黃錦秀 解立杰 胡 霽

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院麻醉科，湖北武漢430077

遠端缺血預處理對兔脊髓缺血再灌注損傷后血-脊髓屏障的保護作用及相關(guān)機制研究

黃錦秀 解立杰 胡 霽

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院麻醉科，湖北武漢430077

目的探討遠端缺血預處理（RIPC）對脊髓缺血再灌注損傷（SCIRI）后血-脊髓屏障（BSCB）的保護作用及相關(guān)的調(diào)控機制。方法36只日本大耳白兔隨機均分為3組（n=12）：假手術(shù)組（S組）、缺血再灌注組（I/R組）和遠端缺血預處理組（R組）。I/R組和R組阻斷腹主動脈血流40 min，R組在腹主動脈阻斷前1 h對雙側(cè)股動脈進行2個循環(huán)的10 min缺血/10 min再灌注處理。三組動物于術(shù)后24 h進行神經(jīng)功能評價、BSCB通透性檢測、相關(guān)蛋白（c1audin-5、occ1udin、BDNF）及mRNA（BDNF）檢測。結(jié)果在SCIRI后24 h，與S組相比，I/R組神經(jīng)運動功能評分顯著降低（P＜0.01），脊髓組織EB外滲量增加（P＜0.01），緊密連接蛋白c1audin-5和occ1udin的蛋白表達量顯著下降（P＜0.01），腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）蛋白及BDNF mRNA表達輕微增加，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而R組神經(jīng)運動功能評分高于I/R組（P＜0.05），脊髓組織EB外滲量低于I/R組（P＜0.01），c1audin-5、occ1udin及BDNF（mRNA）的蛋白表達量均高于I/R組（P＜0.01）。結(jié)論RIPC可通過阻止SCIRI后脊髓組織中緊密連接蛋白c1audin-5、occ1udin表達的下降，降低BSCB通透性，維持BSCB結(jié)構(gòu)完整。同時，在BSCB結(jié)構(gòu)完整的基礎(chǔ)上，RIPC可上調(diào)脊髓組織中BDNF的表達，發(fā)揮防治SCIRI的神經(jīng)保護作用。

遠端缺血預處理；脊髓；缺血再灌注損傷；血-脊髓屏障

在臨床上，胸腹主動脈瘤修復術(shù)可導致脊髓缺血再灌注損傷（spina1 cord ischemia reperfusion injury，SCIRI），而脊髓損傷后一個災難性的、不可預知的并發(fā)癥是截癱［1］。目前，針對如何有效避免胸腹主動脈瘤修復術(shù)后SCIRI的發(fā)生，大量的臨床及實驗研究工作已經(jīng)開展，然而，截癱的發(fā)生仍不可完全避免。因此，需要探索更加有效的方法保護脊髓免受缺血再灌注損傷。

SCIRI的發(fā)生機制主要包括氧自由基介導的脂質(zhì)過氧化作用、細胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸的釋放、炎性反應及細胞凋亡等。其中，血-脊髓屏障（b1oodspina1 cord barrier，BSCB）的破壞是SCIRI的一個重要的病理改變，在SCIRI的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用［2-3］。BSCB是血液循環(huán)和脊髓組織之間的生理和代謝物質(zhì)擴散的屏障，嚴格地調(diào)控著脊髓微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，因此早期修復BSCB對于防治脊髓損傷具有十分重要的意義。研究表明，遠端缺血預處理（remote ischemic preconditioning，RIPC）可對心臟、腦、腎臟等多種器官或組織缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護作用［4］，同時，RIPC對SCIRI的保護作用也在一些動物實驗中得到了驗證［5］，然而，其內(nèi)在的保護機制仍不十分清楚。之前的研究發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白、內(nèi)源性大麻素、活性氧物質(zhì)觸發(fā)的抗氧化通路介導了RIPC對脊髓缺血的耐受［5-7］，但關(guān)于RIPC對SCIRI后BSCB的影響還未見文獻報道。因此，本研究旨在探討RIPC對SCIRI后BSCB可能的保護作用及其機制，從而進一步揭示RIPC防治SCIRI的內(nèi)在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物來源及分組

本實驗共納入36只日本大耳白兔，體重1.5～2.0 kg，雄性，購自武漢生物制品研究所（動物質(zhì)量合格證號：NO.42000400003600），按照美國國立衛(wèi)生研究院制訂的實驗室動物維護、使用指導意見和要求處理動物。每只動物都在各自單獨的籠中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度及濕度均適宜，光暗周期為12 h/12 h，可自由攝入食物和水。麻醉前，所有動物的神經(jīng)功能均完好。采用隨機數(shù)字表法將動物均分為三組，每組12只：假手術(shù)組（S組）、缺血再灌注組（I/R組）和遠端缺血預處理組（R組）。于術(shù)后24 h處死，其中6只用于BSCB通透性檢測，另外6只用于神經(jīng)功能評價及c1audin-5、occ1udin、BDNF（mRNA）蛋白檢測。

1.2 SCIRI模型的建立

經(jīng)日本大耳白兔耳緣靜脈注入3%戊巴比妥鈉1.0 mL/kg麻醉動物，取仰臥位固定，保留其自主呼吸。經(jīng)耳緣靜脈留置針輸注乳酸林格液4 mL/（kg·h），間斷靜脈注射戊巴比妥鈉維持麻醉。經(jīng)右側(cè)股動脈置管以持續(xù)監(jiān)測股動脈壓和心電圖，保持血流動力學穩(wěn)定。加熱毯維持直腸溫度為（38.5±0.5）℃。I/R組和R組采用改良的Zivin法［8］創(chuàng)建SCIRI模型：取腹部正中切口，暴露分離腹主動脈，于左腎動脈根部下方0.5 cm處，以無損傷動脈夾夾閉腹主動脈，阻斷時以股動脈壓力波形消失，遠端平均動脈壓為0 mmHg為準，40 min后開放動脈夾，開放時以股動脈壓力波形恢復為準。阻斷腹主動脈血流前5 min，經(jīng)耳緣靜脈注入肝素150 U/kg預防血栓形成。術(shù)畢肌注慶大霉素80 000 U預防感染，逐層縫合皮膚，待動物清醒后歸籠飼養(yǎng)觀察。S組僅開腹并暴露分離腹主動脈，不阻斷其血流，40 min后關(guān)腹。

1.3 R組干預方法

SCIRI模型建立前1 h，暴露分離雙側(cè)股動脈，采用無損傷動脈夾對雙側(cè)股動脈進行2個循環(huán)的10 min缺血/10 min再灌注處理。

1.4 神經(jīng)運動功能評定

所有動物由一名未參與實驗分組的課題組人員對兔后肢運動功能進行評分。評分采用改良的Tar1ov評分標準［9］：0分，后肢完全癱瘓，沒有可覺察的活動；1分，有可覺察的關(guān)節(jié)自主活動；2分，后肢可自由活動，但不能站立；3分，可站立但無法行走；4分，后肢功能完全恢復，能正常行走。

1.5 BSCB通透性檢測

通過定量和定位分析脊髓組織中伊文思藍（Evans b1ue，EB）外滲量，可評價BSCB破壞程度和部位［10］。將2%的EB經(jīng)兔耳緣靜脈緩慢勻速注射（10 mL/kg），1 h后將動物再次麻醉，經(jīng)升主動脈灌注0.9%生理鹽水500 mL/kg，取出脊髓。①酶標儀定量：取脊髓節(jié)段L4～L6一部分，稱重，浸泡在4 mL甲酰胺溶液中，60℃避光水浴抽提24 h。20 000 r/min離心20 min，取上清液，用酶標儀檢測（λ=632 nm）OD值，根據(jù)標準曲線計算出每克脊髓組織中EB含量（μg/g）。②熒光定位：取脊髓節(jié)段L4～L6一部分，置入4%多聚甲醛內(nèi)固定，1周內(nèi)沉糖。冰凍切片機上于-20℃連續(xù)切片（10 μm），在熒光顯微鏡（Nikon，日本）下觀察切片，分析BSCB完整性破壞的程度和部位。

1.6 Western blot法測相關(guān)蛋白表達

通過Western b1ot法檢測c1audin-5、occ1udin及BDNF蛋白在脊髓組織中的表達水平。取脊髓節(jié)段L4～L6一部分，勻漿后提取總蛋白，BCA定量檢測試劑盒（武漢谷歌生物，中國）測定蛋白濃度，從每個蛋白樣品中取30 μg于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，電泳完畢轉(zhuǎn)至PVDF膜，將轉(zhuǎn)好的膜于室溫下脫色搖床上用5%的脫脂牛奶封閉1 h，分別加入山羊多克隆抗c1audin-5抗體（1∶500，Santa Cruz，美國）、兔單克隆抗occ1udin抗體（1∶1000，Abcam，英國）、山羊多克隆抗BDNF抗體（1∶500，Santa Cruz，美國）4℃孵育過夜，之后二抗GAPDH（1∶10 000，武漢谷歌生物，中國）孵育30 min。采用ECL試劑顯色，曝光后顯影、定影。A1phaEase FC軟件（A1pha Innotech，美國）分析目標帶的灰度值，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值反映蛋白的表達量，并通過歸一化處理后比較各組蛋白相對表達水平。

1.7 RT-PCR法測相關(guān)mRNA表達

通過實時熒光定量法（rea1 time po1ymerase chain reaction，RT-PCR）檢測BDNF mRNA在脊髓組織中的表達水平。引物核苷酸序列由武漢谷歌生物科技有限公司合成，如下所示：BDNF：上游引物5'-CAACGAAGAAAACAATAAGGACGC-3'，下游引物5-'CGCCGGA CCCTCATAGACAT-3'；GAPDH：上游引物5'-CGCCT GGAGAAAGCTGCTA-3'，下游引物5'-ACGACCTGGTC CTCGGTGTA-3'。取脊髓節(jié)段L4～L6一部分，加Trizo1試劑（Invitrogen，美國）提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo，美國）說明書合成cDNA，于PCR儀（ABI，美國）上進行如下循環(huán)：預變性95℃，10 min，95℃15 s→60℃60 s，循環(huán)40次，溶解曲線每20 s升溫1℃，由75℃升至95℃。計算基因的表達量：根據(jù)ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt實驗-ΔCt對照，擴增倍數(shù)=2-ΔΔCt，計算目的基因與內(nèi)參基因GAPDH的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用IBM SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)運動功能評分

三組動物術(shù)后24 h的Tar1ov評分顯示，S組動物的后肢運動功能均完全正常，評分為4分；I/R組的后肢運動功能出現(xiàn)嚴重缺陷，評分顯著低于S組（P＜0.01）；與I/R組相比，R組的神經(jīng)功能評分明顯提高（P＜0.05），表明RIPC可顯著改善SCIRI后的后肢運動功能。見表1。

表1 三組動物后肢運動功能評分比較

2.2 BSCB通透性檢測

BSCB通透性通過EB染料外滲量測定，在熒光顯微鏡下顯示紅色熒光的部分即為滲出到脊髓組織中的EB染料。在術(shù)后24 h，與S組相比，I/R組EB外滲量顯著增加，而RIPC可減少SCIRI后EB外滲量（圖1A～C）。同時，脊髓組織中EB含量的定量分析顯示，I/R組EB含量［（16.61±1.02）μg/g］高于S組［（1.46±0.40）μg/g］，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而R組EB含量［（7.24±0.78）μg/g］少于I/R組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明RIPC可降低SCIRI后BSCB通透性，減輕BSCB損傷。見圖1D。

圖1 三組動物脊髓組織中的EB染料外滲量

2.3 脊髓組織中緊密連接蛋白claudin-5、occludin表達情況

術(shù)后24 h，脊髓組織中緊密連接蛋白c1audin-5和occ1udin的Western b1ot結(jié)果顯示，與S組相比，I/R組c1audin-5、occ1udin的表達顯著下降（P＜0.01），而R組的表達含量高于I/R組（P＜0.01），表明RIPC可阻止SCIRI后c1audin-5、occ1udin表達的下降，保護BSCB結(jié)構(gòu)的完整。見圖2。

2.4 脊髓組織中BDNF（mRNA）蛋白表達情況

術(shù)后24 h，脊髓組織中BDNF的Western b1ot及RT-PCR結(jié)果顯示，與S組相比，I/R組BDNF蛋白及BDNF mRNA的表達有輕微升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而R組的BDNF蛋白及BDNF mRNA表達含量顯著高于I/R組（P＜0.01）。見圖3。

圖2 脊髓組織中緊密連接蛋白claudin-5、occludin的表達情況

圖3 脊髓組織中BDNF表達情況

3 討論

RIPC是指對非靶組織或器官進行短暫的幾個循環(huán)的缺血再灌注處理可對隨后遠隔組織或器官長時間持續(xù)性的缺血損傷產(chǎn)生保護作用，由于其安全、簡便、可重復性強且價格低廉，因而應用前景廣闊。本研究結(jié)果表明，RIPC可顯著改善兔SCIRI后24 h的神經(jīng)運動功能評分，并通過增加緊密連接蛋白c1audin-5、occ1udin的表達維持BSCB結(jié)構(gòu)完整，降低BSCB通透性，同時可上調(diào)脊髓組織中BDNF的表達，從而發(fā)揮防治SCIRI的神經(jīng)保護作用。

與血腦屏障（b1ood-brain barrier，BBB）相似，BSCB的主要組成成分包括連續(xù)的毛細血管內(nèi)皮細胞及其間的緊密連接、基膜、周細胞和星形膠質(zhì)細胞終足［11］。內(nèi)皮細胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)嚴格限制血源性分子的細胞旁轉(zhuǎn)運，是維持BSCB完整性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。c1audin-5和occ1udin是兩種重要的緊密連接蛋白，研究表明，二者的表達異常與BBB/BSCB通透性異常密切相關(guān)［12-13］。在腦缺血再灌注損傷模型中，BBB的破壞及血管性水腫的形成與c1audin-5、occ1udin的表達下降密切相關(guān)［14］。同時，在SCIRI后，BSCB通透性的增加伴隨著脊髓組織中occ1udin表達的下降［15］。本研究結(jié)果顯示，與S組相比，I/R組脊髓組織EB外滲量明顯增多，緊密連接蛋白c1audin-5、occ1udin的表達水平顯著下降，而R組脊髓組織EB外滲量明顯低于I/R組，c1audin-5、occ1udin的表達水平均高于I/R組，表明RIPC可通過阻止SCIRI后c1audin-5、occ1udin表達的下降，降低BSCB通透性，保護BSCB結(jié)構(gòu)的完整。

BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要一員，在腦或脊髓的缺血再灌注損傷中發(fā)揮抗炎、抗神經(jīng)毒性、抗凋亡及促神經(jīng)元再生的神經(jīng)保護作用［16-17］。本研究結(jié)果顯示，RIPC可顯著增加SCIRI后24 h脊髓組織中BDNF表達含量，而I/R組BDNF含量僅有輕微升高，與S組相比，差異無統(tǒng)計學意義。由于神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞以及小膠質(zhì)細胞等均可在缺血缺氧時表達BDNF［18］，筆者推測，BSCB的破壞損傷這些表達BDNF的細胞，因而影響B(tài)DNF表達，減弱其對神經(jīng)的修復能力，RIPC可在保護BSCB完整性的基礎(chǔ)上，增加脊髓組織中BDNF表達，加強對神經(jīng)的修復能力。

綜上所述，RIPC可減輕SCIRI后24 h的BSCB損傷，降低其通透性，其機制與增加緊密連接蛋白c1audin-5、occ1udin的表達相關(guān)。同時，在維持BSCB完整性的基礎(chǔ)上，RIPC可上調(diào)脊髓組織中BDNF表達，加強對神經(jīng)的修復能力。

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Protective effect and mechanism of remote ischemic Preconditioning on blood-sPinal cord barrier after sPinal cord ischemia rePerfusion injury in rabbits

HUANG JinxiuXIE LijieHU Ji
Department of Anesthesio1ogy，Liyuan Hospita1 of Tongji Medica1 Co11ege of Huazhong Unversity of Science and Techno1ogy，Hubei Province，Wuhan430077，China

Objective To investigate the protective effect and possib1e mechanism of remote ischemic preconditioning（RIPC）on b1ood-spina1 cord barrier（BSCB）after spina1 cord ischemia reperfusion injury（SCIRI）.Methods 36 Japanese rabbits were random1y divided into 3 groups（n=12）：sham-operation group（group S），ischemia-reperfusion group（group I/R）andremoteischemic preconditioning group（groupR）.In group I/R and group R，rabbits weresubjected to a 40 min occ1usion of abdomina1 aorta.RIPC was achieved by bi1atera1 femora1 artery occ1usion（10 min ischemia/10 min reperfusion，2 cyc1es）1 h before abdomina1 aortic cross c1amping.A11 rabbits were sacrificed at 24 h fo11owing reperfusion and were used for the eva1uation of neuro1ogica1 function，BSCB permeabi1ity measurement，and the expression of proteins（c1audin-5，occ1udin and BDNF）and mRNA（BDNF）.Results At 24 h after SCIRI，compared to group S，the scores of neuro1ogica1 function decreased significant1y（P＜0.01），the extravasation of EB increased marked1y（P＜0.01）and spina1 cord expression of c1audin-5 and occ1udin proteins reduced（P＜0.01）in group I/R；BDNF（mRNA）protein expression increased s1ight1y，but there were no significant differences between group I/R and group S（P＞0.05）.The scores of neuro1ogica1 function were higher（P＜0.05），the extravasation of EB was 1ess（P＜0.01），and spina1 cord expression of c1audin-5，occ1udin and BDNF（mRNA）proteins were more（P＜0.01）in group R than those in group I/R. Conclusion RIPC reduces BSCB permeabi1ity and preserves BSCB integrity through inhibiting the down-regu1ation of c1audin-5 and occ1udin induced by ischemia reperfusion injury.Meanwhi1e，on the basis of maintaining BSCB structura1 integrity，RIPC can increase spina1 cord expression of BDNF and thus protect spina1 cord against ischemia reperfusion injury.

Remote ischemic preconditioning；Spina1 cord；Ischemia reperfusion injury；B1ood-spina1 cord barrier

R651.2

A

1673-7210（2016）07（c）-0033-05

2016-04-20本文編輯：程銘）

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助（2016Y XZD024）；湖北省自然科學基金面上項目（2013CFB086）。

黃錦秀（1990.1-），女，華中科技大學同濟醫(yī)學院2014級麻醉學專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：麻醉與器官保護。

胡霽（1968.12-），男，副主任醫(yī)師；研究方向：麻醉與器官保護。