激素，在體內(nèi)對(duì)雌激素激發(fā)過(guò)的子宮內(nèi)膜有顯著形態(tài)學(xué)影響[4]，主要用于月經(jīng)失調(diào)，如閉經(jīng)和功能性子宮出血及絕經(jīng)后的激素替代治療等[5-6]。該類(lèi)藥物若使用不當(dāng)，可能引起內(nèi)分泌失調(diào)、肝功能改變、膽結(jié)石等不良反應(yīng)[7]。

保健品是保健食品的通俗說(shuō)法，保健品是食品中的一個(gè)種類(lèi)，其具有一般食品的共性，能調(diào)節(jié)人體功能，改善人體健康，適用于特定人群食用，但卻不以治療疾病為目的。保健品的保健作用在當(dāng)今社會(huì)中正在逐步被廣大群眾所接受，樣品種類(lèi)越來(lái)越多，銷(xiāo)售市場(chǎng)越來(lái)越擴(kuò)大化，由此也突顯了關(guān)于保健品的各種問(wèn)題。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)各種條件的摸索研究，最終確定了同時(shí)測(cè)定保健品中雌二醇和黃體酮含量的方法，該方法簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定，可為雌二醇和黃體酮的含量測(cè)定提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器Agilent 1260型高效液相色譜儀（DAD檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫有限公司）；XS205DU型電子天平（梅特勒-托利多公司）；元素型1820C摩爾純水機(jī)（上海摩勒科學(xué)儀器有限公司）；FN202-2型電熱干燥箱（長(zhǎng)沙儀器儀表廠）；HWS型水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；HH-6型恒溫水浴鍋（江蘇金壇市宏華儀器廠）。

1.1.2藥材與試劑雌二醇對(duì)照品（批號(hào)：100182-201205）；黃體酮對(duì)照品（批號(hào)：100027-201209）；某品牌減肥參茶（樣品1）；某品牌排毒養(yǎng)顏口服液（樣品2）；甲醇、乙腈均為色譜純[月旭科技（上海）股份有限公司]；水為娃哈哈純凈水。

1.2方法

1.2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱Agilent C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-水（70∶30）等梯度洗脫，流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2提取工藝的考察

1.2.2.1不同提取方法的考察精密稱(chēng)取樣品1約1 g，精密加入乙腈20 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，分別采用超聲和回流提取2種方法進(jìn)行考察。超聲條件：時(shí)間30 min，功率40 kHz，溫度30℃?；亓鳁l件：時(shí)間1.5 h，溫度65℃，冷卻至室溫，稱(chēng)定質(zhì)量，加乙腈補(bǔ)足損失質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)后注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，計(jì)算雌二醇和黃體酮的含量。結(jié)果顯示，超聲提取的雌二醇和黃體酮的含量與回流提取的含量相差不大，考慮回流提取條件復(fù)雜且用時(shí)較長(zhǎng)，超聲提取簡(jiǎn)便、快速，故選擇回流提取。

1.2.2.2提取溶劑的考察精密稱(chēng)取5份樣品1各1 g，分別精密加入甲醇、80%甲醇、乙醇、80%乙醇、乙腈50 mL，超聲提取30 min，冷卻至室溫，用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足損失的質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。結(jié)果顯示，乙腈提取后所得的雌二醇和黃體酮含量較其他提取液所得的含量高，周?chē)s峰較少，且色譜峰分離度好，因此選擇乙腈作為提取溶劑。

1.2.2.3提取時(shí)間的考察精密稱(chēng)取5份樣品1各1 g，各精密加入乙腈20 mL。超聲提取，時(shí)間分別為0.10、0.25、0.50、1.00、1.50 h，冷卻至室溫，用乙腈補(bǔ)足損失質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)后注入高效液相色譜儀中，計(jì)算峰面積。結(jié)果顯示，隨著提取時(shí)間的增加，銀鍛苷提取率逐漸升高，但在0.5 h后增加緩慢，故最終選擇0.5 h為提取時(shí)間。

1.2.2.4提取次數(shù)的考察精密稱(chēng)取5份樣品1各1g，各精密加入乙腈20 mL。重復(fù)超聲提取3次，每次0.5h，冷卻至室溫，用乙腈補(bǔ)足損失質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液適量，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)后注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積。結(jié)果顯示，隨著提取次數(shù)的增加，雌二醇和黃體酮提取率逐漸升高但變化不大，綜合考慮最終確定提取次數(shù)為1次。

1.2.2.5不同提取溶劑體積的考察精密稱(chēng)取5份樣品1各1 g，各精密加入乙腈10、15、20、25、30 mL。超聲提取0.5 h，冷卻至室溫，用乙腈補(bǔ)足損失質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液適量，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。結(jié)果顯示，隨著溶劑體積的增加，雌二醇和黃體酮提取率逐漸升高，但升高緩慢。故最終確定20 mL為最佳提取溶劑體積。

1.2.3溶液的制備

1.2.3.1對(duì)照品溶液的制備分別精密稱(chēng)取雌二醇和黃體酮適量，加乙腈稀釋并定容至100mL量瓶中，搖勻，制成濃度分別為0.11 mg/mL的黃體酮對(duì)照品溶液和0.11 mg/mL的雌二醇對(duì)照品溶液。

1.2.3.2供試品溶液的制備取一次使用量的供試品，加乙腈20 mL超聲提取30 min，取出，放置室溫，加乙腈定容至25 mL的容量瓶中，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4方法學(xué)考察

1.2.4.1線(xiàn)性試驗(yàn)精密量取1.2.3.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液適量，加乙腈制成雌二醇質(zhì)量濃度為57.2、28.6、22.9、17.1、11.4、5.7 μg/mL；以及黃體酮質(zhì)量濃度為0.57、1.10、5.70、10.40、17.10、22.70 μg/mL的一系列混合溶液，搖勻，即得。按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.4.2精密度試驗(yàn)精密吸取1.2.3.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液（雌二醇22.9 μg/mL、黃體酮5.70 μg/mL）10 μL，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，計(jì)算雌二醇和黃體酮的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批樣品，按1.2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h下進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.4.4重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品，按1.2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算雌二醇和黃體酮的RSD。

1.2.4.5最低檢測(cè)限將雌二醇和黃體酮對(duì)照品的儲(chǔ)備液進(jìn)行一系列的倍比稀釋?zhuān)缓筮M(jìn)行測(cè)定。當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL，信噪比（S/N）=3時(shí)，雌二醇的最低檢測(cè)濃度為0.01 μg/mL，黃體酮的最低檢測(cè)濃度為0.05 μg/mL。

1.2.4.6加樣回收率試驗(yàn)取6份已知含量的樣品1各2 g，分別精密加入1.2.3.1項(xiàng)下的雌二醇、黃體酮對(duì)照品溶液適量，按1.2.3.2項(xiàng)下制備供試品溶液，取10μL注入液相色譜儀，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算回收率。

1.2.5含量測(cè)定取樣品1、樣品2的一次使用量，按1.2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中雌二醇、黃體酮的含量。

2　結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性雌二醇和黃體酮的理論塔板數(shù)均不低于3000，分離度均大于1.5，拖尾因子0.95～1.05，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1　色譜圖

2.2線(xiàn)性范圍雌二醇的回歸方程為Y=19.539X-1.597 4（r=0.999 5），黃體酮的回歸方程為Y=15.994X+ 0.904 9（r=0.999 6）。結(jié)果表明，雌二醇的進(jìn)樣濃度在5.7～57.2 μg/mL時(shí)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，黃體酮的進(jìn)樣濃度在0.57～22.70 μg/mL時(shí)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3精密度試驗(yàn)雌二醇的RSD為0.40%，黃體酮的RSD為0.77%。表明儀器精密度良好。

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)雌二醇的RSD為0.60%，黃體酮的RSD為0.69%。表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)雌二醇的RSD為0.37%，黃體酮的RSD為1.19%。表明該試驗(yàn)重復(fù)可行。

2.6加樣回收率試驗(yàn)雌二醇的RSD為1.51%，黃體酮的RSD為1.10%。表明該方法的準(zhǔn)確度良好。見(jiàn)表1。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.7含量測(cè)定樣品1中雌二醇、黃體酮含量分別為47.32、166.85 μg/g；樣品2中雌二醇、黃體酮含量分別為54.71、392.56 μg/g。

3　討論

3.1波長(zhǎng)的選擇參考文獻(xiàn)[8-9]雌二醇的含量測(cè)定方法，雌二醇的最大吸收波長(zhǎng)在205 nm附近，另外在225、280nm附近也有吸收，黃體酮的最大吸收波長(zhǎng)處在230nm，故最終選擇最佳波長(zhǎng)為225 nm。

3.2流動(dòng)相的選擇參考文獻(xiàn)[10-12]考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水等流動(dòng)相，結(jié)果顯示，乙腈-水作為流動(dòng)相，雌二醇和黃體酮出峰時(shí)間均較為合適，且峰形好，基線(xiàn)平穩(wěn)，故最終確定使用乙腈-水作為流動(dòng)相。對(duì)乙腈-水作為流動(dòng)相，考察了不同比例的乙腈-水作為流動(dòng)相，雌二醇和黃體酮的出峰時(shí)間、峰面積大小、峰形尖銳與否、分離度大小等因素，結(jié)果顯示，以乙腈-水（70∶30）為流動(dòng)相各項(xiàng)指標(biāo)都能達(dá)到滿(mǎn)意效果，故最終決定以乙腈-水（70∶30）作為流動(dòng)相。

3.3柱溫的選擇考察了不同柱溫（20、25、30、35、40℃）對(duì)雌二醇和黃體酮分離效果的影響，結(jié)果顯示柱溫在30℃時(shí)，雌二醇和黃體酮的分離效果均較好。

綜上所述，本試驗(yàn)旨在為保健品質(zhì)量檢測(cè)提供參考，為改善人們的生活質(zhì)量，提供安全可靠的保健品。在我國(guó)化妝品規(guī)范2007年版中規(guī)定，化妝品中禁止添加性激素，其中就包括雌二醇和黃體酮。市面上某些保健品為見(jiàn)效快，也會(huì)添加如雌二醇和黃體酮等雌激素。由于目前保健品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未規(guī)范，因此在利益驅(qū)使下市場(chǎng)投機(jī)之舉頻頻出現(xiàn)。而隨著保健品越來(lái)越被人們所認(rèn)可，對(duì)保健品質(zhì)量的控制和規(guī)范亟須解決。尤其是隨著人口老齡化程度的加深，與健康相關(guān)的用藥問(wèn)題尚處于注意盲區(qū)，老年人未經(jīng)醫(yī)生或藥師指導(dǎo)，自行盲目使用保健品的現(xiàn)象尤為廣泛。這不但影響老年人的健康，還可能延誤對(duì)疾病的診斷和治療。而且近幾年，針對(duì)不同人群的特定保健品也日益增多，從嬰幼兒到老年人，幾乎覆蓋了各個(gè)年齡段，因此，在選擇保健品時(shí)應(yīng)尤為慎重。為規(guī)范保健品的生產(chǎn)、流通、使用，保健品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的早日制定、市場(chǎng)的規(guī)范運(yùn)營(yíng)等，均需要繼續(xù)努力改進(jìn)和完善力，只有做到合理、規(guī)范、完善，才能切實(shí)保護(hù)廣大人民的身體健康。

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Simultaneous determination of estradiol and progesterone contents in health care products by HPLC

Li Qiang，Huang Lijie△
（Henan Provincial Food and Drug Evaluation and Inspection Center/Zhengzhou Municipal Institute for Food and Drug Control，Zhengzhou 450000，China）

Objective To establish a method for the determination of estradiol and progesterone contents illegally added in some brand ginseng tea reducing weight（sample 1）and some brand Paidu Yangyan oral liquid（sample 2）.Methods The chromatographic Agilent C18column（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）was adopted with acetonitrile-water（70∶30）as the mobile phase；the flow rate was 1.0 mL/min，the detection wavelength was 225 nm and the column temperature was 30℃.Results Estradiol in the range of 5.7～57.2 μg/mLhadgoodlinearity（r=0.9995），progesterone inthe range of 0.57～22.70 μg/mL had good linearity（r=0.999 6）；the average recovery rates（n=6）of estradiol and progesterone were 98.51%and 99.37%respectively.The contents of estradiol and progesterone in the sample 1 were 47.32，166.85 μg/g respectively and which in the sample 2 were 54.71，392.56 μg/g respectively.Conclusion This HPLC method is simple and quick with good repeatability and accurate detection results，and can be used as the determination method of estradiol and progesterone contents in the health care products.

Chromatography，high pressure liquid；Estradiol；Progesterone；Dietary supplements

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.21.011

A

1009-5519（2016）21-3292-03

李強(qiáng)（1984-），碩士研究生，主要從事食品藥品審評(píng)查驗(yàn)工作。

△，E-mail：H20160314@126.com。

（2016-04-27

2016-06-01）