謝元媚 張秋實 陳 鈺

廣東省第二人民醫(yī)院婦科，廣州510317

宮頸鱗狀細胞癌中DNA損傷修復基因NBS1的表達與增殖、凋亡的相關性分析

謝元媚 張秋實▲陳 鈺

廣東省第二人民醫(yī)院婦科，廣州510317

目的研究宮頸鱗狀細胞癌中DNA損傷修復基因NBS1表達與增殖、凋亡的相關性。方法選擇2012年5月～2015年12月在廣東省第二人民醫(yī)院婦科接受活檢的宮頸鱗狀細胞癌患者78例作為病理組，宮頸良性病變患者60例作為對照組。收集兩組患者的宮頸組織后提取RNA并反轉錄為cDNA，采用熒光定量PCR法檢測NBS1以及Ki67、Cyc1inD1、p27kip1、p57kip2、Fas、FasL、ActD、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的mRNA相對含量。分析各增殖、凋亡相關基因與NBS1 mRNA含量的相關性。結果病理組宮頸組織中NBS1 mRNA相對含量顯著高于對照組［（252.5±33.6）比（100.0±14.1），t=14.292、P＜0.05］；病理組宮頸組織中Ki67［（246.4±39.5）比（100.0±12.8）、Cyc1inD1［（203.4±31.8）比（100.0±15.1）］的mRNA相對含量顯著高于對照組且與NBS1 mRNA相對含量呈正相關（r=0.761、0.683，均P＜0.05）；p27kip1［（46.5±7.9）比（100.0±13.8）］、p57kip2［（41.3±5.8）比（100.0±14.2）］、Fas［（35.9±6.8）比（100.0±12.7）］、FasL［（44.1±5.5）比（100.0±14.1）］、ActD［（26.8±3.6）比（100.0±16.7）］、Caspase-3［（38.1± 5.8）比（100.0±15.5）］、Caspase-8［（24.2±4.5）比（100.0±11.9）］、Caspase-9［（56.1±7.9）比（100.0±14.6）］的mRNA相對含量顯著低于對照組且與NBS1 mRNA的相對含量呈負相關（r=-0.614、-0.705、-0.662、-0.592、-0.783，均P＜0.05）。結論宮頸鱗狀細胞癌中DNA損傷修復基因NBS1的表達量異常升高且與增殖、凋亡相關基因的改變有關。

宮頸鱗狀細胞癌；NBS1；增殖；凋亡

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在女性患者中的發(fā)病率僅次于乳腺癌，細胞增殖過度以及凋亡不足是疾病發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)。DNA損傷修復基因NBS1定位于染色體8q21、全長50 kb，所編碼的蛋白含有754個氨基酸序列并能夠與MRE11及Rad50形成復合體，參與DNA復制和修復、細胞周期調控、端粒穩(wěn)定性調控等過程［1-2］。近些年，越來越多的研究認識到NBS1基因突變、多態(tài)性改變以及表達改變與結直腸癌、腎癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生有關［3-5］。由此可以推測，NBS1表達的變化可能與宮頸鱗狀細胞癌的發(fā)生有關，但目前相關的研究仍極為少見。本研究分析了宮頸鱗狀細胞癌中DNA損傷修復基因NBS1表達與增殖、凋亡的相關性。

1 對象與方法

1.1 對象

選擇2012年5月～2015年12月在廣東省第二人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）接受宮頸組織病理學活檢且確診為宮頸鱗狀細胞癌的78例患者作為病理組，年齡（51.5±6.8）歲、體重指數(shù)（22.5±4.1）kg/m2，所有患者均為首次確診，既往未接受過放化療，排除遠處轉移及合并嚴重肝腎功能不全的患者。選擇同期在我院接受宮頸組織病理學活檢且確診為宮頸良性病變的60例患者作為對照組，年齡（52.2±7.1）歲、體重指數(shù)（23.1±4.5）kg/m2。兩組患者年齡、體重指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標本采集病理組和對照組患者均在宮頸組織病理學活檢時取適量宮頸組織，用生理鹽水清洗2～3遍，吸盡水分后放置在凍存管中，在液氮中迅速冷凍30 min，取出后保存在-70℃超低溫冰箱中。

1.2.2 基因表達檢測取宮頸組織，采用購自天根生化科技（北京）有限公司的動物組織總RNA提取試劑盒（DP431）分離得到組織樣本中的RNA，而后采用TIANScriptⅡRT試劑盒（KR107）將RNA反轉錄為cDNA，最后將cDNA樣本以1∶5的比例稀釋并采用Rea1Master Mix（SYBR Green）（FP202）進行PCR反應，反應體系如下：稀釋后的cDNA樣本2 μL、Rea1 Master Mix 10 μL、10 μmo1/L的上下游引物各0.8 μL、去離子水6.4 μL。反應條件如下：95℃預變性3 min，而后95℃15 s，引物特異性退火溫度20 s，72℃20 s并重復40個循環(huán)。所擴增的基因包括Ki67、Cyc1inD1、p27kip1、p57kip2、Fas、FasL、ActD、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9。根據(jù)軟件讀取各個樣本擴增后的Ct值，以GAPDH為內參照并按照2-△△Ct計算各個基因的mRNA含量，以對照組樣本mRNA含量的平均值為100，計算各個樣本mRNA含量的相對值。

1.3 統(tǒng)計學方法

SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 宮頸組織中NBS1 mRNA相對含量

病理組宮頸組織中NBS1 mRNA相對含量為（252.5±33.6），對照組宮頸組織中NBS1 mRNA的相對含量為（100.0±14.1）。病理組宮頸組織中NBS1 mRNA的相對含量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（t= 14.292、P＜0.05）。

2.2 增殖相關基因的mRNA相對含量

病理組宮頸組織中Ki67、Cyc1inD1的mRNA相對含量顯著高于對照組，p27kip1、p57kip2的mRNA相對含量顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組宮頸組織中增殖相關基因的mRNA相對含量比較（）

表1 兩組宮頸組織中增殖相關基因的mRNA相對含量比較（）

組別例數(shù)Ki67Cyc1inD1p27kip1p57kip2病理組對照組t值P值78 60 246.4±39.5 100.0±12.8 15.822＜0.05 203.4±31.8 100.0±15.1 11.049＜0.05 46.5±7.9 100.0±13.8 12.585＜0.05 41.3±5.8 100.0±14.2 13.357＜0.05

2.3 凋亡相關基因的mRNA相對含量

病理組宮頸組織中Fas、FasL、ActD、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的mRNA含量顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組宮頸組織中凋亡相關基因的mRNA相對含量比較（）

表2 兩組宮頸組織中凋亡相關基因的mRNA相對含量比較（）

組別例數(shù)FasFasLActDCaspase-3Caspase-8Caspase-9病理組對照組t值P值78 60 35.9±6.8 100.0±12.7 18.393＜0.05 44.1±5.5 100.0±14.1 15.866＜0.05 26.8±3.6 100.0±16.7 22.586＜0.05 38.1±5.8 100.0±15.5 16.186＜0.05 24.2±4.5 100.0±11.9 25.686＜0.05 56.1±7.9 100.0±14.6 9.485＜0.05

2.4病理組宮頸組織中NBS1與增殖、凋亡相關基因的相關性

病理組宮頸組織中Ki67、Cyc1inD1的mRNA含量與NBS1 mRNA的含量呈正相關（P＜0.05），p27kip1、p57kip2、Fas、FasL、ActD、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的mRNA含量與NBS1 mRNA的含量呈負相關（P＜0.05）。見表3。

表3 病理組宮頸組織中增殖、凋亡相關基因與NBS1 mRNA含量的相關性

3 討論

NBS1基因表達異常與惡性腫瘤的關系受到了越來越多的關注。NBS1基因所編碼的蛋白參與NBS1-MRE11-Rad50復合體的組成。該復合體的功能是調節(jié)細胞周期以及端粒穩(wěn)定性、修復損傷DNA雙鏈、避免DNA復制過程中損傷雙鏈的積累，進而促進細胞周期的進程以及細胞的增殖［6-7］。近年來，越來越多國外學者認識到NBS1表達改變與結腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤的相關性［8-10］，目前國內關于NBS1與惡性腫瘤關系的研究仍較少。歐劍波等［11］的研究顯示，口腔鱗狀細胞癌中NBS1的表達量顯著升高且與惡性生物學行為密切相關。這就提示NBS1可能參與口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生和發(fā)展。但是，關于NBS1與宮頸癌發(fā)生的關系尚未見報道。本研究對宮頸鱗狀細胞癌組織和宮頸良性病變組織中NBS1表達量的分析結果顯示：病理組宮頸組織中NBS1 mRNA的相對含量顯著高于對照組，提示NBS1的高表達與宮頸鱗狀細胞癌的發(fā)生有關。

細胞增殖以及凋亡異常是造成惡性腫瘤重要的生物學行為，細胞的增殖和凋亡行為受到多種基因的調控。Ki67是與細胞周期進程密切相關的增殖細胞核抗原，與細胞的增殖活性直接相關［12］。細胞周期蛋白（Cyc1in）能夠與細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白（CDKI）共同參與細胞周期以及細胞增殖的精密調控［13-14］。Cyc1inD1是促進宮頸癌細胞周期進展以及細胞增殖的關鍵分子，p27kip1、p57kip2能夠抑制Cyc1inD1與CDK形成復合物并阻礙細胞周期的進程、抑制細胞增殖［15-16］。本研究對宮頸鱗狀細胞癌組織和正常宮頸組織中細胞增殖相關基因mRNA含量的分析結果顯示：病理組宮頸組織中Ki67、Cyc1inD1的mRNA含量顯著高于對照組且與NBS1 mRNA的含量呈正相關，p27kip1、p57kip2的mRNA含量顯著低于對照組，且與NBS1 mRNA的含量呈負相關，提示宮頸癌組織中NBS1的高表達與增殖相關基因的表達改變有關。

在宮頸鱗狀細胞癌的發(fā)生和發(fā)展過程中，不僅存在細胞過度增殖，同時還存在凋亡異常并造成過度增殖的細胞無法被凋亡機制所清除。線粒體通路和死亡受體通路是調節(jié)細胞凋亡的兩條主要通路，F(xiàn)as受體被認為能夠同時通過上述兩條通路參與細胞的凋亡過程［17-18］。Fas與其配體結合后能夠通過死亡受體途徑激活Caspase-8，進而活化下游的凋亡執(zhí)行分子Caspase-3［19-20］；而Fas與ActD結合后能夠影響B(tài)c1-2/ Bax的表達，并通過線粒體途徑激活Caspase-9，進而活化下游的凋亡執(zhí)行分子Caspase-3［21-22］。本研究對宮頸鱗狀細胞癌組織和宮頸良性病變組織中細胞凋亡相關基因mRNA含量的分析結果顯示：病理組宮頸組織中Fas、FasL、ActD、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的mRNA含量顯著低于對照組，且與NBS1 mRNA的含量呈負相關。提示宮頸癌組織中NBS1的高表達與凋亡相關基因的表達改變有關。

綜上所述，宮頸鱗狀細胞癌中DNA損傷修復基因NBS1的表達量異常升高且與增殖、凋亡相關基因的改變有關。

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Correlation analysis of DNA damage rePair gene NBS1 exPression and Proliferation，aPoPtosis in cervical squamous cell carcinoma

XIE YuanmeiZHANG Qiushi▲CHEN Yu
Department of Gyneco1ogy，the Guangdong No.2 Provincia1 Peop1e's Hospita1，Guangdong Province，Guangzhou 510317，China

Objective To study the corre1ation between DNA damage repair gene NBS1 expression and pro1iferation，apoptosis in cervica1 squamous ce11 carcinoma.Methods Seventy-eight patients with cervica1 squamous ce11 carcinoma received biopsy in Department of Gyneco1ogy，the No.2 Guangdong Provincia1 Peop1e's Hospita1 from May 2012 to December 2015 were enro11ed in patho1ogica1 group，60 cases of cervica1 benign 1esion patients were enro11ed in contro1 group.Cervica1 tissues of patients in two groups were co11ected and RNA was extracted and reverse transcribed into cDNA，then f1uorescence quantitative PCR method was used to measure the contents of NBS1 mRNA and Ki67，Cyc1inD1，p27kip1，p57kip2，F(xiàn)as，F(xiàn)asL，ActD，Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9；the re1ationships between those pro1iferation，apoptosis re1ated genes and content of NBS1 mRNA were ana1yzed.Results Re1ative mRNA contents of NBS1 in the cervica1 tissues of the patho1ogica1 group were significant1y higher than those in the contro1 group［（252.5± 33.6）vs（100.0±14.1），t=14.292，P＜0.05］；re1ative mRNA contents of Ki67［（246.4±39.5）vs（100.0±12.8）］，Cyc1inD1［（203.4±31.8）vs（100.0±15.1）］in cervica1 tissues of the patho1ogica1 group were significant1y higher than those in the contro1 group and positive1y corre1ated with re1ative contents of NBS1 mRNA（r=0.761，0.683，a11 P＜0.05）；re1ative mRNA contents of p27kip1［（46.5±7.9）vs（100.0±13.8）］，p57kip2［（41.3±5.8）vs（100.0±14.2）］，F(xiàn)as［（35.9±6.8）vs（100.0±12.7）］，F(xiàn)asL［（44.1±5.5）vs（100.0±14.1）］，ActD［（26.8±3.6）vs（100.0±16.7）］，Caspase-3［（38.1±5.8）vs（100.0± 15.5）］，Caspase-8［（24.2±4.5）vs（100.0±11.9）］，Caspase-9［（56.1±7.9）vs（100.0±14.6）］in cervica1 tissues of the patho1ogica1 group were significant1y 1ower than those in the contro1 group and negative1y corre1ated with re1ative contents of NBS1 mRNA（r=-0.614，-0.705，-0.662，-0.592，-0.783，a11 P＜0.05）.Conclusion The expression of NBS1 in cervica1 squamous ce11 carcinoma abnorma11y increases，which is re1ated to the changes of pro1iferation and apoptosis re1ated genes.

Cervica1 squamous ce11 carcinoma；NBS1；Pro1iferation；Apoptosis

R737.33

A

1673-7210（2016）07（c）-0038-04

2016-04-05本文編輯：任念）

廣東省公益研究與能力建設專項資金資助項目（2014A020212731）。

▲通訊作者