劉智俊，龍學穎，劉慧，廖華之

（1.南華大學附屬第一醫(yī)院放射科，湖南衡陽421001；2.中南大學湘雅醫(yī)院放射科，湖南長沙410008）

全肝CT灌注成像評估兔肝VX2瘤有效灌注及與不成對動脈的相關(guān)性*

劉智俊1，龍學穎2△，劉慧2，廖華之1

（1.南華大學附屬第一醫(yī)院放射科，湖南衡陽421001；2.中南大學湘雅醫(yī)院放射科，湖南長沙410008）

目的分析兔VX2肝腫瘤模型的全肝CT灌注成像灌注參數(shù)與不成對動脈（UAs）的相關(guān)性，為探討腫瘤血管生成狀況及與灌注成像表現(xiàn)的本質(zhì)聯(lián)系提供依據(jù)。方法采用健康清潔級新西蘭大白兔55只，其中假手術(shù)對照組5只，剔除經(jīng)解剖和病理證實為未成功手術(shù)成瘤的，最終實驗組動物為42只。術(shù)后2周獲得兔VX2肝腫瘤邊緣、瘤周肝及假手術(shù)組的肝臟灌注血流量（BF）、肝臟灌注血容量（BV）、肝動脈灌注量（ALP）、門靜脈灌注量（PVP）、肝動脈灌注指數(shù)（HPI）等參數(shù)值，并于檢查后通過免疫組織化學染色獲得腫瘤標本的UAs值。結(jié)果實驗組VX2瘤邊緣BF、BV、ALP、PVP、HPI與實驗組瘤周肝比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；實驗組瘤周肝各灌注成像參數(shù)值與假手術(shù)對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。BF、BV、ALP、HPI與UAs呈正相關(guān)（r=0.475、0.434、0.635、0.323，P＜0.05或0.01），PVP與UAs呈負相關(guān)（r=-0.365，P＜0.05）。其中以ALP與UAs的相關(guān)系數(shù)最高（r=0.635，P<0.01）。結(jié)論全肝CT灌注可定量評估兔肝VX2瘤的肝動脈和門靜脈灌注信息，并可在一定程度上反映腫瘤血管生成狀況。

肝腫瘤，實驗性；動脈；免疫組織化學；體層攝影術(shù)，X線計算機；血液灌注；新生血管化，病理性；兔

腫瘤血管生成是腫瘤發(fā)生發(fā)展的標志和關(guān)鍵進程[1]。因此，準確評價腫瘤的血管生成與腫瘤微循環(huán)狀況是進行腫瘤評估的重要內(nèi)容。而肝腫瘤血管生成的主要來源為腫瘤自身的新生血管生成和肝竇的毛細血管化[2]。目前以CT灌注成像為代表的全臟器容積灌注成像可無創(chuàng)傷性定量評估腫瘤的微循環(huán)狀況，其潛在意義不僅可以輔助判斷血管成熟度及預(yù)測抗血管生成療效，而且有望幫助聯(lián)合治療策略的選擇及監(jiān)測靶向治療療效。但目前探討灌注參數(shù)與腫瘤血管成熟度有關(guān)的研究不多。故本實驗擬采用兔VX2肝腫瘤模型研究全肝CT灌注成像與腫瘤血管生成之間的本質(zhì)聯(lián)系，對于探討肝腫瘤血管生成的基礎(chǔ)及CT灌注成像在體評估價值有一定的作用，也將為今后肝腫瘤血管生成的在體影像學評估提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物采用健康清潔級新西蘭大白兔55只，體質(zhì)量（2.50±0.25）kg，由中南大學湘雅三醫(yī)院動物實驗中心提供。隨機選5只作為假手術(shù)對照組，剔除經(jīng)解剖和病理證實為未成功手術(shù)成瘤的，最終實驗組動物為42只。

1.2方法

1.2.1實驗組動物建模采用開腹法[3]制作兔肝VX2瘤動物模型并對已行手術(shù)的實驗兔雙側(cè)耳朵內(nèi)側(cè)進行逐一編號。

1.2.2雙源CT檢查于術(shù)后2周對已建模的實驗組兔及假手術(shù)對照組兔全身麻醉后，行全肝CT灌注成像[西門子雙源64層螺旋CT（somatom definition syngo CT 2010A），配置有相應(yīng)后處理工作站syngo mulimodality workplace]。先掃出定位圖像，同時調(diào)整好對比劑用量為1 mL/kg，生理鹽水為5 mL，對比劑注射采用美國雙筒高壓注射器（mallinckrodt optivantage TM），注射速率為1 mL/s（對比劑注射方法參考相關(guān)文獻[4]進行選擇）。確保掃描野包含整個肝臟（膈頂至肝下緣）后，團注對比劑并采用雙源螺旋CT容積搖籃床式掃描方法，即無縫連續(xù)動態(tài)往復(fù)掃描模式，掃描參數(shù)為：延遲時間6 s后機器開始掃描，總掃描時間為61 s，球管每周旋轉(zhuǎn)時間0.33 s，管電壓80 kV，管電流50mAs，探測器寬度48mm，螺距1.0mm；圖像重建層厚為1.5mm，層間距為1.5 mm，重建矩陣為512×512，卷積核值為B30f。每次雙源螺旋CT掃描灌注成像共計生成完整原始數(shù)據(jù)30組，每組31幅圖像，將其全部輸入西門子雙源螺旋CT后處理工作站中。

1.2.3圖像后處理根據(jù)CT應(yīng)用中的VPCT Body灌注軟件中的肝臟灌注應(yīng)用模塊，然后結(jié)合文獻[5-6]的報道及軟件操作說明，將腹主動脈定義為輸入動脈，門靜脈定義為輸入靜脈，按步驟計算得出肝臟灌注血流量（BF）、肝臟灌注血容量（BV）、肝動脈灌注量（ALP）、門靜脈灌注量（PVP）、肝動脈灌注指數(shù)（HPI）等雙源螺旋CT灌注彩色數(shù)據(jù)圖像。在增強動脈期上腫瘤實質(zhì)達強化峰值時選取腫瘤周邊較明顯強化的區(qū)域，在其區(qū)域內(nèi)定義感興趣區(qū)（ROI）[4]，以避開腫瘤壞死區(qū)及周圍鄰近正常肝組織，并測量3次相同大小的ROI，通過計算機自動計算得出三組灌注參數(shù)值并取其平均值，以減少取樣誤差；瘤周肝區(qū)域的ROI為CT增強及灌注上尚未出現(xiàn)明顯的形態(tài)學改變，并病理證實無轉(zhuǎn)移[5]，ROI大小同前，同樣測量3次，并得出三組灌注參數(shù)值，然后取其平均值；最后以腫瘤邊緣區(qū)及相應(yīng)瘤周肝的各灌注參數(shù)平均值作為結(jié)果記錄。somatom definition syngo CT 2010A的VPCT Body灌注軟件對各參數(shù)的計算方法采用的是斜率法[6]。

1.2.4定量不成對動脈（UAs）腫瘤的ROI選擇將參考標本剖面所見情況，并在周邊明顯強化的區(qū)域選取“熱點”，以避開中心壞死區(qū)，用來評估腫瘤的新生血管。VX2腫瘤內(nèi)新生細動脈，即UAs，定義為腫瘤實質(zhì)內(nèi)α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）染色陽性的血管，且不伴有明顯的纖維組織或門靜脈及膽管，并且滿足α-SMA染色陽性的膜厚度與最小的管腔外徑的比值大于1/10，以排除靜脈。具體方法參照文獻[7-8]進行，先在低倍鏡（40×）下觀察整個切片，尋找腫瘤內(nèi)新生血管最多處，即“熱點”，然后在高倍鏡（200×）下計數(shù)，記錄5個視野內(nèi)UAs的總數(shù)。

1.3統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行分析處理，數(shù)值變量數(shù)據(jù)均以±s表示。兔肝VX2瘤邊緣與腫瘤周邊肝組織的CT灌注參數(shù)值之間的差異采用兩配對樣本t檢驗，實驗組腫瘤周肝與假手術(shù)對照組肝灌注參數(shù)的差異采用兩樣本t檢驗；VX2腫瘤的全肝CT灌注各參數(shù)值與UAs的相關(guān)性采用Pearson積差相關(guān)系數(shù)相關(guān)法來分析[9]。以假設(shè)檢驗水準α=0.05（雙側(cè)），所有統(tǒng)計結(jié)果均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1免疫組織化學法檢測結(jié)果42只荷瘤兔腫瘤的UAs為（47.05±7.51）個，見圖1a～b。

圖1　α-SMA染色結(jié)果（200×）

表1　兔肝VX2瘤邊緣、瘤周肝及假手術(shù)對照組全肝CT灌注參數(shù)比較（±s）

表1　兔肝VX2瘤邊緣、瘤周肝及假手術(shù)對照組全肝CT灌注參數(shù)比較（±s）

注：實驗組瘤邊緣為兔肝VX2腫瘤周邊的參數(shù)值，實驗組瘤周肝為瘤周肝組織的參數(shù)值，假手術(shù)對照組肝為未種植腫瘤的假手術(shù)相應(yīng)部位正常肝組織的參數(shù)值。與實驗組瘤周肝比較，aP＜0.05；與假手術(shù)對照組比較，bP<0.05，cP>0.05。

組別BF [mL/（100 mL·min）] n BV（mL/100 mL）ALP [mL/（100 mL·min）] PVP [mL/（100 mL·min）] HPI（%）實驗組瘤邊緣實驗組瘤周肝假手術(shù)對照組42 42 5 243.98±73.43ab206.92±74.07c204.54±2.74 24.36±7.43ab20.67±7.71c19.62±2.03 65.43±9.46ab42.43±7.77c40.43±1.45 14.43±2.31ab121.95±9.53c119.39±5.39 81.97±3.12ab15.66±0.29c25.30±0.37

2.2VX2瘤邊緣、瘤周肝及假手術(shù)對照組全肝CT灌注成像參數(shù)值比較實驗組VX2瘤邊緣BF、BV、ALP、PVP、HPI與實驗組瘤周肝及假手術(shù)對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；實驗組瘤周肝各灌注成像參數(shù)值與假手術(shù)對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1、圖2a～f。

圖2　VX2瘤動脈期增強圖及灌注彩圖

2.3VX2瘤邊緣全肝CT灌注成像定量參數(shù)值與UAs的相關(guān)性BF、BV、ALP、HPI與UAs呈正相關(guān)（r=0.475、0.434、0.635、0.323，P＜0.05或0.01），PVP與UAs呈負相關(guān)（r=-0.365，P＜0.05）。其中以ALP與UAs的相關(guān)系數(shù)最高（r=0.635，P<0.01）。見表2。

表2　VX2瘤邊緣全肝CT灌注成像參數(shù)值與UAs相關(guān)性

3　討論

VX2瘤兔肝接種成瘤因建模簡便易行、成功率高、周期短、腫瘤生長增殖活躍、腫瘤血管生成豐富，成為原位肝腫瘤研究的常用腫瘤模型之一[5，10]。在應(yīng)用該模型上，一部分研究因該模型肝腫瘤對比增強影像學上增強早期強化明顯而類似肝細胞癌（HCC），認為其為富血供肝腫瘤[1，4]，而另有學者因該腫瘤在穩(wěn)定成瘤后的典型強化方式為環(huán)形強化而類似肝轉(zhuǎn)移瘤，推測其為乏血供腫瘤[11]。存在的這種分歧提示，對兔肝VX2瘤影像學上發(fā)現(xiàn)的血供特點仍然需要從腫瘤血管生成的層面進行更深入的分析。本實驗研究結(jié)果表明，瘤周肝組織與假手術(shù)對照組肝組織各灌注參數(shù)差異無明顯統(tǒng)計學意義，提示開腹假種瘤手術(shù)本身并未對背景肝臟的灌注狀態(tài)產(chǎn)生顯著影響，腫瘤區(qū)域的血流動力學應(yīng)主要歸因于腫瘤所致。實驗組腫瘤邊緣的灌注參數(shù)與瘤周肝、假手術(shù)對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明邊緣有活力的腫瘤區(qū)域的相關(guān)血流動力學發(fā)生了顯著變化。本實驗研究結(jié)果與其他類似研究的結(jié)果相符，其中，腫瘤邊緣的BF、BV增高的主要原因可能是由于腫瘤新生血管的形成，使腫瘤邊緣區(qū)域的血管數(shù)量較周邊正常肝組織增加；此外，腫瘤血管形態(tài)不同于正常的肝組織血管，腫瘤血管通常粗細不均并有較多異常分支，其內(nèi)皮細胞基底膜不完整致腫瘤血管滲透性增加等。上述原因造成大量對比劑進入腫瘤內(nèi)，從而導(dǎo)致腫瘤的BF和BV增加[12]。而腫瘤邊緣PVP較瘤周肝及假手術(shù)對照組顯著降低，ALP、HPI較明顯高于瘤周肝及假手術(shù)對照組，其主要原因可能是在腫瘤內(nèi)的動脈與門脈之間的血供比例發(fā)生了改變，腫瘤生長壓迫肝竇致使門靜脈壓力增高，繼而使腫瘤的PVP減少；而與此同時，腫瘤可能通過肝竇的毛細血管化[13]來增加腫瘤的ALP，以代償PVP減少的部分。因此，CT灌注成像結(jié)果提示，兔肝VX2瘤仍然主要是從動脈獲得相應(yīng)的血供而不是門靜脈，其血供明顯高于鄰近肝組織，為一富血供腫瘤，從這一點看，兔肝VX2瘤與臨床上HCC血供特點有相似之處[14]。但這種血供基礎(chǔ)需要進一步從病理與免疫組織化學水平進行探討。

肝臟的組織結(jié)構(gòu)相對較為特殊，除肝動脈外，也有門靜脈、膽管、肝靜脈及其各級分支等管道存在，其中在正常肝組織內(nèi)肝動脈、門靜脈、膽管呈伴行關(guān)系，而肝靜脈則不伴行。故學者們引入UAs的概念，排除靜脈，以更好地評價肝腫瘤的血供特點[7，15]。對HCC的臨床研究[7]表明，在CT三期增強掃描上，UAs與動脈期腫瘤的強化程度呈明顯正相關(guān)；而HCC的對比劑增強超聲造影臨床研究[14]也發(fā)現(xiàn)UAs與多種超聲灌注參數(shù)值，包括最大強度值（IMAX）、上升時間（RT）、達峰值時間（TTP）、平均通過時間（mTT）、上升斜率（RS）、廓清時間（WT）均有相關(guān)性。本實驗得到的VX2瘤CT灌注成像定量參數(shù)與UAs的相關(guān)性分析結(jié)果表明，UAs與BF、BV、ALP、HPI均呈正相關(guān)性，其中以與ALP的相關(guān)系數(shù)最高，而與PVP呈弱負相關(guān)。因此，研究結(jié)果提示，全肝CT灌注參數(shù)BF、BV、ALP、HPI可在一定程度上反映UAs量的多少。而經(jīng)免疫組織化學檢查證實，本實驗發(fā)現(xiàn)兔VX2肝腫瘤內(nèi)有豐富的UAs，BF、BV、ALP、HPI與UAs呈正相關(guān)，可以推測腫瘤內(nèi)有功能的新生細血管仍然是其動脈血供增加的重要病理基礎(chǔ)之一，這與Himeno等[15]報道肝癌內(nèi)的新生腫瘤細動脈有可能是肝癌血管造影的具有顯著動脈血供的病理基礎(chǔ)相似。盡管α-SMA染色陽性的UAs計數(shù)主要反映血管的成熟度，但這種新生細血管畢竟不同于正常血管，仍然可能未完全被周細胞覆蓋，其內(nèi)皮細胞基底膜不完整，從而使血管的滲透性增加；此外，血管直徑粗細不一，并有較多的異常分支、吻合支及動靜脈瘺形成也可能是重要原因之一。UAs另一重要作用在于其排除了門靜脈血流的影響，故UAs與PVP呈負相關(guān)，更從免疫組織化學水平說明了兔VX2肝腫瘤供血主要是肝動脈供血而非門靜脈。

綜上表明，兔肝VX2瘤的腫瘤血管生成復(fù)雜，全肝CT灌注參數(shù)可定量評估兔肝VX2瘤的肝動脈和門靜脈灌注信息，并可在一定程度上反映其腫瘤血管生成狀況。

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Total liver CT perfusion imaging for assessing correlation between rabbit liver VX2 tumor effective perfusion and unpaired arteries*

Liu Zhijun1，Long Xueying2△，Liu Hui2，Liao Huazhi1
（1.Department of Radiology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，University of South China，Hengyang，Hunan 421001，China；2.Department of Radiology，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410008，China）

Objective To analyze the correlation between the parameters of total liver CT perfusion imaging in rabbit VX2 liver tumor model and unpaired arteries（UAs）to provide a basis for the intrinsic contact between the tumor angiogenesis status and perfusion imaging manifestations.Methods Fifty-five healthy clean class New Zealand while rabbits were adopted.A-mong them，5 cases were in the sham operation control group，those were removed due to un-succeeded operative tumor formation verified by anatomy and pathology，and 42 cases were finally the experimental animals.The parameters of blood flow（BF），blood volume（BV），arterial liver perfusion（ALP），portal liver perfusion（PVP）and hepatic perfusion index（HPI）of the tumor rim，surrounding liver tissue and sham-operated group were obtained at postoperative 2 weeks.After the examination，the UAs values of tumor specimens were obtained by immunohistochemical staining.Results BF，BV，ALP，PVP and HPI had statistically significant differences between the tumor rim and the paracancerous liver tissue（P<0.05），but which had no statistically significant difference between the paracancerous liver tissues in the experimental group and the sham operation group（P>0.05）.BF，BV，ALP and HPI had positive correlation with UAs（r=0.475，0.434，0.635，0.323，P<0.05 or 0.01），PVP had negative correlation with UAs（r=-0.365，P<0.05）.Among them，ALP had the highest correlation coefficient with UAs（r=0.635，P<0.01）.Conclusion Total liver CT perfusion can quantitatively evaluate the liver artery and portal vein perfusion information of the rabbit liver VX2 tumor，and can reflect the status of tumor angiogenesis to some extent.

Liver neoplasms，experimental；Arteries；Immunohistochemistry；Tomography，X-ray computed；Hemoperfusion；Neovascularization，pathologic；Rabbit

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.21.002

A

1009-5519（2016）21-3263-04

國家自然科學基金資助項目（30800266）。

劉智?。?986-），碩士研究生，主要從事腹部疾病影像診斷的相關(guān)研究。

△，E-mail：280413177@qq.com。

（2016-08-11）